用巢式聚合酶链反应在牙斑中检出幽门螺杆菌
作者：杨海涛 周殿元 张玉珍 陈村龙 智发朝 张基增
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院消化科(杨海涛 周殿元 张玉贞 陈村龙 智发朝)，分子生物学实验室(张基增)
关键词：幽门螺杆菌；基因表达调控，酶学；牙斑
中华医学杂志931230 摘要 用互补于幽门螺杆菌(HP)尿素酶A基因片段的两对引物，建立了巢式聚合酶链反应(N-PCR)检测 HP 的方法。检测1株 HP 的标准菌株-20个 HP 临床分离株均阳性，而12种常见肠道菌均阴性，特异性100%，敏感性达到可检测0.1fg细菌DNA的水平。29例行胃镜检查者，采集其牙斑和胃粘膜标本，对胃粘膜分别做细胞培养、尿素酶试验、组织学检查和N-PCR，前3种方法检查21例HP阳性，8例HP阴性，N-PCR结果与之完全一致。对牙斑进行N-PCR检测，21例胃粘膜HP阳性者中，有8例在牙斑中检出HP，而8例胃粘膜阴性者的牙斑，N-PCR均为阴性。2例病人经复方得乐治疗后，胃内HP已阴性，而牙斑HP仍为阳性。
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幽门螺杆菌(HP)是慢性胃炎和消化性溃疡的疾病因子之一。目前用于检测HP感染的常规方法有细菌培养、活检粘膜直接涂片杂色、快速尿素酶试验和组织切片染色等，但受种种因素制约，使敏感性受到一定影响。聚合酶链反应(PCR)能够检测各种标本内极微量的DNA，由于具有很高的特异性和敏感性，使检测胃以外部位或环境中存在的HP成为可能。本文用互补于HP尿素酶A基因片段的两对引物建立巢式 PCR(nested-PCR，N-PCR)的方法，对其敏感性和特异进行一系列鉴定，检测胃粘膜和牙斑标本，并进行药物治疗的初步研究。
材料和方法
一、研究对象和取材
选择因上消化道症状在本院作胃镜检查者29例，男22例，女7例，年龄30～51岁。作胃镜前用牙科刮器在患者的牙面和牙龈内取牙斑，1份放入 Eppendorf 管内，置-70℃准备行 N-PCR，另1份做尿素酶试验，其中5例进行细菌培养。用过的刮器，彻底清洗，严格消毒，以防交叉污染。随后常规胃镜检查做出诊断，在距幽门口5cm以内的部位钳取粘膜标本7块，分别进行细菌培养、尿素酶试验、组织学染色检查和N-PCR检测。对2例胃粘膜和牙斑HP均阳性的病人给予复方得乐(胶状次枸橼酸铋和甲硝唑)治疗，每次1袋，每日4次，连服4周，在停药1个月后复查牙斑和胃粘膜标本。
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二、检测HP的常规方法
1.细菌培养：取活检标本2块或牙斑标本，用接种环在 Skirrow 选择性培养基上划线分离，置 37℃微氧条件(5%O2，10%CO2，85%N2)培养3～4天，然后对培养菌进行系统的生物学鉴定[1]。
2.组织学检查：2块胃粘膜标本用10%福尔马林液固定，连续切片，Warthin-Starry银染色辨认HP；HE染色做出病理学诊断。
3.尿素酶试验：用本实验室研制的尿素酶试剂盒[2]。将1块活检粘膜或牙斑标本放放试剂中，观察试剂颜色的变化，在10分钟内试剂变为红色者为阳性，颜色不变者为阴性。
以上3种方法作为检测胃粘膜HP的参照方法，有1项或1项以上阳性者判为HP阳性，3项皆为阴性则为HP阴性。
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三、巢式PCR扩增
1.DNA抽提：29例牙斑标本用TE液(10mmol/L Tris-HCL, 1mmol/L EDTA,pH8.2)低温 10 000r/min离心洗涤 2 次，弃上清，牙斑沉淀物和胃粘膜标本用粗提法抽提DNA[3]，即向标本内加入 50μl 灭菌三蒸水，混匀后置于100℃沸水中10分钟，离心取上清行N-PCR。用生理盐水将培养菌从平皿中洗下，TE液离心洗涤2次，然后用酚-氯仿提取法抽提DNA。
2.引物选择：两对引物即巢式引物(nested-primers)选自HP尿素酶A基因片段[4，5]，一对外引物在尿素酶A基因中的碱基定位分别是86～109bp和614～637bp，扩增片段长度为552bp；一对内引物的碱基定位则分别为175～198bp和461～484bp，扩增片段长度为310bp。
3.扩增条件与产物鉴定：在50μl体积中，引物浓度各为0.4μmol/L，4种脱氧单核苷酸浓度各为0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶(英国 HT 公司产品)0.5U，模板DNA 2μl(约 1μgDNA)。94℃变性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸60秒，循环在Eppendorf 自动PCR 仪上进行。先用1对外引物行第一次扩增，循环40圈后，取其产物(552bp)lμl，用1对内引物行第二次扩增，仍为40圈，扩增产物(310bp)用7%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，HaeⅢ-φX174标准DNA分子量(美国生命技术公司)作参照。
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四、引物特异性和敏感性鉴定
PCR 对1株 HP 标准菌株 NCTC14 126 (中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所陈晶晶研究员惠赠)、20个HP临床分离株(本室常规培养分离后提取DNA保存)和以下12种常见肠道菌进行扩增：结肠弯曲菌(上海第二医科大学微生物学教研室张振华教授惠赠)；空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、大肠杆菌、雷极变形杆菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷白氏菌(均由北京生物制品鉴定所提供)
对HP分离培养株(B159)的DNA进行纯度测定(A260/A280＝1.9，吸光度A，曾称光密度OD)的定量，以连续10倍稀释法进行稀释，浓度从1μg/μl～1ag/μl，对每个浓度各行N-PCR3次。
结 果
, 百拇医药 一、N-PCR 特异性及敏感性鉴定
1株HP标准菌株和20个HP临床分离株PCR均为阳性，而12种肠道菌均阴性(附图)；在敏感性鉴定中，第二次扩增后敏感性达到可检测0.1fg(10-16g)细菌DNA水平。
二、胃粘膜及牙斑标本检测
29例胃粘膜标本，用参照方法检查，21例HP阳性，8例阴性，N-PCR的检测结果与之完全一致。21例胃粘膜HP阳性者的牙斑，有8例N-PCR阳性，而8例胃粘膜HP阴性者的牙斑，N-PCR均为阴性。29例患者的牙斑尿素酶试验均为阳性，5例牙斑进行细菌培养，均有杂菌过度生长，未见HP。
三、治疗研究
2例胃粘膜及牙斑N-PCR均为阳性的病人，治疗停药后1个月复查，用参照方法和N-PCR检测，胃粘膜HP已被根除，但牙斑N-PCR仍均为阳性(附图)。
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1.HaeⅢ-φX174标准 DNA 分子量；2.慢性胃炎病人(No38)药物治疗前牙斑HP阳性；3.该病人治疗后牙斑HP仍为阳性；4.该病人治疗前胃粘膜HP阳性；5.治疗后胃内HP被根除，N-PCR转为阴性；6.空肠弯曲菌N-PCR阴性；7.HP标准菌株(NCTC 14126)扩增产物；8.9.两株HP分离培养菌(B137,B159)扩增产物
附图 7%聚丙烯酰胺凝胶电泳示幽门螺杆菌尿素酶A基因N-PCR扩增产物。
讨 论
流行病学调查提示，HP在人群中的感染率很高，并有家庭聚集现象[6，7]，但关于其确切传染源和传播途径尚不清楚。1989年，Krajden 等[8]报道，对71例病人的胃粘膜、牙斑和唾液进行 HP 培养，结果胃粘膜29例(40.8%)阳性，牙斑1例阳性，唾液全部阴性，提出牙斑和唾液可能不是HP的重要传染源。1991年 Desai 等用尿素酶试验，对43例消化不良患者的牙斑、胃窦和胃体粘膜标本进行检测，其阳性率分别为98%、67%和70%，提出牙斑的HP数量显著高于胃内，是主要的传染源。该文中仅用尿素酶试验作为检测HP的指标，其结果的准确性值得怀疑，因为尿素酶试验剂中含有尿素和酚红，HP有尿素酶，可分解尿素，使pH值升高，当pH高于6.8时，酚红由黄色变为红色。正常新鲜唾液的pH值范围为5.6～7.0(平均值6.7)，牙斑的pH值还要高一些，单纯口腔内的pH值即足以使尿素酶试验显示阳性结果。因此，尿素酶试验用于检测牙斑标本，阳性结果并不能肯定是HP感染。但HP是人胃内唯一能够产生大量尿素酶的细菌，胃内的pH值通常小于6.0，所以尿素酶用于胃内HP感染的诊断比较可靠。我们对29例病人的牙斑做尿素酶试验，结果全部为阳性，因此单纯用尿素酶试验作为检测口腔中HP的方法是不可取的。
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我们虽在skirrow培养基中加有多粘菌素、万古霉素和两性霉素，但用于牙斑细菌培养时，仍可见多量杂菌过度生长，无法辨认HP菌落。
我们建立的N-PCR方法可检测0.1fg细菌DNA(1fg相当于1个细菌DNA[9])，比目前国外报道的最好结果(10fg)[10]还敏感100倍。经特异性鉴定，对其它细菌无扩增，特别是采用巢式引物，在第一次扩增得到552bp产物的前提下，用互补于该产物的一对内引物行第二次扩增，即得到一个更加特异的 310bp的产物，因此是一种非常理想的HP感染流行病学调查工具。我们曾用互补于HP 16SrRNA基因片段的一对引物行PCR(敏感性为10pg)检测牙斑标本，未能成功，说明口腔中的HP量少不易检出。N-PCR法的敏感性大大提高。在21例胃粘膜阳性者中，8例牙斑中也检出HP，而胃粘膜阴性者，牙斑N-PCR均阴性，说明牙斑内确实存在HP，但数量可能很少。我们结果提示，HP可通过口-口途径传播。
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本课题为国家自然科学基金资助课题
参考文献
1 杨海涛，周殿元，方国存，等.幽门弯曲菌与慢性胃炎和消化性溃疡发病学关系的研究.中华医学杂志，1988:68:366.
2 杨海涛，周殿元，项兆英.幽门螺杆菌的研究方法.见：周殿元，杨海涛，张万岱主编.幽门螺杆菌与胃十二指肠疾病.上海科学技术文献出版社，1992:460-484.
3 宋 敏，李 进，杨海涛，等.聚合酶链反应检测幽门螺杆菌.中华医学杂志，1992;72:455.
4 Clayton CL,Pallen MJ,Kleanthous H,et al.Nucleotide sequence of two genes from helicobacter pyloriencoding for urease subunits.Nucleic Acid Res,1989,18:362.
, 百拇医药
5 Wing KK, Lin H,Ferrell LD,et al.Detection of helicobacter pylori in human gastric carcinoma tissue by nested-PCR tests. Annual Meeting of American Gastroenterological Association and American Association for the Study of Liver Diseases. San Francisco,1992:10-13.
6 杨海涛，周殿元.幽门弯曲感染流行病学及致病性的研究进展.中华流行病学杂志，1990,11:251.
7 杨海涛，梁冠峰，宋 梅，等.幽门螺杆菌感染在家庭内聚集.中华消化杂志，1992,12:40 .
8 Krajden S,Fuksa M,Anderson,J,et al.Examination of human stomach biopsies,salive,and dental plaque for campylobacter pylori.J Clin Microbiol,1989,27:1397.
9 Ho SA,Heyle JA,Lewis FA,et al.Direct polymerase chain reaction test for detection of helicobacter pylori in human and animals. J Clin Microbiol 1991,29:2543.
(收稿：1992-12-22 修回：1993-09-24), 百拇医药
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院消化科(杨海涛 周殿元 张玉贞 陈村龙 智发朝)，分子生物学实验室(张基增)
关键词：幽门螺杆菌；基因表达调控，酶学；牙斑
中华医学杂志931230 摘要 用互补于幽门螺杆菌(HP)尿素酶A基因片段的两对引物，建立了巢式聚合酶链反应(N-PCR)检测 HP 的方法。检测1株 HP 的标准菌株-20个 HP 临床分离株均阳性，而12种常见肠道菌均阴性，特异性100%，敏感性达到可检测0.1fg细菌DNA的水平。29例行胃镜检查者，采集其牙斑和胃粘膜标本，对胃粘膜分别做细胞培养、尿素酶试验、组织学检查和N-PCR，前3种方法检查21例HP阳性，8例HP阴性，N-PCR结果与之完全一致。对牙斑进行N-PCR检测，21例胃粘膜HP阳性者中，有8例在牙斑中检出HP，而8例胃粘膜阴性者的牙斑，N-PCR均为阴性。2例病人经复方得乐治疗后，胃内HP已阴性，而牙斑HP仍为阳性。
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幽门螺杆菌(HP)是慢性胃炎和消化性溃疡的疾病因子之一。目前用于检测HP感染的常规方法有细菌培养、活检粘膜直接涂片杂色、快速尿素酶试验和组织切片染色等，但受种种因素制约，使敏感性受到一定影响。聚合酶链反应(PCR)能够检测各种标本内极微量的DNA，由于具有很高的特异性和敏感性，使检测胃以外部位或环境中存在的HP成为可能。本文用互补于HP尿素酶A基因片段的两对引物建立巢式 PCR(nested-PCR，N-PCR)的方法，对其敏感性和特异进行一系列鉴定，检测胃粘膜和牙斑标本，并进行药物治疗的初步研究。
材料和方法
一、研究对象和取材
选择因上消化道症状在本院作胃镜检查者29例，男22例，女7例，年龄30～51岁。作胃镜前用牙科刮器在患者的牙面和牙龈内取牙斑，1份放入 Eppendorf 管内，置-70℃准备行 N-PCR，另1份做尿素酶试验，其中5例进行细菌培养。用过的刮器，彻底清洗，严格消毒，以防交叉污染。随后常规胃镜检查做出诊断，在距幽门口5cm以内的部位钳取粘膜标本7块，分别进行细菌培养、尿素酶试验、组织学染色检查和N-PCR检测。对2例胃粘膜和牙斑HP均阳性的病人给予复方得乐(胶状次枸橼酸铋和甲硝唑)治疗，每次1袋，每日4次，连服4周，在停药1个月后复查牙斑和胃粘膜标本。
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二、检测HP的常规方法
1.细菌培养：取活检标本2块或牙斑标本，用接种环在 Skirrow 选择性培养基上划线分离，置 37℃微氧条件(5%O2，10%CO2，85%N2)培养3～4天，然后对培养菌进行系统的生物学鉴定[1]。
2.组织学检查：2块胃粘膜标本用10%福尔马林液固定，连续切片，Warthin-Starry银染色辨认HP；HE染色做出病理学诊断。
3.尿素酶试验：用本实验室研制的尿素酶试剂盒[2]。将1块活检粘膜或牙斑标本放放试剂中，观察试剂颜色的变化，在10分钟内试剂变为红色者为阳性，颜色不变者为阴性。
以上3种方法作为检测胃粘膜HP的参照方法，有1项或1项以上阳性者判为HP阳性，3项皆为阴性则为HP阴性。
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三、巢式PCR扩增
1.DNA抽提：29例牙斑标本用TE液(10mmol/L Tris-HCL, 1mmol/L EDTA,pH8.2)低温 10 000r/min离心洗涤 2 次，弃上清，牙斑沉淀物和胃粘膜标本用粗提法抽提DNA[3]，即向标本内加入 50μl 灭菌三蒸水，混匀后置于100℃沸水中10分钟，离心取上清行N-PCR。用生理盐水将培养菌从平皿中洗下，TE液离心洗涤2次，然后用酚-氯仿提取法抽提DNA。
2.引物选择：两对引物即巢式引物(nested-primers)选自HP尿素酶A基因片段[4，5]，一对外引物在尿素酶A基因中的碱基定位分别是86～109bp和614～637bp，扩增片段长度为552bp；一对内引物的碱基定位则分别为175～198bp和461～484bp，扩增片段长度为310bp。
3.扩增条件与产物鉴定：在50μl体积中，引物浓度各为0.4μmol/L，4种脱氧单核苷酸浓度各为0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶(英国 HT 公司产品)0.5U，模板DNA 2μl(约 1μgDNA)。94℃变性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸60秒，循环在Eppendorf 自动PCR 仪上进行。先用1对外引物行第一次扩增，循环40圈后，取其产物(552bp)lμl，用1对内引物行第二次扩增，仍为40圈，扩增产物(310bp)用7%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，HaeⅢ-φX174标准DNA分子量(美国生命技术公司)作参照。
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四、引物特异性和敏感性鉴定
PCR 对1株 HP 标准菌株 NCTC14 126 (中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所陈晶晶研究员惠赠)、20个HP临床分离株(本室常规培养分离后提取DNA保存)和以下12种常见肠道菌进行扩增：结肠弯曲菌(上海第二医科大学微生物学教研室张振华教授惠赠)；空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、大肠杆菌、雷极变形杆菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷白氏菌(均由北京生物制品鉴定所提供)
对HP分离培养株(B159)的DNA进行纯度测定(A260/A280＝1.9，吸光度A，曾称光密度OD)的定量，以连续10倍稀释法进行稀释，浓度从1μg/μl～1ag/μl，对每个浓度各行N-PCR3次。
结 果
, 百拇医药 一、N-PCR 特异性及敏感性鉴定
1株HP标准菌株和20个HP临床分离株PCR均为阳性，而12种肠道菌均阴性(附图)；在敏感性鉴定中，第二次扩增后敏感性达到可检测0.1fg(10-16g)细菌DNA水平。
二、胃粘膜及牙斑标本检测
29例胃粘膜标本，用参照方法检查，21例HP阳性，8例阴性，N-PCR的检测结果与之完全一致。21例胃粘膜HP阳性者的牙斑，有8例N-PCR阳性，而8例胃粘膜HP阴性者的牙斑，N-PCR均为阴性。29例患者的牙斑尿素酶试验均为阳性，5例牙斑进行细菌培养，均有杂菌过度生长，未见HP。
三、治疗研究
2例胃粘膜及牙斑N-PCR均为阳性的病人，治疗停药后1个月复查，用参照方法和N-PCR检测，胃粘膜HP已被根除，但牙斑N-PCR仍均为阳性(附图)。
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1.HaeⅢ-φX174标准 DNA 分子量；2.慢性胃炎病人(No38)药物治疗前牙斑HP阳性；3.该病人治疗后牙斑HP仍为阳性；4.该病人治疗前胃粘膜HP阳性；5.治疗后胃内HP被根除，N-PCR转为阴性；6.空肠弯曲菌N-PCR阴性；7.HP标准菌株(NCTC 14126)扩增产物；8.9.两株HP分离培养菌(B137,B159)扩增产物
附图 7%聚丙烯酰胺凝胶电泳示幽门螺杆菌尿素酶A基因N-PCR扩增产物。
讨 论
流行病学调查提示，HP在人群中的感染率很高，并有家庭聚集现象[6，7]，但关于其确切传染源和传播途径尚不清楚。1989年，Krajden 等[8]报道，对71例病人的胃粘膜、牙斑和唾液进行 HP 培养，结果胃粘膜29例(40.8%)阳性，牙斑1例阳性，唾液全部阴性，提出牙斑和唾液可能不是HP的重要传染源。1991年 Desai 等用尿素酶试验，对43例消化不良患者的牙斑、胃窦和胃体粘膜标本进行检测，其阳性率分别为98%、67%和70%，提出牙斑的HP数量显著高于胃内，是主要的传染源。该文中仅用尿素酶试验作为检测HP的指标，其结果的准确性值得怀疑，因为尿素酶试验剂中含有尿素和酚红，HP有尿素酶，可分解尿素，使pH值升高，当pH高于6.8时，酚红由黄色变为红色。正常新鲜唾液的pH值范围为5.6～7.0(平均值6.7)，牙斑的pH值还要高一些，单纯口腔内的pH值即足以使尿素酶试验显示阳性结果。因此，尿素酶试验用于检测牙斑标本，阳性结果并不能肯定是HP感染。但HP是人胃内唯一能够产生大量尿素酶的细菌，胃内的pH值通常小于6.0，所以尿素酶用于胃内HP感染的诊断比较可靠。我们对29例病人的牙斑做尿素酶试验，结果全部为阳性，因此单纯用尿素酶试验作为检测口腔中HP的方法是不可取的。
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我们虽在skirrow培养基中加有多粘菌素、万古霉素和两性霉素，但用于牙斑细菌培养时，仍可见多量杂菌过度生长，无法辨认HP菌落。
我们建立的N-PCR方法可检测0.1fg细菌DNA(1fg相当于1个细菌DNA[9])，比目前国外报道的最好结果(10fg)[10]还敏感100倍。经特异性鉴定，对其它细菌无扩增，特别是采用巢式引物，在第一次扩增得到552bp产物的前提下，用互补于该产物的一对内引物行第二次扩增，即得到一个更加特异的 310bp的产物，因此是一种非常理想的HP感染流行病学调查工具。我们曾用互补于HP 16SrRNA基因片段的一对引物行PCR(敏感性为10pg)检测牙斑标本，未能成功，说明口腔中的HP量少不易检出。N-PCR法的敏感性大大提高。在21例胃粘膜阳性者中，8例牙斑中也检出HP，而胃粘膜阴性者，牙斑N-PCR均阴性，说明牙斑内确实存在HP，但数量可能很少。我们结果提示，HP可通过口-口途径传播。
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本课题为国家自然科学基金资助课题
参考文献
1 杨海涛，周殿元，方国存，等.幽门弯曲菌与慢性胃炎和消化性溃疡发病学关系的研究.中华医学杂志，1988:68:366.
2 杨海涛，周殿元，项兆英.幽门螺杆菌的研究方法.见：周殿元，杨海涛，张万岱主编.幽门螺杆菌与胃十二指肠疾病.上海科学技术文献出版社，1992:460-484.
3 宋 敏，李 进，杨海涛，等.聚合酶链反应检测幽门螺杆菌.中华医学杂志，1992;72:455.
4 Clayton CL,Pallen MJ,Kleanthous H,et al.Nucleotide sequence of two genes from helicobacter pyloriencoding for urease subunits.Nucleic Acid Res,1989,18:362.
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5 Wing KK, Lin H,Ferrell LD,et al.Detection of helicobacter pylori in human gastric carcinoma tissue by nested-PCR tests. Annual Meeting of American Gastroenterological Association and American Association for the Study of Liver Diseases. San Francisco,1992:10-13.
6 杨海涛，周殿元.幽门弯曲感染流行病学及致病性的研究进展.中华流行病学杂志，1990,11:251.
7 杨海涛，梁冠峰，宋 梅，等.幽门螺杆菌感染在家庭内聚集.中华消化杂志，1992,12:40 .
8 Krajden S,Fuksa M,Anderson,J,et al.Examination of human stomach biopsies,salive,and dental plaque for campylobacter pylori.J Clin Microbiol,1989,27:1397.
9 Ho SA,Heyle JA,Lewis FA,et al.Direct polymerase chain reaction test for detection of helicobacter pylori in human and animals. J Clin Microbiol 1991,29:2543.
(收稿：1992-12-22 修回：1993-09-24), 百拇医药