基因疗法在肿瘤临床治疗中的应用
作者：沈德钧 郑树
单位：310009 杭州，浙江医科大学肿瘤研究所
关键词：
中华医学杂志940426.htm 肿瘤基因治疗是指使用基因操作方法干预宿主靶细胞的有关基因，以达到肿瘤治疗目的的一类方法。广义的基因治疗概念还包括各种基因工程药物来治疗肿瘤。虽然肿瘤基因治疗的研究历史还很短，但随着近年来基因转移技术的迅速发展和日趋成熟[1]，其中肿瘤临床治疗中的应用进展相当快[2-5]。自Kasid等[6]和Rosenberg等[7]于1990年首次报道使用整合新霉素抗性基因(NeoR)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗黑色素以来，目前在美国已有多家单位正使用多种不同技术对诸如黑色素瘤、白血病、脑胶质瘤、肺癌等多种肿瘤进行基因治疗尝试[2-4]。本文就目前肿瘤基因治疗的常用方法及其临床应用情况作一综述。
一、肿瘤基因治疗的常用方法
1.肿瘤基因治疗分类：依据不同的标准可对肿瘤基因治疗方法作不同的分类。Sikora[8]根据基因治疗使用方法的不同原理将之分为：使用基因工程抗肿瘤药物；应用信息药物降低特定基因表达；对突变基因行基因置换；基因添加等四类。也有学者根据治疗中修饰靶基因的不同将之分为：细胞因子基因治疗；针对肿瘤抗原的基因治疗；针对癌基因的基因治疗；针对化疗的基因治疗等四类[9]。我们根据基因治疗临床疗效产生的不同原理而将其分为三类，即类化学疗法；生物反应调整疗法(BRMT)；宿主保护疗法。所谓类化学疗法指此类技术的使用与常规肿瘤化疗在原理上有相似之处，两者均使用细胞毒因子直接杀伤或抑制肿瘤细胞，只是本法使用的是基因工程药物或信息药物，故药物的特异性较高，副反应也较小。目前临床上用于治疗白血病及某些实体瘤的重组细胞因子、改形单克隆抗体(Reshaped McAb)、融合毒素、反义核酸和肿瘤抑制基因等均属此类。各种靶向表达系统如病毒导向的酶解药物前体疗法(VDEPT)和整合肿瘤坏死因子(TNF)基因的TIL等还能进一步提高类化学疗法的特异性和疗效。生物反应调整疗法主要通过调整、刺激或提高宿主全身或局部的抗肿瘤免疫力来间接杀灭肿瘤细胞。最常用的方法是制备肿瘤 相关的抗原疫苗；还可通过将B7基因导入肿瘤细胞为T细胞激活提供共刺激信号(costimulation signal)；而靶向表达白介素2(IL-2)和粒细胞和巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)基因不仅能有效促进瘤区的T细胞毒效应，还能促进其他炎症细胞如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润，从而更有效地杀伤肿瘤细胞[10]。宿主保护疗法通常作为肿瘤放疗、化疗的辅助治疗手段，常通过保护宿主造血干细胞或促进其增生来提高宿主对大剂量放化疗的耐受力。例如，将多向药物抗性(MDR)基因整合至宿主骨髓干细胞，可使其耐受较大剂量的化疗而达到肿瘤治疗目的。
2.肿瘤基因治疗的受体细胞：受体细胞或靶细胞是决定肿瘤基因治疗疗效的关键因素之一，故具有肿瘤基因治疗临床应用前景的受体细胞应满足一定的条件，如来源丰富、易于培养成活和体外扩增、可耐受各种选择因素、外源基因易于整合和稳定表达等。目前已进入肿瘤基因治疗临床或临床前研究的受体细胞可分成四类：淋巴细胞、肿瘤细胞、造血干细胞和其他细胞如成纤维细胞等，其特性见附表，在实际应用中各有特点。其中最常用者当推淋巴细胞，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞因具有选择性瘤灶浸润特性故一开始就备受青睐[6、11]，当前的研究十分注重分离具有高度靶向性的TIL，以便携带效应基因至肿瘤局部发挥效应。肿瘤细胞是类化学疗法的靶细胞，近年来有人使用基因转移技术将不同外源基因导入肿瘤细胞，可增强其免疫源性或激活细胞毒T细胞的能力，使之成为兼具治疗和预防复发作用的“瘤苗”(tumorvaccine)[12]。骨髓干细胞的分离培养和体外扩增及鉴定目前还存在一定困难，外源基因也不易整合和稳定表达，但已有人在动物实验中用逆转录病毒载体将MDR-1基因转移入骨髓干细胞，使之能够耐受大剂量紫杉醇(Taxol)化疗[13]。其他细胞如成纤维细胞和皮肤细胞等作为外源基因受体也有其自身的优势[4]，Culver等[14]将经遗传修饰的成纤维细胞与肿瘤细胞混合后注射于瘤体内或皮下，发现前者表达的外源基因可转移至肿瘤细胞，从而激发宿主机体的抗肿瘤免疫反应。但Tsai等[15]则发现，使用肿瘤细胞作为局部淋巴因子分泌源较之使用肿瘤间质成纤维细胞将更能诱导较强的抗肿瘤免疫反应，并认为这可能也与肿瘤排斥反应的“共刺激信号”机制有关。
附表 肿瘤基因治疗的受体细胞
受体细胞
使用方法
治疗目的
特点
淋巴细胞
TIL整合TNF基因
提高瘤区的TNF浓度
来源丰富，易扩增，外源基因可稳定表达，有一定靶向性
TIL整合IL-2或GM-CSF基因
增强瘤区的炎症反应
肿瘤细胞
反义核酸，肿瘤抑制基因，融合毒素等整合异源基因
直接杀灭或抑制肿瘤细胞
来源及外源基因表达因不同个体及不同肿瘤而异，体外培养扩增较困难
增加肿瘤细胞的免疫原性
造血干细胞
整合药物转化基因
将前体药物转化为细胞毒药物
体外扩增培养及鉴定较困难，外源基因整合及表达不稳定
整合MDR-1基因
提高对大剂量化疗的耐受力
整合GM-CSF基因
原位促进骨髓造血干细胞增殖
其他细胞*
整合异源基因
增强肿瘤细胞的免疫刺激性
来源丰富，实用方便，外源基因易于整合及稳定表达
整合药物靶基因或前体药物转化基因
使肿瘤细胞对无毒药物敏感或提高对大剂量化疗的耐受力
* 如成纤维细胞等
二、肿瘤基因治疗的临床和临床前研究
1.淋巴因子基因治疗：1990年Rosenberg等[7]首次报道使用整合携NeoR基因标记的逆转录病毒载体的TIL治疗5例晚期黑色素瘤，探索了人类肿瘤使用基因疗法的可能性，证实了经逆转录病毒基因转移的TIL在临床应用的可行性与安全性。1991年Rosenberg[16]开始一项使用携带TNF基因的TIL治疗50例晚期黑色素瘤的临床研究。TNF在体外和小鼠肿瘤治疗中均显示强大的肿瘤细胞毒效应，但用于临床肿瘤治疗时有效剂量的TNF毒性很大，安全剂量时肿瘤局部TNF浓度却太低，而使用TNF-TIL时瘤区TNF浓度可望增加100倍。但初步的临床试验结果并不乐观，已报道使用该疗法的6例黑色素瘤病人中，仅使用TNF-TIL的3例病人未显示明显疗效，另外3例病人在加用一定计量的IL-2后也仅1例显示较明显的疗效[16]。1992年Rosenberg[16]又进行了一项新的治疗尝试，取一晚期黑色素瘤病人的瘤结节，分离瘤细胞在体外以TNF或IL-2基因修饰后接种于病人股部，三周后再取局部引流淋巴结分离淋巴细胞，体外用IL-2扩增后回输给病人，期望该疗法可增强TIL或细胞毒T细胞的肿瘤杀伤能力[16]。但迄今为止，Rosenberg的TNF-TIL疗法并不成功，主要原因可能是TIL整合TNF基因后其肿瘤定位能力下降甚至消失，且TNF-TIL分泌的TNF量也达不到杀灭肿瘤所需的浓度。目前，美国国立卫生研究院(NIH)的重组DNA顾问委员会(RAC)也对Rosenberg的TNF-TIL疗法提出了质疑[17]，要求他证实该疗法的安全性和可行性，否则将拒绝为该项研究增加拔款。除Rosenberg的研究外，目前美国匹兹堡癌症研究所和法国里昂的Berard研究中心等多家单位也在进行类似的治疗尝试[3]。
2.使用反义核酸的基因治疗：反义核酸分反义DNA和反义RNA两种，前者可与靶细胞DNA双螺旋的特定部位形成三链构象而阻碍转录的进行[18]；而后者可与靶细胞mRNA结合而阻止其翻译产生肿瘤蛋白。由于反义DNA需进入细胞核内方能发挥效应，而反义RNA的作用点在胞浆中，故后者的应用在技术较为简便。反义核酸最适合治疗仅有单基因异常的疾病，如慢性粒细胞性白血病(CML)，即可用针对突变的bcr-ab1基因的反义核酸治疗。目前已进入临床试验阶段的反义寡聚核苷酸主要有两种：即对针P53mRNA的硫代磷酸寡核苷酸(PS oligo)和用于治疗CML的甲基磷酸寡核苷酸(MP oligo)[19，20]。美国Texas MD. Anderson 癌症中心设计的治疗方案为：取CML病人骨髓，体外用针对bcr-ab1的反义RNA杀灭其中的白血病细胞以“净化骨髓”；同时给病人施行大剂量化疗和放疗以彻底杀灭体内的白血病细胞，再回输净化的自体骨髓。该方案的I期临床试验预计治疗10例CML病人。另一项已批准进行临床试验的方案为：使用携带Ki-ras反义基因、p53基因或IL-4基因的逆转录病毒载体治疗小细胞肺癌。
3.使用融合毒素的基因治疗：目前已研制成功的融合毒素数量不少，如IFN-γ/TNF-β、DAB389-EGF、DAB486-IL-2和DAB389-IL-2等。但目前仅 DAB486-IL-2已开始临床试验。DAB486-IL-2是用IL-2基因取代天然白喉毒素受体结合区基因后产生的融合蛋白，对具有丰富IL-2受体的肿瘤细胞如一些白血病细胞具有选择性细胞毒作用。1例使用常规化疗和γ-IFN治疗无效的慢性淋巴细胞白血病病人应用DAB486-IL-2治疗后显示一定疗效[21]。而DAB389-IL-2则是将DAB486-IL-2分子的无义部份去除后产生的较小分子蛋白，体外研究显示其对靶细胞的杀伤力较DAB486-IL-2强10倍，而副反应则小得多。目前DAB389-IL-2也已获准开始临床试验。
4.分子外科(molecular surgery)：所谓分子外科是指使用此项技术治疗肿瘤可象外科手术一样将需去除的肿瘤细胞杀灭干净[22]。目前该技术已至少有三种技术路线可供选择，其一是逆转录病毒载体携带单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HS-TK)基因转染肿瘤细胞，使癌细胞对抗病毒药ganciclovir敏感。Culver等[4]将其用于实验性脑肿瘤的治疗，将能稳定分泌带有HS-TK基因之逆转录病毒的小鼠成纤维细胞直接注入脑胶质瘤瘤体内，由于逆转录病毒仅感染分裂细胞，故只进入胶质瘤细胞使之表达HS-TK而不进入正常脑组织细胞。5天后，用ganciclovir治疗，发现大鼠脑胶质瘤可完全消退，实验组14只大鼠中有12只经大体检查和显微镜检查均未找到癌细胞，余2只大鼠仅在显微镜下发现少量不表达HS-TK基因的成活瘤细胞。虽然使用本法进行基因转移时仅约60%的瘤细胞感染逆转录病毒载体，但消退的瘤细胞却近乎100%(称之为旁观者效应bystander effect)，且对正常神经组织几乎无损伤，其原因有待研究。该研究结果发表后，RAC便批准进行20例临床试验，结果显示该技术具有巨大的临床应用潜力。第二种方法是一种具有靶向性的前体药物疗法，其原理为：将水痘-带状疱疹病毒(VZV)的TK基因与某种肿瘤相关抗原如AFP或CEA等基因的启动子连接，整合至逆转录病毒载体，再感染宿主细胞，当此病毒载体感染肿瘤细胞后，由于其细胞内有适当的酶系统，此肿瘤相关抗原的启动因子即被激活而启动TK基因表达，此TK可催化无毒药物前体6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖核苷(AraM)生成具有很强细胞毒性的三磷酸阿拉伯糖核苷(AraATP)而杀伤肿瘤细胞，此即所谓病毒导向的酶解药物前体疗法(VDEPT)[23]。第三种方法是将细菌的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因整合至瘤细胞，此基因可使无毒药物前体5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶而杀灭肿瘤细胞。将CD基因与CEA启动子一起构建的VDEPT系统将可望用于治疗大肠癌的肝转移[24]。后两种方法目前在动物实验中均取得类似外科手术的疗效，但目前尚未开始临床应用。
5.使用肿瘤疫苗的基因治疗：运用基因工程技术制备肿瘤疫苗是当前生物反应调整疗法研究的又一热点。目前其主要的研究途径有：(1)将外源基因直接注入肿瘤：近年来发现，肿瘤相关抗原(TAA)与T淋巴细胞抗原受体(TCR)的结合仅能使T细胞识别肿瘤细胞，要激活T细胞还需特定抗原递呈细胞(APC)表面的B7分与T细胞表面CD28分子结合形成“双信号”或“共刺激”，这样才能产生有效的T细胞介导的抗肿瘤免疫[25，26]。美国密歇根大学医学中心的Nabe1即用HLA-B7基因给晚期黑色素瘤病人行瘤体内注射，并用脂质体包裹B7基因以增加其吸收，期望B7基因整合表达后可促进T细胞性抗肿瘤免疫。此研究预计将治疗12-15例晚期黑色素瘤病人。(2)细胞因子基因修饰肿瘤细胞：利用整合细胞因子基因的肿瘤细胞分泌细胞因子以刺激肿瘤局部的免疫效应细胞的激活、增生并浸润于瘤区内，是肿瘤疫苗概念的新扩展。已有学者发现用转导后能分泌GM-CSF的灭活肿瘤细胞接种小鼠可诱导很强的、长期的特异性抗肿瘤免疫力[27]。美国Memorial Sloan-Kettering癌症中心已获准进行的一项临床试验将使用IL-2基因修饰癌细胞，并用放射线灭活细胞，注射于患者四肢局部用于治疗。他们发现这些灭活的癌细胞至少还能分泌IL-2 2-3周。该研究计划治疗黑色素瘤和肾癌各12例。(3)病毒基因修饰肿瘤相关基因：将具有强抗原性的病毒抗原基因与抗原性较弱的TAA基因偶联，借此增强机体对肿瘤抗原的免疫反应性，是制备多肽肿瘤疫苗的又一条途径。Kantor等[28]将牛痘病毒基因与CEA基因联接，构建成重组多肽疫苗rV(NYC)-CEA，在抗结肠癌动物实验中发现可诱发强大的细胞介导和体液介导的抗肿瘤免疫反应。
6.针对造血干细胞的基因治疗：目前肿瘤化疗失败的主要原因之一是病人初次化疗时由于骨髓抑制而未能耐受足量的全程化疗。故使用MDR基因保护宿主造血干细胞使之能耐受全程化疗一直是人们研究的目标。由于骨髓干细胞的分离、鉴定及体内外基因转移和稳定表达很不容易，故目前这方面的研究虽已取得一些进展[13]，但尚未开始临床应用。参 考 文 献
1.Mulligan RC. The basic science of gene therapy. Science, 1993, 260 : 926.
2.吴旻.基因治疗纵横谈.中华医学杂志,1993, 73 : 389.
3.Anderson WF. Human gene therapy. Science, 1992, 256 : 808.
4.Miller AD. Human gene therapy comes of age. Nature, 1992, 357 : 455.
5.Watson F. Human gene therapy-progress on all fronts. TIBTECH, 1993, 11 : 114.
6.Kasid A, Morecki S, Aebersold P, et al. Human gene transfer : Characterization of human tumor-infiltrating lymphocyte as vehicles for retroviral-mediated gene transfer in man. PNAS, 1990, 87 : 473.
7.Rosenberg SA, Aebersold P, Cornetta K, et al. Gene transfer into humans-immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modifired by retroviral gene transduction. N Eng1 J Med, 1990; 323 : 570.
8.Silora K. Gene therapy for cancer. Eur J Cancer, 1991, 27 : 1069.
9.田志刚，刘杰.肿瘤基因治疗的原理及应用.国外医学肿瘤学分册,1992, 19 : 232.
10.Lanzavecchia A. Identifying strategics for immune intervention. Science, 1993, 260 : 937.
11.Culver K, Cornetta K, Morgan R, et al. Lymphocytes as cellular vehicles for gene therapy in mouse and man. PNAS, 1991, 88 : 3155.
12.Plautz GE, Yand ZY, Wu BY, et al. Immunotherapy of malignancy by in vivo gene transfer into tumors. PNAS, 1993, 90 : 4645.
13.Sorrentino BP, Brandt SJ, Bodine D, et al. Selection of drug-resistant bone marrow cells in vivo after retroviral transfer of human MDR1. Science, 1992, 257 : 99.
14.Culver KW, Ran Z, Wallbridge S, et al. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science, 1992, 256 : 1550.
15.Tsai SCJ, Gansbacher B, Tait L, et al. Induction of antitumor immunity by interleukin-2 gene-transduced mouse mammary tumor cells versus transduced mammary stromal fibroblasts. JNCI, 1993, 85 : 546.
16.Rosenberg SA. Gnen therapy for cancer. JAMA, 1992, 268 : 2416.
17.Anderson C. Gene therapy researcher under fire-over controversial cancer trials. Nature, 1992, 360 : 399.
18.Psotel EH, Flint SJ, Kessler DJ, et al. Evidence that a triplex-forming oligodeoxyribonucleotide binds to the c-myc promoter in HeLa cells, thereby reducing c-myc mRNA levels. PNAS, 1991, 88 : 8227.
19.Stein CA, Cheng YC. Amtisense oligonucleotids as therapeutic agents-is the bullet really magical? Science, 1993, 261 : 1004.
20.Reynolds T. First antisense drug trials planned in leukemia. JNCI, 1992, 84 : 288.
21.LeMaistre CF, Rosenblum MG, Reuben JM, et al. Therapeutic effects of genetically engineered toxin(DAB486IL-2) in pqtient with chronic lymphocytic leukemia. Lancet, 1991, 337 : 1124.
22.Stone R. Molicular 'surgery' for brain tumors. Science, 1992, 256 : 1513.
23.Huber BE, Richards CA, Krenitsky TA. Retroviral-mediated gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma : an innovative approach for cancer therapy. PNAS, 1991, 88 : 8039.
24.Austin EA, Huber BE. A first step in the development of gene therapy for colorectal carcinoma : cloning, sequencing and expression of Escherichia coli cytosine deaminase. Molecular Pharmacol, 1993, 43 : 380.
25.Chen LP, Ashe S, Brady WA, et al. Costimulation of antitumor immuity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell, 1992, 71 : 1093.
26.Townsend SE, Allison JP. Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells. Science, 1993, 259 : 368.
27.Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, et al. Vaccination withirradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage. colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and Long-lasting anti-tumor immunity. PNAS, 1993, 90 : 3539.
28.Kantor J, Irvine K, Abrams S, et al. Antrtumor activity and immunc responses induced by a recombinant carcinoembryonic antigen-vaccinia virus vaccine. JNCI, 1992, 84 : 1084.
(收稿：1993-05-16 修回：1993-12-10)