外源性基因在大鼠血管平滑肌细胞中的表达
作者：姚阿卿 孙双丹 朱小君 温进坤 俞炜源 李岱宗 顾健人 周爱儒 汤健
单位：100083 北京医学大学心血管基础研究所(姚阿卿、孙双丹、朱小君、李小岱、周爱儒、汤健)，河北医学院(温进坤)、军事医学科学院(俞炜源)，上海肿瘤研究所(顾健人)
关键词：基因疗法；基因表达调节；肌，平滑，血管
中华医学杂志940410.htm
本课题为863资助项目
摘要 分别构建了带有标记基因LacZ和人的全长尿激酶原(ProUK)或纤溶酶原激活物(PA)基因的逆转录病毒载体，通过磷酸钙共沉淀法或假病毒感染法，转染血管平滑肌细胞，经G418筛选得到抗性集落。分析证明，外源性基因可以整合到细胞染色体上，并可表达出相应的具有生物活性的蛋白质。提示血管平滑肌细胞可以作为心血管疾病基因治疗的靶细胞。
, 百拇医药
基因治疗是利用分子生物学和细胞生物学技术，将外源基因转移到体内，以期通过导入基因的表达，补充缺失或失去正常功能的蛋白质，或调节体内某些基因的表达而达到治疗目的的一种方法[1]。目前基因治疗主要集中在肿瘤和某些单基因缺陷所引起的遗传病上，关于心血管疾病的基因治疗正处于起步阶段。我们构建了带有标记基因LacZ或具有溶栓活性的人尿激酶原(ProUK)与纤溶酶原激活物(tPA)全长cDNA的逆转录病毒载体pN2-LacZ、pN2-CMV-ProUK、pN2-CMV-tPA，转染血管平滑肌细胞(VSMC)，观察外源基因能否在心血管细胞中表达。
材料与方法
1.逆转录病毒载体的构建：所用逆转录病毒载体pN2、克隆载体pSK(-)和CMV启动子等由上海市肿瘤研究所顾健人教授惠赠；人ProUK和tPA全长cDNA由黄翠芬教授赠送。pN2-LacZ、pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA逆转录病毒载体的构建过程见图1、2。质粒DNA提取、纯化、酶切等参照Sambrook等[2]方法进行。受体菌E.Coli DH5α和XL1-Blue为本室保存，限制性内切酶和连接酶购自BRL公司，T4DNA聚合酶和KlenowI等购自Pronega公司。
, 百拇医药
图1 质粒pN2-LacZ的构建示意图
图2 质粒pN2-CMV-ProUK及pN2-CMV-tPA构建示意图
2.假病毒的形成和对细胞的转染：取正常Wistar大鼠(雄性，6周)胸主动脉应用贴块法培养VSMC[3]。包装细胞PA317和NIH3T3由顾健人教授赠送。以上细胞用含有10%-20%小牛血清的1640或DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下进行培养。
pH2-LacZ质粒转染VSMC和pN2-CMV-ProUK、pN2-CMV-tPA质粒转染PA317细胞采用磷酸钙共沉淀药盒(Promega公司提供)进行，转染后48-72小时开始用含G418(Promega公司)400μg/ml的培养液进行筛选，11-14天后可见集落形成，挑取单集落进行扩增培养；收集ProUK和tPA基因转染细胞的上清，感染NIH3T3细胞，测定假病毒的滴度。再应用病毒上清在20μg/ml Polybrene(Sigma公司)作用下，转染VSMC细胞，2小时后换成新鲜培养液培养24-48小时，再加G418筛选，得抗G418的VSMC集落。
, 百拇医药
3.Southern印迹杂交：细胞染色体DNA的提取、酶切、印迹转移、杂交和放射自显影等亦参照Sambrook等[2]方法进行。印迹转移用尼龙膜为BIO-RAD公司产品，标记探针采用Boehringer公司的Random Primer Kit，α-32P-dCTP为Amersham公司产品。
4.基因表达产物的检测：LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶的活力用β-半乳糖苷酶测定药盒(Promega公司)进行。依报道的方法[4]对pN2-LacZ转染的VSMC进行组织化学染色。ProUK和tPA免疫活性由上海第二医科大学病理教研室和军事医学科学院协助测定。纤溶酶活性应用溶圈法[5]进行检测。
结 果
一、重组质粒的鉴定
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pN2-LacZ质粒的酶切鉴定结果如图3所示。表明我们所构建的pN2-LacZ质粒及其构建过程中所形成的中间质粒pSK-LacZ等酶切后的片段都是正确的。逆转录病毒载体pN2-LacZ中含有LTR、筛选标记Neo基因和标记基因LacZ。
pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA逆转录病毒载体酶切鉴定结果见图4，5。从SK-CMV质粒经SalI和KpnI酶切，与从ProUK和tPA原始质粒上经HindIII/KpnI回收的ProUK和tPA基因片段重组成SK-CMV-ProUK和SK-CMV-tPA，再从这两个重组质粒上经酶切后回收CMV-ProUK和CMV-tPA片段，分别与经XhoI酶切和KlenowI酶处理的pN2载体连接，构建成pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA逆转录病毒载体。通过质粒酶切鉴定证实符合设计的要求。
1.λ/ HindIIII 2.pSV-LacZ / EcoRI(partial) / BamHI 3.pSK / EcoRI 4.pSV-LacZ / BamHI 5.pN2-LacZ / HindIII 6.pN2 / Xhol
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图3 质粒pN2-LacZ的酶切片结果
1.pSK-CMV / Sal I / KpnI 2.pMM Pro-UK / Hind III / KpnI 3.pSK-CMV-ProUK / Hind III / KpnI 4.λ/ Hind III / EcoRI 5.pN2-Pro-UK-1 / EcoRI 6.pN2-Pro-UK-2 / EcoRI 7.pN2 / EcoaRI
图4 质粒pN2-CMV-ProUK酶切鉴定结果
1.pSK-CMV / Sal I / KpnI 2.pMM-tPA / Hind III / KpnI 3.pSK-CMV-tPA / HInd III / KpnI 4.λ/ Hind III / EcoRI 5.pN2-tPA-1 / EcoRI 6.pN2-tPA-2 / EcoRI 7.pN2-EcoRI
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图5 质粒pN2-CMV-tPA酶切鉴定结果
二、转染外源基因细胞的杂交分析
为了验证转染的平滑肌细胞中是否有外源基因整合到细胞染色体上，我们对转染细胞进行了Southern印迹杂交分析(图6)，从图6可以看出，从转染pN2-LacZ的细胞中提取染色体DNA，经HindIII酶切后，与LacZ探针杂交，在4.1kb处有一杂交带，而转染不含有LacZ基因的pN2载体的细胞则无此杂交带，说明外源性标记基因LacZ已导入VSMC，并整合到宿主细胞的染色体DNA上；从用pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA假病毒感染后筛选出的VSMC，提取染色体DNA，再用HindIII和KpnI酶切后，以32P标记ProUK和tPA基因片段进行杂交，从转染外源基因的细胞染色体上分别可以看到1.6kb和2.2kb的杂交带，而未转染外源基因的细胞则不含有此带，证明ProUK和tPA基因也已整合到宿主细胞的染色体DNA上。
, 百拇医药
左：E.转染pN2-LacZ C.转染pN2
中：E.转染pN2-CMV-ProUK C.转染pN2
右：E.转染pN2-CMV-tPA C.转染pN2
图6 转染细胞的Southern印迹杂交分析
三、基因表达产物的检测
为了证明导入外源基因能否表达出相应的蛋白质，分别进行了LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶及ProUK和tPA的活力的检测。转染pN2-LacZ的VSMC中β-半乳糖苷酶的表达量可达2.06×10-4U/107细胞。组织化学染色证明，在转染pN2-LacZ的VSMC，经X-gal染色后，胞浆呈深蓝色，说明整合进染色体DNA中的LacZ基因可以表达出相应的蛋白质。从转染ProUK和tPA基因的VSMC的培养上清中，测定纤溶酶的的含量，ProUK和tPA的24小时表达量分别为265ng/107细胞和5.6ng/107细胞，远远高于未转染外源基因的VSMC的表达量(3.0ng/107)细胞。取转染ProUK基因的VSMC的培养上清液，用溶圈法测定纤溶酶的生物活性，证明其具有明显的剂量依赖性的纤溶酶活力。以上实验证明，外源基因可以整合入VSMC的染色体DNA中，并表达出相应的具有生物活性的蛋白质。
, 百拇医药
讨 论
外源性基因导入体细胞是基因治疗最关键的一步。心血管系统包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和心肌细胞等。近年来一些作者已将外源性基因成功地导入内皮细胞、成纤维细胞和心肌细胞[6，7]。本工作以标记基因LacZ和具有治疗意义的ProUK及tPA基因为外源基因，通过逆转录病毒载体，成功地将外源性基因导入血管平滑肌细胞，并表达出相应的蛋白质，提示VSMC亦可作为基因治疗的一个重要的靶细胞。
血管平滑肌细胞异常增殖是高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病的重要发病机制之一。高血压和动脉硬化时，一些基因表达异常[8]。我们设想利用VSMC作为靶细胞，将一些外源性基因导入VSMC，增加或抑制细胞内一些基因的表达，可能成为治疗某些疾病的一个有效途径。最近，我们用含有反义N-ras的重组质粒转染培养的自发性高血压大鼠的血管平滑肌细胞，发现它可以降低细胞内N-ras基因的表达，抑制细胞DNA的合成和细胞的增殖[9]。这可能对一些由于VSMC增殖所引起的心血管疾病基因治疗有一定价值。
, 百拇医药
参 考 文 献
1.胡征,周爱儒,汤健.心血管疾病的基因治疗.北京医科大学学报，1992, 24 : 157.
2.Sambrook J, Fritch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
3.Rose R. The smooth muscle cell. II. Growth of smooth muscle in culture and formation of elastic fibers. J Cell Biol, 1971, 50 : 172.
4.Price J, Turner D, Cepko C. Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. PNAS, 1987, 84 : 156.
, http://www.100md.com
5.李风知,李秀珍,唐宏娣等.人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.生物工程学报,1991, 7 : 114.
6.Dickek DA, Neville RF, Zwiebei JA, et al. Seeding of intravascular stents with genetically engineered endothelial cells. Circulation, 1989, 80 : 1347.
7.Lin H, Parmacek MS, Morle G, et al. Expression of recombinant gene in myocardium in vivo after direct injection of DNA. Circulation, 1990, 82 : 2217.
8.汤健,周爱儒.分子心血管病研究的现状与未来.生理科学进展.1992, 23 : 283.
9.夏凉,马爱红,孙双丹等.反义ras对SHR平滑肌细胞的影响.见:汤健,唐朝枢主编.心肺内分泌学.北京科学出版社,1991, 112-113.
(收稿：1993-03-26 修回：1993-11-17), 百拇医药
单位：100083 北京医学大学心血管基础研究所(姚阿卿、孙双丹、朱小君、李小岱、周爱儒、汤健)，河北医学院(温进坤)、军事医学科学院(俞炜源)，上海肿瘤研究所(顾健人)
关键词：基因疗法；基因表达调节；肌，平滑，血管
中华医学杂志940410.htm
本课题为863资助项目
摘要 分别构建了带有标记基因LacZ和人的全长尿激酶原(ProUK)或纤溶酶原激活物(PA)基因的逆转录病毒载体，通过磷酸钙共沉淀法或假病毒感染法，转染血管平滑肌细胞，经G418筛选得到抗性集落。分析证明，外源性基因可以整合到细胞染色体上，并可表达出相应的具有生物活性的蛋白质。提示血管平滑肌细胞可以作为心血管疾病基因治疗的靶细胞。
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基因治疗是利用分子生物学和细胞生物学技术，将外源基因转移到体内，以期通过导入基因的表达，补充缺失或失去正常功能的蛋白质，或调节体内某些基因的表达而达到治疗目的的一种方法[1]。目前基因治疗主要集中在肿瘤和某些单基因缺陷所引起的遗传病上，关于心血管疾病的基因治疗正处于起步阶段。我们构建了带有标记基因LacZ或具有溶栓活性的人尿激酶原(ProUK)与纤溶酶原激活物(tPA)全长cDNA的逆转录病毒载体pN2-LacZ、pN2-CMV-ProUK、pN2-CMV-tPA，转染血管平滑肌细胞(VSMC)，观察外源基因能否在心血管细胞中表达。
材料与方法
1.逆转录病毒载体的构建：所用逆转录病毒载体pN2、克隆载体pSK(-)和CMV启动子等由上海市肿瘤研究所顾健人教授惠赠；人ProUK和tPA全长cDNA由黄翠芬教授赠送。pN2-LacZ、pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA逆转录病毒载体的构建过程见图1、2。质粒DNA提取、纯化、酶切等参照Sambrook等[2]方法进行。受体菌E.Coli DH5α和XL1-Blue为本室保存，限制性内切酶和连接酶购自BRL公司，T4DNA聚合酶和KlenowI等购自Pronega公司。
, 百拇医药
图1 质粒pN2-LacZ的构建示意图
图2 质粒pN2-CMV-ProUK及pN2-CMV-tPA构建示意图
2.假病毒的形成和对细胞的转染：取正常Wistar大鼠(雄性，6周)胸主动脉应用贴块法培养VSMC[3]。包装细胞PA317和NIH3T3由顾健人教授赠送。以上细胞用含有10%-20%小牛血清的1640或DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下进行培养。
pH2-LacZ质粒转染VSMC和pN2-CMV-ProUK、pN2-CMV-tPA质粒转染PA317细胞采用磷酸钙共沉淀药盒(Promega公司提供)进行，转染后48-72小时开始用含G418(Promega公司)400μg/ml的培养液进行筛选，11-14天后可见集落形成，挑取单集落进行扩增培养；收集ProUK和tPA基因转染细胞的上清，感染NIH3T3细胞，测定假病毒的滴度。再应用病毒上清在20μg/ml Polybrene(Sigma公司)作用下，转染VSMC细胞，2小时后换成新鲜培养液培养24-48小时，再加G418筛选，得抗G418的VSMC集落。
, 百拇医药
3.Southern印迹杂交：细胞染色体DNA的提取、酶切、印迹转移、杂交和放射自显影等亦参照Sambrook等[2]方法进行。印迹转移用尼龙膜为BIO-RAD公司产品，标记探针采用Boehringer公司的Random Primer Kit，α-32P-dCTP为Amersham公司产品。
4.基因表达产物的检测：LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶的活力用β-半乳糖苷酶测定药盒(Promega公司)进行。依报道的方法[4]对pN2-LacZ转染的VSMC进行组织化学染色。ProUK和tPA免疫活性由上海第二医科大学病理教研室和军事医学科学院协助测定。纤溶酶活性应用溶圈法[5]进行检测。
结 果
一、重组质粒的鉴定
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pN2-LacZ质粒的酶切鉴定结果如图3所示。表明我们所构建的pN2-LacZ质粒及其构建过程中所形成的中间质粒pSK-LacZ等酶切后的片段都是正确的。逆转录病毒载体pN2-LacZ中含有LTR、筛选标记Neo基因和标记基因LacZ。
pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA逆转录病毒载体酶切鉴定结果见图4，5。从SK-CMV质粒经SalI和KpnI酶切，与从ProUK和tPA原始质粒上经HindIII/KpnI回收的ProUK和tPA基因片段重组成SK-CMV-ProUK和SK-CMV-tPA，再从这两个重组质粒上经酶切后回收CMV-ProUK和CMV-tPA片段，分别与经XhoI酶切和KlenowI酶处理的pN2载体连接，构建成pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA逆转录病毒载体。通过质粒酶切鉴定证实符合设计的要求。
1.λ/ HindIIII 2.pSV-LacZ / EcoRI(partial) / BamHI 3.pSK / EcoRI 4.pSV-LacZ / BamHI 5.pN2-LacZ / HindIII 6.pN2 / Xhol
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图3 质粒pN2-LacZ的酶切片结果
1.pSK-CMV / Sal I / KpnI 2.pMM Pro-UK / Hind III / KpnI 3.pSK-CMV-ProUK / Hind III / KpnI 4.λ/ Hind III / EcoRI 5.pN2-Pro-UK-1 / EcoRI 6.pN2-Pro-UK-2 / EcoRI 7.pN2 / EcoaRI
图4 质粒pN2-CMV-ProUK酶切鉴定结果
1.pSK-CMV / Sal I / KpnI 2.pMM-tPA / Hind III / KpnI 3.pSK-CMV-tPA / HInd III / KpnI 4.λ/ Hind III / EcoRI 5.pN2-tPA-1 / EcoRI 6.pN2-tPA-2 / EcoRI 7.pN2-EcoRI
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图5 质粒pN2-CMV-tPA酶切鉴定结果
二、转染外源基因细胞的杂交分析
为了验证转染的平滑肌细胞中是否有外源基因整合到细胞染色体上，我们对转染细胞进行了Southern印迹杂交分析(图6)，从图6可以看出，从转染pN2-LacZ的细胞中提取染色体DNA，经HindIII酶切后，与LacZ探针杂交，在4.1kb处有一杂交带，而转染不含有LacZ基因的pN2载体的细胞则无此杂交带，说明外源性标记基因LacZ已导入VSMC，并整合到宿主细胞的染色体DNA上；从用pN2-CMV-ProUK和pN2-CMV-tPA假病毒感染后筛选出的VSMC，提取染色体DNA，再用HindIII和KpnI酶切后，以32P标记ProUK和tPA基因片段进行杂交，从转染外源基因的细胞染色体上分别可以看到1.6kb和2.2kb的杂交带，而未转染外源基因的细胞则不含有此带，证明ProUK和tPA基因也已整合到宿主细胞的染色体DNA上。
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左：E.转染pN2-LacZ C.转染pN2
中：E.转染pN2-CMV-ProUK C.转染pN2
右：E.转染pN2-CMV-tPA C.转染pN2
图6 转染细胞的Southern印迹杂交分析
三、基因表达产物的检测
为了证明导入外源基因能否表达出相应的蛋白质，分别进行了LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶及ProUK和tPA的活力的检测。转染pN2-LacZ的VSMC中β-半乳糖苷酶的表达量可达2.06×10-4U/107细胞。组织化学染色证明，在转染pN2-LacZ的VSMC，经X-gal染色后，胞浆呈深蓝色，说明整合进染色体DNA中的LacZ基因可以表达出相应的蛋白质。从转染ProUK和tPA基因的VSMC的培养上清中，测定纤溶酶的的含量，ProUK和tPA的24小时表达量分别为265ng/107细胞和5.6ng/107细胞，远远高于未转染外源基因的VSMC的表达量(3.0ng/107)细胞。取转染ProUK基因的VSMC的培养上清液，用溶圈法测定纤溶酶的生物活性，证明其具有明显的剂量依赖性的纤溶酶活力。以上实验证明，外源基因可以整合入VSMC的染色体DNA中，并表达出相应的具有生物活性的蛋白质。
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讨 论
外源性基因导入体细胞是基因治疗最关键的一步。心血管系统包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和心肌细胞等。近年来一些作者已将外源性基因成功地导入内皮细胞、成纤维细胞和心肌细胞[6，7]。本工作以标记基因LacZ和具有治疗意义的ProUK及tPA基因为外源基因，通过逆转录病毒载体，成功地将外源性基因导入血管平滑肌细胞，并表达出相应的蛋白质，提示VSMC亦可作为基因治疗的一个重要的靶细胞。
血管平滑肌细胞异常增殖是高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病的重要发病机制之一。高血压和动脉硬化时，一些基因表达异常[8]。我们设想利用VSMC作为靶细胞，将一些外源性基因导入VSMC，增加或抑制细胞内一些基因的表达，可能成为治疗某些疾病的一个有效途径。最近，我们用含有反义N-ras的重组质粒转染培养的自发性高血压大鼠的血管平滑肌细胞，发现它可以降低细胞内N-ras基因的表达，抑制细胞DNA的合成和细胞的增殖[9]。这可能对一些由于VSMC增殖所引起的心血管疾病基因治疗有一定价值。
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参 考 文 献
1.胡征,周爱儒,汤健.心血管疾病的基因治疗.北京医科大学学报，1992, 24 : 157.
2.Sambrook J, Fritch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
3.Rose R. The smooth muscle cell. II. Growth of smooth muscle in culture and formation of elastic fibers. J Cell Biol, 1971, 50 : 172.
4.Price J, Turner D, Cepko C. Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. PNAS, 1987, 84 : 156.
, http://www.100md.com
5.李风知,李秀珍,唐宏娣等.人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.生物工程学报,1991, 7 : 114.
6.Dickek DA, Neville RF, Zwiebei JA, et al. Seeding of intravascular stents with genetically engineered endothelial cells. Circulation, 1989, 80 : 1347.
7.Lin H, Parmacek MS, Morle G, et al. Expression of recombinant gene in myocardium in vivo after direct injection of DNA. Circulation, 1990, 82 : 2217.
8.汤健,周爱儒.分子心血管病研究的现状与未来.生理科学进展.1992, 23 : 283.
9.夏凉,马爱红,孙双丹等.反义ras对SHR平滑肌细胞的影响.见:汤健,唐朝枢主编.心肺内分泌学.北京科学出版社,1991, 112-113.
(收稿：1993-03-26 修回：1993-11-17), 百拇医药