转移性癌细胞对表皮生长因子和层粘连蛋白的反应及其三磷酸肌醇含量的测定
作者：胡新荣 高 进 黎艳霞 张德昌
单位：100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院病理研究室
关键词：肿瘤转移；表皮生成因子；层粘连蛋白
中华医学杂志970909 目的 为探讨不同转移性癌细胞(MFC和CNE-2Z)不同克隆细胞株的三磷酸肌醇(IP3)含量、侵袭能力以及这些细胞对表皮生长因子(EGF)和层粘连蛋白(LN)的反应性。方法 利用放射性受体竞争结合法和人工基底膜(matrigel)侵袭试验法进行了测定。结果 显示了低转移性癌细胞比高转移性者的IP3含量高，对EGF的反应性更大，但MFC高、低转移性克隆细胞对LN的反应性差别无显著意义。而CNE-2Z高转移细胞比低转移者对LN的反应性更大。结论 说明高、低转移性癌细胞在跨膜信息传递方面存在差别，深入研究其具体机制将有重要意义。
, 百拇医药
The amounts of inositol 1，4，5-triphosphate and it response to epidermal growth factor and laminin of carcinoma substrains with high or low metastatic potentials. Hu Xinrong, Gao jin, Li Yanxia, et al. Department of Pathology, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005.
Objective To examine the IP3 amounts, invasive potentials, and response to LN and EGF of the substrains with high or low metastatic ability from two kinds of carcinoma cell lines (MFC and CNZ-2Z). Method Radio-ligand binding assay and matrigel invasive assay. Results The low metastatic substrains from the two lines had higher amounts of IP3 and stronger response to EGF than their responsive high ones, but high metastatic substrains from CNZ-2Z had stronger response to LN than the low ones while MFC substrains had not significant difference in response to LN. Conclusion There is internal difference in signal transduction between the high and low metastatic cancer cells, and it is significant to study the difference in detail.
, http://www.100md.com
Key words Neoplasia metastasis Epidermal growth factor Laminin
(Natl Med J China, 1997, 77:665-667)
表皮生长因子(EGF)和层粘连蛋白(LN)都可影响肿瘤细胞的生长和侵袭行为[1～4]，EGF主要激发膜受体的酪氨酸激酶，LN激发其膜受体并与G蛋白偶联。激活的酪氨酸激酶和G蛋白通过磷脂酶C(PLC)改变细胞内三磷酸肌醇(IP3)的含量，从而影响一系列酶促反应，以至细胞行为。我们研究了不同转移性癌细胞(MFC)和CNE-2Z不同转移能力的克隆细胞株IP3含量及对LN和EGF的反应性，以揭示转移性癌细胞在信息调控方面的内在本质。
材料和方法
一、材料
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1.细胞：小鼠前胃癌细胞系(MFC)克隆细胞株(MFC-A6/B3/B5)，人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)克隆细胞株(CNE-2Z-L2和CNE-2Z-L4)由本室建立和保存。
2.主要试剂：3H-1，4，5-IP3购自美国NEN公司，1，4，5-IP3、EGF、LN购自美国sigma公司，Boyden chamber和硝化微孔膜(13μm)为美国产品，其它试剂均为分析纯。
二、方法
1.癌细胞IP3的提取：常规培养细胞至对数生长期，消化吹打制成悬液，调整浓度至2×106个细胞/ml。在1.5ml离心管内每管加入1ml细胞悬液，每个细胞株设3管，37℃，5% CO2培养1小时，使其恢复损伤。每个细胞株分别给一管加入终浓度为3 ng/ml的EGF，另一管加入终浓度为10 ng/ml的LN，第三管加入等量生理盐水作为对照，EGF和LN的工作浓度和作用时间参照文献[1～4]。继续培养25分钟，离心3 000 r/min，5分钟，弃上清液，并用滤纸吸干残余液体。加入高氯酸0.5ml，混匀，4℃放置30分钟。用3 mol/L KOH120 μl调pH值为7.4～8.0，置4℃2小时。4℃ 1 000 g，5分钟，取上清液，-80℃保存以备测定IP3用。
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2.牛肾上腺细胞膜蛋白(IP3)受体的制备见文献[5]。
3.IP3受体放射竞争结合实验见文献[6]：由各浓度IP3标准品测得的直线回归公式为：IP3(nmol/L)=684.6×I-180.4(软件为pharmacologic caculation系统)。按公式求得各株细胞的含量。
4.癌细胞侵袭性的检测：在Boyden chamber下室加入NIH3T3细胞的条件培养液，上室加2万癌细胞，中间用涂布matrigel(500 ng/ml)的硝化微孔膜(Φ13μm)隔开。培养5小时后，用棉签去除表面的matrigel及未侵袭的癌细胞，固定，HE染色，镜检。每株细胞各作两个样本，其一在上室加EGF使其终浓度为3 ng/ml，另一加等量的生理盐水做对照。重复2次。
结果
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一、癌细胞IP3含量的测定及LN和EGF对细胞IP3含量的影响
由表1可见，不加刺激物时，MFC低转移者比高转移者IP3含量稍高，高出约20%左右；CNE-2Z低转移者比高转移者IP3含量高64%。加LN或EGF后，MFC细胞的IP3含量均增加。但CNE-2Z细胞的IP3含量均减少。加入LN，使MFC癌细胞IP3含量升高的程度与癌细胞的转移率之间的关系无明显规律性，而CNE-2Z高转移者比低转移者IP3产量的减少更明显。加入EGF后，MFC低转移者IP3产量的升高比高转移者IP3含量的升高更明显，CNE-2Z低转移者比高转移者IP3产量的减少更明显。
表1 MFC和CNE-2Z两种癌细胞系克隆株的转移率和IP3含量(nmol/L) 细胞株
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转移率
(%)
IP3含量
非刺激
LN
EGF
MFC-A6
60.0
172.8
383.7(+122%)
181.1(+5%)
MFC-B3
, 百拇医药
0
198.2
435.1(+120%)
625.1(+215%)
MFC-B5
0
203.0
650.7(+221%)
525.4(+159%)
CNE-L2
100.0
307.7
, 百拇医药
29.6(-90%)
301.6(-2%)
CNE-L4
13.0
504.2
444.0(-119%)
246.1(-51%)
注：+%或-%表示癌细胞受刺激后IP3含量升高或减少的程度
二、EGF对高、低转移MFC克隆细胞株侵袭能力的影响
由表2可见，MFC-A6比MFC-B3侵袭潜能强(t检验，P<0.01)。加EGF后，两株细胞对matrigel的侵袭能力均增加(P<0.01)，而以低转移MFC-B3增加显著，为119.1%，高转移MFC-A6增加31%(χ2检验，P<0.01)。
, 百拇医药
表2 EGF对癌细胞侵袭的影响(细胞数/高倍视野) 细胞株
转移率(%)
无刺激
EGF
MFC-A6
60.0
46±7
60±5
MFC-B3
0
26±7
57±6
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讨论
IP3是跨膜信号传导中的重要的第二信使物质，它的含量改变方式及程度即可导致细胞功能行为的改变，又是细胞对胞外信号反应的反映。MFC和CNE-2Z两种细胞的不同株转移克隆细胞株为本组所建[7]。本结果表明，低转移克隆细胞株比相应高转移者的IP3含量高。提示，高、低转移能力的瘤细胞具有不同的信息调控。施加EGF后，两种瘤细胞均以低转移者的IP3含量改变更显著，低转移能力的MFC-B3比高转移者MFC-A6侵袭增强更明显，说明EGF激活的信号通路可能与肿瘤转移有关。施加LN后，MFC的高转移能力的克隆瘤细胞与低转移者IP3含量改变差别无显著意义，但高转移者的CNE-2Z克隆细胞比其低转移者IP3含量改变更明显，提示LN激活的跨膜信息传导通路可能只与某些肿瘤转移有关。
LN和EGF都可以作为细胞外配体信号。来源于同一母系的高、低转移能力的克隆细胞的跨膜信息传递差别的原因可能是这些细胞在受体、G蛋白/酪氨酸激酶和磷脂酶C等3个环节中的某一个环节存在功能或结构的差别。进一步研究清楚这些问题，对提供一个治疗干预癌转移的信息传导通路的靶点将有重要意义。
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然而细胞功能行为受多种因素和多种信使物质的共同制约。在普通培养基中，各种营养物质可以与相应膜受体结合，通过上述途径产生IP3和DG第二信使，以维持细胞生长和其他功能需要。此时高转移的瘤细胞比低转移的瘤细胞的IP3含量低，提示低IP3含量可能与高转移行为有关。LN和EGF均能促进某些肿瘤细胞的生长和侵袭能力[8]。但当施加LN和EGF时，MFC和MFC-2Z两种细胞IP3含量改变相反，前者升高，后者降低。因此，单凭IP3含量不足反映所有细胞的全部功能行为。也就是说，癌转移率的高低与IP3含量之间并不是简单的直接关系。
EGF是个潜在的分裂源，通过激活信号通路刺激细胞分裂增值[9]，通过影响微管形成、组织型胞浆素的产生等诱发运动和水解，促进侵袭和转移[10]。因此，在加进EGF时，高转移能力的MFC-A6比低转移能力的MFC-B3细胞侵袭matrigel能力均有提高，但后者比前者提高更显著，推测其机制是后者受EGF影响产生更多的IP3，有利于其侵袭功能的发挥。从IP3产量的改变和侵袭功能增强来看，低转移能力的癌细胞比高转移者对EGF的反应更强烈，说明前者有待提高的潜能比后者大。 本课题为国家自然科学基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1 Cole K, Kohn D. Calcium-mediated signal transduction: biology, biochemistry and therapy. Ca metastasis Rev, 1994, 13：31.
2 Xia H, Turner T, Wang MH, et al. In vitro invasiveness of DU-145 human prostate carcinoma cells is modulated by EGF receptor-mediated signals. Clin Exp Metastasis, 1995, 13：407.
3 Segall JE, Tyerech S, Boselli L, et al. EGF stimulates lamellipod extension in metastatic mammary adenocarcinoma cells by an actin-dependent mechanism. Clin Exp Metastasis, 1996, 14：61.
, http://www.100md.com
4 Mawatari M. Tumor necrosis factor and epidermal growth factor modulate migration of human microvascular endothelial cells and prododuction of tissue-type plasminogen activitor and its inhibitor. Exp Cell Res, 1991, 192：574.
5 Challiss RA, Batty IH, Nahorski SR，et al. Mass mesurements of IP3 in rat cerebral cortex slices using a radio receptor assay: effects of neurotransmitters and depolatzation. Bioch Biophys Commun, 1988, 157：684.
, http://www.100md.com
6 Palemr S, Wakelam MJO. The IP3 site of bovine adrenocortical microsomes: function and regulation. Biochem J, 1989, 260：593.
7 郁多男，高 进，汪 歇，等.人鼻咽癌CNE-Z细胞的不同转移潜能克隆株在严重联合免疫缺陷小鼠体内的检验和比较研究.解剖学报，1994， 25：166.
8 Varani J. Differential expression of laminin like substace by high and low metastatic tumor cells. Am J Pathol, 1983, 111：27.
9 Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. Annu Rev Biochem, 1979, 48：193.
10 Holting T, Siperstein AE, Clark OH, et al. EGF-and transfoming growth factor alpha-stimulated invasion and growth of follicular thyroid cancer cells can be blocked by antagonism to EGF receptor and tyrosine kinase in vitro. Eur J Endocrinol, 1995, 132：229.
(收稿：1996-09-18 修回：1997-06-01, http://www.100md.com
单位：100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院病理研究室
关键词：肿瘤转移；表皮生成因子；层粘连蛋白
中华医学杂志970909 目的 为探讨不同转移性癌细胞(MFC和CNE-2Z)不同克隆细胞株的三磷酸肌醇(IP3)含量、侵袭能力以及这些细胞对表皮生长因子(EGF)和层粘连蛋白(LN)的反应性。方法 利用放射性受体竞争结合法和人工基底膜(matrigel)侵袭试验法进行了测定。结果 显示了低转移性癌细胞比高转移性者的IP3含量高，对EGF的反应性更大，但MFC高、低转移性克隆细胞对LN的反应性差别无显著意义。而CNE-2Z高转移细胞比低转移者对LN的反应性更大。结论 说明高、低转移性癌细胞在跨膜信息传递方面存在差别，深入研究其具体机制将有重要意义。
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The amounts of inositol 1，4，5-triphosphate and it response to epidermal growth factor and laminin of carcinoma substrains with high or low metastatic potentials. Hu Xinrong, Gao jin, Li Yanxia, et al. Department of Pathology, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005.
Objective To examine the IP3 amounts, invasive potentials, and response to LN and EGF of the substrains with high or low metastatic ability from two kinds of carcinoma cell lines (MFC and CNZ-2Z). Method Radio-ligand binding assay and matrigel invasive assay. Results The low metastatic substrains from the two lines had higher amounts of IP3 and stronger response to EGF than their responsive high ones, but high metastatic substrains from CNZ-2Z had stronger response to LN than the low ones while MFC substrains had not significant difference in response to LN. Conclusion There is internal difference in signal transduction between the high and low metastatic cancer cells, and it is significant to study the difference in detail.
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Key words Neoplasia metastasis Epidermal growth factor Laminin
(Natl Med J China, 1997, 77:665-667)
表皮生长因子(EGF)和层粘连蛋白(LN)都可影响肿瘤细胞的生长和侵袭行为[1～4]，EGF主要激发膜受体的酪氨酸激酶，LN激发其膜受体并与G蛋白偶联。激活的酪氨酸激酶和G蛋白通过磷脂酶C(PLC)改变细胞内三磷酸肌醇(IP3)的含量，从而影响一系列酶促反应，以至细胞行为。我们研究了不同转移性癌细胞(MFC)和CNE-2Z不同转移能力的克隆细胞株IP3含量及对LN和EGF的反应性，以揭示转移性癌细胞在信息调控方面的内在本质。
材料和方法
一、材料
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1.细胞：小鼠前胃癌细胞系(MFC)克隆细胞株(MFC-A6/B3/B5)，人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)克隆细胞株(CNE-2Z-L2和CNE-2Z-L4)由本室建立和保存。
2.主要试剂：3H-1，4，5-IP3购自美国NEN公司，1，4，5-IP3、EGF、LN购自美国sigma公司，Boyden chamber和硝化微孔膜(13μm)为美国产品，其它试剂均为分析纯。
二、方法
1.癌细胞IP3的提取：常规培养细胞至对数生长期，消化吹打制成悬液，调整浓度至2×106个细胞/ml。在1.5ml离心管内每管加入1ml细胞悬液，每个细胞株设3管，37℃，5% CO2培养1小时，使其恢复损伤。每个细胞株分别给一管加入终浓度为3 ng/ml的EGF，另一管加入终浓度为10 ng/ml的LN，第三管加入等量生理盐水作为对照，EGF和LN的工作浓度和作用时间参照文献[1～4]。继续培养25分钟，离心3 000 r/min，5分钟，弃上清液，并用滤纸吸干残余液体。加入高氯酸0.5ml，混匀，4℃放置30分钟。用3 mol/L KOH120 μl调pH值为7.4～8.0，置4℃2小时。4℃ 1 000 g，5分钟，取上清液，-80℃保存以备测定IP3用。
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2.牛肾上腺细胞膜蛋白(IP3)受体的制备见文献[5]。
3.IP3受体放射竞争结合实验见文献[6]：由各浓度IP3标准品测得的直线回归公式为：IP3(nmol/L)=684.6×I-180.4(软件为pharmacologic caculation系统)。按公式求得各株细胞的含量。
4.癌细胞侵袭性的检测：在Boyden chamber下室加入NIH3T3细胞的条件培养液，上室加2万癌细胞，中间用涂布matrigel(500 ng/ml)的硝化微孔膜(Φ13μm)隔开。培养5小时后，用棉签去除表面的matrigel及未侵袭的癌细胞，固定，HE染色，镜检。每株细胞各作两个样本，其一在上室加EGF使其终浓度为3 ng/ml，另一加等量的生理盐水做对照。重复2次。
结果
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一、癌细胞IP3含量的测定及LN和EGF对细胞IP3含量的影响
由表1可见，不加刺激物时，MFC低转移者比高转移者IP3含量稍高，高出约20%左右；CNE-2Z低转移者比高转移者IP3含量高64%。加LN或EGF后，MFC细胞的IP3含量均增加。但CNE-2Z细胞的IP3含量均减少。加入LN，使MFC癌细胞IP3含量升高的程度与癌细胞的转移率之间的关系无明显规律性，而CNE-2Z高转移者比低转移者IP3产量的减少更明显。加入EGF后，MFC低转移者IP3产量的升高比高转移者IP3含量的升高更明显，CNE-2Z低转移者比高转移者IP3产量的减少更明显。
表1 MFC和CNE-2Z两种癌细胞系克隆株的转移率和IP3含量(nmol/L) 细胞株
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转移率
(%)
IP3含量
非刺激
LN
EGF
MFC-A6
60.0
172.8
383.7(+122%)
181.1(+5%)
MFC-B3
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0
198.2
435.1(+120%)
625.1(+215%)
MFC-B5
0
203.0
650.7(+221%)
525.4(+159%)
CNE-L2
100.0
307.7
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29.6(-90%)
301.6(-2%)
CNE-L4
13.0
504.2
444.0(-119%)
246.1(-51%)
注：+%或-%表示癌细胞受刺激后IP3含量升高或减少的程度
二、EGF对高、低转移MFC克隆细胞株侵袭能力的影响
由表2可见，MFC-A6比MFC-B3侵袭潜能强(t检验，P<0.01)。加EGF后，两株细胞对matrigel的侵袭能力均增加(P<0.01)，而以低转移MFC-B3增加显著，为119.1%，高转移MFC-A6增加31%(χ2检验，P<0.01)。
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表2 EGF对癌细胞侵袭的影响(细胞数/高倍视野) 细胞株
转移率(%)
无刺激
EGF
MFC-A6
60.0
46±7
60±5
MFC-B3
0
26±7
57±6
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讨论
IP3是跨膜信号传导中的重要的第二信使物质，它的含量改变方式及程度即可导致细胞功能行为的改变，又是细胞对胞外信号反应的反映。MFC和CNE-2Z两种细胞的不同株转移克隆细胞株为本组所建[7]。本结果表明，低转移克隆细胞株比相应高转移者的IP3含量高。提示，高、低转移能力的瘤细胞具有不同的信息调控。施加EGF后，两种瘤细胞均以低转移者的IP3含量改变更显著，低转移能力的MFC-B3比高转移者MFC-A6侵袭增强更明显，说明EGF激活的信号通路可能与肿瘤转移有关。施加LN后，MFC的高转移能力的克隆瘤细胞与低转移者IP3含量改变差别无显著意义，但高转移者的CNE-2Z克隆细胞比其低转移者IP3含量改变更明显，提示LN激活的跨膜信息传导通路可能只与某些肿瘤转移有关。
LN和EGF都可以作为细胞外配体信号。来源于同一母系的高、低转移能力的克隆细胞的跨膜信息传递差别的原因可能是这些细胞在受体、G蛋白/酪氨酸激酶和磷脂酶C等3个环节中的某一个环节存在功能或结构的差别。进一步研究清楚这些问题，对提供一个治疗干预癌转移的信息传导通路的靶点将有重要意义。
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然而细胞功能行为受多种因素和多种信使物质的共同制约。在普通培养基中，各种营养物质可以与相应膜受体结合，通过上述途径产生IP3和DG第二信使，以维持细胞生长和其他功能需要。此时高转移的瘤细胞比低转移的瘤细胞的IP3含量低，提示低IP3含量可能与高转移行为有关。LN和EGF均能促进某些肿瘤细胞的生长和侵袭能力[8]。但当施加LN和EGF时，MFC和MFC-2Z两种细胞IP3含量改变相反，前者升高，后者降低。因此，单凭IP3含量不足反映所有细胞的全部功能行为。也就是说，癌转移率的高低与IP3含量之间并不是简单的直接关系。
EGF是个潜在的分裂源，通过激活信号通路刺激细胞分裂增值[9]，通过影响微管形成、组织型胞浆素的产生等诱发运动和水解，促进侵袭和转移[10]。因此，在加进EGF时，高转移能力的MFC-A6比低转移能力的MFC-B3细胞侵袭matrigel能力均有提高，但后者比前者提高更显著，推测其机制是后者受EGF影响产生更多的IP3，有利于其侵袭功能的发挥。从IP3产量的改变和侵袭功能增强来看，低转移能力的癌细胞比高转移者对EGF的反应更强烈，说明前者有待提高的潜能比后者大。 本课题为国家自然科学基金资助项目
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参考文献
1 Cole K, Kohn D. Calcium-mediated signal transduction: biology, biochemistry and therapy. Ca metastasis Rev, 1994, 13：31.
2 Xia H, Turner T, Wang MH, et al. In vitro invasiveness of DU-145 human prostate carcinoma cells is modulated by EGF receptor-mediated signals. Clin Exp Metastasis, 1995, 13：407.
3 Segall JE, Tyerech S, Boselli L, et al. EGF stimulates lamellipod extension in metastatic mammary adenocarcinoma cells by an actin-dependent mechanism. Clin Exp Metastasis, 1996, 14：61.
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4 Mawatari M. Tumor necrosis factor and epidermal growth factor modulate migration of human microvascular endothelial cells and prododuction of tissue-type plasminogen activitor and its inhibitor. Exp Cell Res, 1991, 192：574.
5 Challiss RA, Batty IH, Nahorski SR，et al. Mass mesurements of IP3 in rat cerebral cortex slices using a radio receptor assay: effects of neurotransmitters and depolatzation. Bioch Biophys Commun, 1988, 157：684.
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6 Palemr S, Wakelam MJO. The IP3 site of bovine adrenocortical microsomes: function and regulation. Biochem J, 1989, 260：593.
7 郁多男，高 进，汪 歇，等.人鼻咽癌CNE-Z细胞的不同转移潜能克隆株在严重联合免疫缺陷小鼠体内的检验和比较研究.解剖学报，1994， 25：166.
8 Varani J. Differential expression of laminin like substace by high and low metastatic tumor cells. Am J Pathol, 1983, 111：27.
9 Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. Annu Rev Biochem, 1979, 48：193.
10 Holting T, Siperstein AE, Clark OH, et al. EGF-and transfoming growth factor alpha-stimulated invasion and growth of follicular thyroid cancer cells can be blocked by antagonism to EGF receptor and tyrosine kinase in vitro. Eur J Endocrinol, 1995, 132：229.
(收稿：1996-09-18 修回：1997-06-01, http://www.100md.com