LCM激发粒系集落刺激因子对早幼粒白血病细胞株的诱导分化作用
作者：黄非 赵惠平 高雪芝 戴梅美
单位：212001镇江医学院附属医院血液科(黄非)，检验科(赵惠平)；南京铁道医学院附属医院(高雪芝、戴梅美)
关键词：
中华医学杂志940318
现有研究表明，集落刺激因子(CSF)除对正常造血细胞的增殖和分化起着重要作用外，对白血病细胞也有着生物学调节作用，其中粒系集落刺激因子(G-CSF)可能具有诱导白血病细胞分化的能力。但对此尚存较大争议。基于此状况，我们探讨了G-CSF和白细胞条件培养基(LCM)对早幼粒白血病细胞株(HL-60)的诱导分化作用。
一、材料和方法
1、HL-60细胞：由苏州医学院血液病研究所提供。重组人粒系集落刺激因子(rhG-CSF)。由美国马萨诸塞州坎布里奇市遗传研究所馈赠。
, http://www.100md.com
2、LCM制备：正常人周围血的白细胞经Ficoll-Hypaque分离及孵化1小时后，收集单个核贴壁细胞，以含15%小牛血清和0.5mmol/L 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至1×109/L，再培养7天，7天后将上清液离心过滤后备用。
3、诱导分化：本实验rhG-GF终浓度为1：1000(V/V)。LCM的实验浓度为20%。实验时取对数生长期HL-60细胞用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液悬浮成2×108/L浓度，在37℃，5%CO2饱和湿度空气中培养，分别于3、5和7天时各取样品进行检测。
4、细胞分化的判断：经细胞瑞氏染色、硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验和氯醋酸AS-D 萘酚酯酶(AS-D-CE)及醋酸萘酚酯酶(NAE)染色等方法综合分析HL-60细胞分化情况。
二、结果
, 百拇医药
rhG-CSF单独作用后，HL-60细胞形态与对照组相比无显著变化，其NBT还原率，AS-D-CE和NAE阳性率与对照组也无显著差异(P>0.05)。
LCM单独作用及rhG-CSF和LCM联合作用后细胞分化情况见附图。联合作用组较LCM单独作用组显著增加细胞分化比例(P<0.005)，且联合作用组中更多分化细胞为粒系细胞。
附图 rhG-CSF和LCM联合诱导HL-60细胞分化
LCM单独作用及rhG-CSF与LCM联合作用后细胞酯酶染色和NBT还原试验结果见附表，LCM和rhG-CSF合用组与单用LCM组比较，NAE阳性率无显著增加(P>0.05)，表明加用rhG-CSF后主要促进细胞向粒系分化，与细胞形态学改变基本一致。
, 百拇医药
三、讨论
已有报道[Int J cancer 1987,39:993.]认为G-CSF能诱导白血病细胞分化，但有些实验结果与此相反[Am J Hematol 1988, 27:84]。我们的结果显示rhG-CSF单独使用时，未见HL-60细胞有分化成熟迹象。但当rhG-CSF和LCM联合作用时，HL-60细胞的分化比例却较LCM单独作用时显著增高，且分化的细胞主要为粒系细胞，由此提示rhG-CSF具有诱导白血病细胞分化的潜在能力。
附表 rhG-CSF和LCM作用于HL-60细胞7天后细胞化学的变化(%) 方法
对照
rhG-CSF
LCM
rhG-CSF+LCM
, 百拇医药
AS-D-CE
69.8±3.0
71.5±5.6
65.5±3.2
62.3±4.0
NAE
1.9±0.9
2.0±0.4
9.1±1.8
11.2±2.2
NBT
2.6±1.1
, 百拇医药
2.5±1.1
28.9±1.4
59.4±2.1
目前已在HL-60细胞上发现有G-CSF的高亲和力结合位点[Blood, 1989,74:56]，且白血病细胞对CSF的反应能力与细胞对CSF所表达的受体绝对数无直接关系。但G-CSF为何对HL-60细胞无诱导分化作用或仅有轻微诱导作用，其原因尚不清楚。依据实验结果我们推测G-CSF与细胞受体结合后还需其它因子介导才能激活白血病细胞分化过程，可能是G-CSF未能单独诱导HL-60细胞分化的原因之一。
现已证实LCM中包含有白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子等物质，这些细胞活性因子本身对白血病细胞有一定的增殖和分化作用。因此G-CSF和LCM联合应用显著增加HL-60细胞分化的现象，可能正是G-CSF和LCM中一种或几种细胞因子共同作用的结果。Yuri发现G-CSF单独使用时对白血病细胞仅有较弱的诱导分化作用，但当G-CSF与白细胞介素1及肿瘤坏死因子结合作用后，能更有效地诱导白血病细胞分化，并且这种分化情况并非是这几种因子作用相加的结果。此现象支持我们上述的推测，我们曾研究发现G-CSF和维甲酸能协同诱导早幼粒白血病细胞分化也为这种推测提供了佐证。
我们的研究结论是，G-CSF可能是一种潜在而又有效的诱导白血病细胞分化的生物因子，但由于白血病细胞分化过程存在异常等原因，因此G-CSF的诱导分化潜力可能需依靠其它细胞因子或化学制剂的介入才能得以充分发挥。, 百拇医药
单位：212001镇江医学院附属医院血液科(黄非)，检验科(赵惠平)；南京铁道医学院附属医院(高雪芝、戴梅美)
关键词：
中华医学杂志940318
现有研究表明，集落刺激因子(CSF)除对正常造血细胞的增殖和分化起着重要作用外，对白血病细胞也有着生物学调节作用，其中粒系集落刺激因子(G-CSF)可能具有诱导白血病细胞分化的能力。但对此尚存较大争议。基于此状况，我们探讨了G-CSF和白细胞条件培养基(LCM)对早幼粒白血病细胞株(HL-60)的诱导分化作用。
一、材料和方法
1、HL-60细胞：由苏州医学院血液病研究所提供。重组人粒系集落刺激因子(rhG-CSF)。由美国马萨诸塞州坎布里奇市遗传研究所馈赠。
, http://www.100md.com
2、LCM制备：正常人周围血的白细胞经Ficoll-Hypaque分离及孵化1小时后，收集单个核贴壁细胞，以含15%小牛血清和0.5mmol/L 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至1×109/L，再培养7天，7天后将上清液离心过滤后备用。
3、诱导分化：本实验rhG-GF终浓度为1：1000(V/V)。LCM的实验浓度为20%。实验时取对数生长期HL-60细胞用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液悬浮成2×108/L浓度，在37℃，5%CO2饱和湿度空气中培养，分别于3、5和7天时各取样品进行检测。
4、细胞分化的判断：经细胞瑞氏染色、硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验和氯醋酸AS-D 萘酚酯酶(AS-D-CE)及醋酸萘酚酯酶(NAE)染色等方法综合分析HL-60细胞分化情况。
二、结果
, 百拇医药
rhG-CSF单独作用后，HL-60细胞形态与对照组相比无显著变化，其NBT还原率，AS-D-CE和NAE阳性率与对照组也无显著差异(P>0.05)。
LCM单独作用及rhG-CSF和LCM联合作用后细胞分化情况见附图。联合作用组较LCM单独作用组显著增加细胞分化比例(P<0.005)，且联合作用组中更多分化细胞为粒系细胞。
附图 rhG-CSF和LCM联合诱导HL-60细胞分化
LCM单独作用及rhG-CSF与LCM联合作用后细胞酯酶染色和NBT还原试验结果见附表，LCM和rhG-CSF合用组与单用LCM组比较，NAE阳性率无显著增加(P>0.05)，表明加用rhG-CSF后主要促进细胞向粒系分化，与细胞形态学改变基本一致。
, 百拇医药
三、讨论
已有报道[Int J cancer 1987,39:993.]认为G-CSF能诱导白血病细胞分化，但有些实验结果与此相反[Am J Hematol 1988, 27:84]。我们的结果显示rhG-CSF单独使用时，未见HL-60细胞有分化成熟迹象。但当rhG-CSF和LCM联合作用时，HL-60细胞的分化比例却较LCM单独作用时显著增高，且分化的细胞主要为粒系细胞，由此提示rhG-CSF具有诱导白血病细胞分化的潜在能力。
附表 rhG-CSF和LCM作用于HL-60细胞7天后细胞化学的变化(%) 方法
对照
rhG-CSF
LCM
rhG-CSF+LCM
, 百拇医药
AS-D-CE
69.8±3.0
71.5±5.6
65.5±3.2
62.3±4.0
NAE
1.9±0.9
2.0±0.4
9.1±1.8
11.2±2.2
NBT
2.6±1.1
, 百拇医药
2.5±1.1
28.9±1.4
59.4±2.1
目前已在HL-60细胞上发现有G-CSF的高亲和力结合位点[Blood, 1989,74:56]，且白血病细胞对CSF的反应能力与细胞对CSF所表达的受体绝对数无直接关系。但G-CSF为何对HL-60细胞无诱导分化作用或仅有轻微诱导作用，其原因尚不清楚。依据实验结果我们推测G-CSF与细胞受体结合后还需其它因子介导才能激活白血病细胞分化过程，可能是G-CSF未能单独诱导HL-60细胞分化的原因之一。
现已证实LCM中包含有白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子等物质，这些细胞活性因子本身对白血病细胞有一定的增殖和分化作用。因此G-CSF和LCM联合应用显著增加HL-60细胞分化的现象，可能正是G-CSF和LCM中一种或几种细胞因子共同作用的结果。Yuri发现G-CSF单独使用时对白血病细胞仅有较弱的诱导分化作用，但当G-CSF与白细胞介素1及肿瘤坏死因子结合作用后，能更有效地诱导白血病细胞分化，并且这种分化情况并非是这几种因子作用相加的结果。此现象支持我们上述的推测，我们曾研究发现G-CSF和维甲酸能协同诱导早幼粒白血病细胞分化也为这种推测提供了佐证。
我们的研究结论是，G-CSF可能是一种潜在而又有效的诱导白血病细胞分化的生物因子，但由于白血病细胞分化过程存在异常等原因，因此G-CSF的诱导分化潜力可能需依靠其它细胞因子或化学制剂的介入才能得以充分发挥。, 百拇医药