脑胶质瘤及其颅内病变P16基因失活方式的研究
作者：何正文 夏家辉 曹 亚 刘运生 袁贤瑞 方加胜 曹美鸿
单位：410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院神经外科(何正文、刘运生、袁贤瑞、方加胜、曹美鸿)；湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室(夏家辉)，湖南医科大学肿瘤研究所(曹 亚)
关键词：
中华医学杂志970922 已有的研究认为，P16基因失活方式主要是纯合缺失，而点突变比较罕见[1]。这与原有的抑癌基因P53、Rb等的失活方式主要是点突变明显不同。这种不同究竟是P16基因的一个特点，还是研究的不完善造成的?为此，我们以P16基因在胶质瘤细胞株中突变率最高为依据，以胶质瘤为主，探讨了P16基因的点突变问题。
一、材料和方法
1.试剂：P16基因第二外显子引物为第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所提供，其序列是：5’AGCAGCATGGAGCCTTCGGCT3’；5’TTTGAAT TCAATCGGGGATGTCTG3’。本研究主要扩增P16基因第二外显子，片段长度约550 bp。
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2.标本收集处理：连续收集1994年4月～1995年3月1年内湖南医科大学附属湘雅医院神经外科住院手术的共27例胶质瘤患者的瘤组织，另收集同期其它颅内肿瘤4例，脑外伤内减压患者脑组织8例，以上3组均同时抽相应外周静脉血，均按标准方法抽提基因组高分子量DNA。
3.聚合酶链反应-单链构型多态分析(PCR-SSCP)-银染显带：PCR在25 μl反应体积中进行，内含0.25 μg模板DNA，10 mmol/L Tris。HCl(pH 8.8)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，50 μmol/L dNTP，上、下游引物各15 pmol，96℃预变性10分钟后转至72℃水浴中，加入Taq DNA聚合酶1.5U(华美公司，3 U/μl)，95℃ 1分钟，60℃1分钟，72℃1分30秒，共34次循环，最后在72℃延伸5分钟，取3 μl PCR产物上样于6%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)中电泳检测产物的量及特异性，二者均满意者进入SSCP，否则再次扩增。SSCP：取5μl PCR产物加入等体积2×甲酰胺变性染料，置80℃水浴中变性10分钟，取出立即冰浴，5分钟后上样于6%聚丙烯酰胺中性胶(29：1)中，恒压180 V电泳14～18小时，室温12～15℃下，不含甘油电泳。银染按文献[2]介绍的方法略加改进进行。
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4.统计处理：资料用四格表直接计算概率法，检验水准α=0.05，P<0.05，认为差异有显著统计学意义。
二、结果
经过近20种条件的摸索，我们在胶质瘤组中发现4/27(图1)，在非胶质瘤颅内病变组发现2/4有SSCP的泳动变位。而正常脑组织无泳动变位(图2)，提示胶质瘤及其它颅内病变存在着p16基因点突变，而正常脑组织不存在点突变，病变组与正常组比较，P=0.056。值得注意的是：各异常泳动带带型大多不同，提示突变的位点或碱基有多个。
箭头所指为异常泳动带；B：血标本；T：肿瘤标本
图1 胶质瘤组PCR-SSCP电泳结果
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无异常泳动带；B：血标本；N：正常脑组织标本；SS：单链
图2 正常脑组织组PCR-SSCP电泳结果
三、讨论
1.研究的可信度：本研究采用病例对照分析，较描述性研究更可减少病例的抽样误差，并可排除DNA序列多态。SSCP的成功首先须PCR扩增特异而高效，但本组扩增的片段GC含量达70%，PCR十分困难，为此，我们采用了正交法设计优化PCR条件得以扩增出敏感性及特异性均较好的片断(另文报道)，从而使SSCP的成功有相当保障。SSCP的另一关键因素是片断长度。以往认为>400 bp SSCP阳性率将明显下降。我们的片断较长，在实验初期也碰到这个问题。经多种条件的探索，终于得到了阳性结果，这就提示一方面已有的研究中未得出阳性结果可能与条件不合适有关，即假阴性；另一方面，今后作SSCP如片段较长，应作多种条件摸索，仍有可能得到阳性结果。本实验均经过3次以上重复，结果都类似，说明其真阳性的可能性极高。
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2.P16基因点突变的特点：关于P16基因与脑胶质瘤，作者光盘检索1996年3月以前的文献，仅有Moulton等[3]、Li等[4]、Ueki等[5]各发现1例，极低的点突变与高的纯合缺失率被认为是P16基因失活的特点。我们发现这样一个事实：即可能受p53在高病理级别胶质瘤中点突变发生率高的影响，几乎所有的P16基因研究均以高病理级别胶质瘤为主，提示，是否点突变发生率低的原因是由于肿瘤取样的病理级别不同而致?为此，我们以低病理级别胶质瘤为主，发现SSCP泳动变位(至少20%)明显高于以往所有研究，上述表明，这些泳动变位可以肯定为点突变。值得一提的是，事实上的点突变发生率理应较我们检出的高。
参考文献
1 Giani C, Finocchiaro G. Mutation rate of the CDKN2 gene in malignant gliomas. Cancer Res, 1994,54：6338.
, http://www.100md.com
2 Carlos J. Sanguinetti EDN, Andrew JG. Simpson. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Bio Techniques, 1994,17：209.
3 Moulton T. Samara G, Chung WY, et al. MTS1/P16/CDKN2 lesions in primary glioblastomas mutilforme. Am J Pathol, 1995,146：613.
4 Li YJ, Hoang XK, Delattre JY, et al. Frequent loss of heterozygosity on chromosome 9 and low incidence of mutations of cyclin-dependent Kinase inhibitors P15(MTS2) and P16(MTS1) genes in gliomas. Oncogene, 1995,11：597.
5 Ueki K, Rubio MP, Ramesh V, et al. MTS1/CDKN2 gene mutations are rare in primary human astrocytomas with allelic loss of chromosome 9p. Hum Mol Genet, 1994,3：1841.
(收稿：1996-10-25 修回：1997-04-28), http://www.100md.com
单位：410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院神经外科(何正文、刘运生、袁贤瑞、方加胜、曹美鸿)；湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室(夏家辉)，湖南医科大学肿瘤研究所(曹 亚)
关键词：
中华医学杂志970922 已有的研究认为，P16基因失活方式主要是纯合缺失，而点突变比较罕见[1]。这与原有的抑癌基因P53、Rb等的失活方式主要是点突变明显不同。这种不同究竟是P16基因的一个特点，还是研究的不完善造成的?为此，我们以P16基因在胶质瘤细胞株中突变率最高为依据，以胶质瘤为主，探讨了P16基因的点突变问题。
一、材料和方法
1.试剂：P16基因第二外显子引物为第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所提供，其序列是：5’AGCAGCATGGAGCCTTCGGCT3’；5’TTTGAAT TCAATCGGGGATGTCTG3’。本研究主要扩增P16基因第二外显子，片段长度约550 bp。
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2.标本收集处理：连续收集1994年4月～1995年3月1年内湖南医科大学附属湘雅医院神经外科住院手术的共27例胶质瘤患者的瘤组织，另收集同期其它颅内肿瘤4例，脑外伤内减压患者脑组织8例，以上3组均同时抽相应外周静脉血，均按标准方法抽提基因组高分子量DNA。
3.聚合酶链反应-单链构型多态分析(PCR-SSCP)-银染显带：PCR在25 μl反应体积中进行，内含0.25 μg模板DNA，10 mmol/L Tris。HCl(pH 8.8)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，50 μmol/L dNTP，上、下游引物各15 pmol，96℃预变性10分钟后转至72℃水浴中，加入Taq DNA聚合酶1.5U(华美公司，3 U/μl)，95℃ 1分钟，60℃1分钟，72℃1分30秒，共34次循环，最后在72℃延伸5分钟，取3 μl PCR产物上样于6%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)中电泳检测产物的量及特异性，二者均满意者进入SSCP，否则再次扩增。SSCP：取5μl PCR产物加入等体积2×甲酰胺变性染料，置80℃水浴中变性10分钟，取出立即冰浴，5分钟后上样于6%聚丙烯酰胺中性胶(29：1)中，恒压180 V电泳14～18小时，室温12～15℃下，不含甘油电泳。银染按文献[2]介绍的方法略加改进进行。
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4.统计处理：资料用四格表直接计算概率法，检验水准α=0.05，P<0.05，认为差异有显著统计学意义。
二、结果
经过近20种条件的摸索，我们在胶质瘤组中发现4/27(图1)，在非胶质瘤颅内病变组发现2/4有SSCP的泳动变位。而正常脑组织无泳动变位(图2)，提示胶质瘤及其它颅内病变存在着p16基因点突变，而正常脑组织不存在点突变，病变组与正常组比较，P=0.056。值得注意的是：各异常泳动带带型大多不同，提示突变的位点或碱基有多个。
箭头所指为异常泳动带；B：血标本；T：肿瘤标本
图1 胶质瘤组PCR-SSCP电泳结果
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无异常泳动带；B：血标本；N：正常脑组织标本；SS：单链
图2 正常脑组织组PCR-SSCP电泳结果
三、讨论
1.研究的可信度：本研究采用病例对照分析，较描述性研究更可减少病例的抽样误差，并可排除DNA序列多态。SSCP的成功首先须PCR扩增特异而高效，但本组扩增的片段GC含量达70%，PCR十分困难，为此，我们采用了正交法设计优化PCR条件得以扩增出敏感性及特异性均较好的片断(另文报道)，从而使SSCP的成功有相当保障。SSCP的另一关键因素是片断长度。以往认为>400 bp SSCP阳性率将明显下降。我们的片断较长，在实验初期也碰到这个问题。经多种条件的探索，终于得到了阳性结果，这就提示一方面已有的研究中未得出阳性结果可能与条件不合适有关，即假阴性；另一方面，今后作SSCP如片段较长，应作多种条件摸索，仍有可能得到阳性结果。本实验均经过3次以上重复，结果都类似，说明其真阳性的可能性极高。
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2.P16基因点突变的特点：关于P16基因与脑胶质瘤，作者光盘检索1996年3月以前的文献，仅有Moulton等[3]、Li等[4]、Ueki等[5]各发现1例，极低的点突变与高的纯合缺失率被认为是P16基因失活的特点。我们发现这样一个事实：即可能受p53在高病理级别胶质瘤中点突变发生率高的影响，几乎所有的P16基因研究均以高病理级别胶质瘤为主，提示，是否点突变发生率低的原因是由于肿瘤取样的病理级别不同而致?为此，我们以低病理级别胶质瘤为主，发现SSCP泳动变位(至少20%)明显高于以往所有研究，上述表明，这些泳动变位可以肯定为点突变。值得一提的是，事实上的点突变发生率理应较我们检出的高。
参考文献
1 Giani C, Finocchiaro G. Mutation rate of the CDKN2 gene in malignant gliomas. Cancer Res, 1994,54：6338.
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2 Carlos J. Sanguinetti EDN, Andrew JG. Simpson. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Bio Techniques, 1994,17：209.
3 Moulton T. Samara G, Chung WY, et al. MTS1/P16/CDKN2 lesions in primary glioblastomas mutilforme. Am J Pathol, 1995,146：613.
4 Li YJ, Hoang XK, Delattre JY, et al. Frequent loss of heterozygosity on chromosome 9 and low incidence of mutations of cyclin-dependent Kinase inhibitors P15(MTS2) and P16(MTS1) genes in gliomas. Oncogene, 1995,11：597.
5 Ueki K, Rubio MP, Ramesh V, et al. MTS1/CDKN2 gene mutations are rare in primary human astrocytomas with allelic loss of chromosome 9p. Hum Mol Genet, 1994,3：1841.
(收稿：1996-10-25 修回：1997-04-28), http://www.100md.com