肝癌及癌旁组织中丙型肝炎病毒基因负链的研究

http://www.100md.com 《中国医学杂志》 1994年第3期

     作者：查文章 杜竞浑 王学浩 黄祖瑚 李军

    单位：210029南京医学院第一附属医院肝癌研究中心，查文章为研究生，现在江苏盐城市第一医院

    关键词：肝肿瘤；丙型肝炎病毒；基因，病毒

    中华医学杂志940304

    摘要 运用巢式聚合酶链反应(PCR)等方法检测了5例丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)阳性患者的肝癌、癌旁组织和周围血清中HCV-RNA正链和负链，其中男4例，女1例。结果，正链检测：血清及癌旁组织全部阳性，癌组织中3例阳性。负链检测：血清中均阴性，癌组织3例阳性，癌旁组织5例均阳性。本组5例患者肝脏HCV-RNA负链阳性，推测HCV-以HCV-RNA负链作为模板在感染的肝脏组织中复制，HCV持续存在于肝脏组织中对肝癌的发生起了一定的作用。

    丙型肝炎病毒(HCV)是非甲非乙型肝炎、肝硬化、肝癌的重要病原^[1]。HCV通过血液传播并推测在感染的肝脏组织中复制。在临床所取得的标本中仅含有微量的HCV，所以通过常规的杂交技术无法检测到丙肝病毒基因。近来建立的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)在肝组织和血清中检测到HCV-RNA^[2]，但很难区分病毒基因是来源于肝组织本身还是血液中的病毒颗粒粘附于肝组织。我们根据HCV是一类单股正链RNA病毒，呈RNA→RNA复制，在病毒分类学上属于披膜病毒科中的黄病毒属这一特点，推测在感染并能复制HCV的组织中可能检测到HCV-RNA的负链。我们用巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法检测了48例原发性肝癌患者的癌组织、癌旁组织和周围血清中HCV-RNA和抗HCV，并对其中5例HCV-RNA阳性患者的癌组织、癌旁组织和周围血清中的HCV基因负链进行检测。现将结果报道如下。

    材料与方法

    一、肝癌组织及血清标本

    48例原发性肝癌患者在无菌条件下静脉采血，分离的血清除送检抗-HCV(Abbott 试剂，美国)外均分装后置-70℃待测，手术切除标本取癌及癌旁组织约1g立即放置液氮缺罐中保存，备作RNA抽提。

    二、PCR引物

    Nested-PCR亦称二步法或套式PCR，需要两对引物。本研究所用引物的序列如下：

    外引物：有意义链(NCS)：5'-CGATTTCGGCGACACTCCACCATAGAT-3'反意义链(NCA)：5'-CCGGTGCGGTGCACGCGGTCTACGAGACCT-3'

    内引物：有意义链：5'-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3'

    反意义链：5'-GTTGATCCAAGAAAGGACCC-3'

    三、组织和血清RNA的提取按一步法进行^[3]。

    四、互补DNA(cDNA)的合成

    使用cDNA合成试剂盒(Promega，美国)，10μl RNA溶液全部用于cDNA合成，反应体积为20μl，正链HCV-RNA互补DNA的合成用外引物中的反意义链(亦称下游引物)，负链HCV-RNA互补DNA的合成为外引物中的有意义链(亦称上游引物)，所得到cDNA在沸水浴中至少30分钟，然后置冰浴中备用。

    五、巢式HCV-PCR

    使用PCR试剂盒(Promega，美国)，20μlcDNA合成产物合部用于扩增，反应体积为50μl，引物为一对外引物，温度循环程序为95℃，4分钟，继以94℃，1分钟；55℃；1.5分钟；72℃，3分钟，循环共40次，末一次循环时72℃延长至10分钟。自动温度循环器为美国Perkin Elmer Cetus 产品。取2μl第一步扩增的产物加入第二步扩增反应，引物为一对内引物。温度循环程序为95℃，4分钟继以94℃，1分钟；55℃，1分钟和72℃，1分钟的循环共25次，末一次循环72℃，10分钟。

    六、PCR产物的检测

    第一步扩增的产物为388碱基对(bp)的核酸片段，第二步扩增的产物为144bp的核酸片段。取10μl扩增产物作琼脂糖凝胶电泳(1.5%)，经溴化乙啶(0.5μl/ml)染色后在紫外灯下观察并照像记录结果。电泳时均以123bp梯度DNA标志物(BRL，美国)为DNA分子量标志。

    结 果

    一、肝癌及癌旁组织中HCV-RNA正负链检测结果(附表，图1)

    附表 5例肝癌患者癌组织、癌旁组织和周围血清中正、负链检测结果 例号

    正链 HCV-RNA

    负链 HCV-RNA

    血清

    癌旁

    癌

    血清

    癌旁

    癌

    1

    +

    +

    +

    -

    +

    +

    2

    +

    +

    -

    -

    +

    -

    3

    +

    +

    +

    -

    +

    +

    4

    +

    +

    -

    -

    +

    -

    5

    +

    +

    +

    -

    +

    +

    5例HCV阳性的肝癌患者外周血和肝癌组织及癌旁组织HCV-RNA正链阳性，HCV-RNA负链仅在肝癌及癌这次组织中检测到，在HBV阳性的肝癌、癌旁组织和外周血中HCV-RNA正负链均阴性，这些结果表明：HCV在肝脏中复制而不是血清中。

    二、HCV阳性肝癌患者外周血HCV-RNA正负链在不同温度下灭活逆转录酶性检测结果

    HCV阳性肝癌患者外周血HCV-RNA正负链在不同温度下灭活逆转录酶PCR检测的结果是不相同的(图2)；HCV变化RNA正链阳性结果不随温度变化，负链的阳性结果在cDNA合成后煮沸30分钟后消失，负链阳性结果可能与PCR过程中逆转录酶活性没有完全灭活有关，所以样本应在cDNA 合成后至少煮沸30分钟以后再进行第一轮PCR，以防止假阳性结果。

    1号为阳性对照，2号为阴性对照，3～7号为癌旁组织，8～12号为癌组织

    图1 肝癌及癌旁组织中HCV-RNA正负链检测结果

    图2 一例HCV阳性肝癌患者外周血中HCV-RNA正负链随不同时间灭活逆转录酶活性检测结果。5'、10'…为灭活时间

    讨 论

    RT-PCR是检测HCV感染者外周血中HCV-RNA非常敏感的一种方法。但在检测肝脏中病毒基因时，很难区分病毒基因是组织本身具有的还是血液中HCV粘附于组织上，所以，用PCR手段区分丙肝病毒复制场所，对于HCV感染者组织中HCV-RNA负链的研究非常重要。

    HCV复制的具体环节仍不清楚。现有研究表明：HCV是一类单股正链的RNA病毒，根据其氨基酸序列的同源性，HCV属于黄病毒属。黄病毒复制的特点是负链RNA可作为病毒复制模板，所以在感染的组织中检测到病毒基因的负链也就证明病毒能在感染的组织中复制。本组5例肝癌和癌旁组织中检测到HCV-RNA负链，推测HCV运用HCV-RNA负链作为模板在感染的肝脏组织中复制。HCV持续感染或许是造成肝脏反复的炎症、坏死，从而有可能构成致癌作用的启动因子，有关HCV的致癌机理尚不清楚，有待进一步研究。

    参考文献

    1 查文章，丙型肝炎与肝癌，江苏医药，1992，11：613。

    2 Garson JA, Tedder RS, Briggs M, et al. Detection of hepatitis C Viral sequences in blood donations by “nested”polymerase chain reaction and pridiction of infectivity, Lancet, 1990;2:1419.

    3 Chomczynski P, Sacchi N, Single step method of RNA islation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156.

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