利用LacZ基因示踪技术观察血管紧张素Ⅱ1B受体的组织分布
作者：李文歌 陈香美
单位：100853 中国人民解放军总医院肾内科
关键词：
中华医学杂志970921 我们利用基因同源重组技术，用一个包含编码β-半乳糖苷酶(Lac Z基因)基因的血管紧张素Ⅱ1BCAT1B)同源DNA片段，置换AT1B基因的外显子序列，通过示踪基因(Reporter Gene)Lac Z产生的β-半乳糖苷酶，在蛋白质水平上观察了AT1B受体的组织分布。
一、材料和方法
1.AT1B基因同源重组小鼠的产生：通过高压电转移的方法，把一个包含Lac Z基因的置换型AT1B同源DNA片段(又称基因打靶载体)导入129/Ola系小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中。通过基因同源重组原理，置换AT1B基因的第三外显子序列，筛选鉴定发生了基因同源重组的ES细胞。通过显微注射的方法，将经过同源重 组的ES细胞克隆注射入C57BL/6系小鼠的囊胚内，随后将囊胚移植入假孕小鼠的子宫中以产生嵌合体(chimeras)小鼠。利用嵌合体小鼠进行杂交，可产生AT1B杂合突变的小鼠，再利用杂合子小鼠间进行杂交即可产生纯合突变(AT1B基因完全缺失)的小鼠。AT1B基因缺陷小鼠的鉴定通过Southern和Northern印迹杂交的方法。AT1B基因缺陷小鼠的产生原理和详细过程见文献[1，2]。
, http://www.100md.com
2.β-半乳糖苷酶显色：将正常小鼠、AT1B杂合突变和纯合突变3种小鼠的新鲜组织置于含4%多聚甲醛的PBS中，在4℃条件下固定2小时，随后切成2～3 mm厚的组织，用含0.02% NP-40和0.01%脱氧胆酸钠的PBS洗涤3次后，将组织浸入含有0.02% NP-40、0.01%脱氧胆酸钠、20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、5 mmol/L K3Fe(CN)、5 mmol/L K4Fe(CN)6和1 mg/ml Bluo-Gal(美国GIBCO公司产品)的PBS中，放置在37℃孵箱中显色2～6天。将显色完毕的组织做常规石蜡切片，进行伊红染色。
二、结果
1.AT1B受体的组织分布：通过显色示踪基因Lac Z产生的β-半乳糖苷酶，我们观察到AT1B受体主要分布在睾丸、肾上腺和蛛网膜下腔血管及侧脑室脉络膜血管上，在垂体前叶组织中也有少量存在。分别详细描述如下。(1)睾丸：AT1B受体广泛分布在睾丸组织曲细精管内的各种细胞上，随着精母细胞的逐渐成熟，AT1B受体的分布量增多，在精子细胞和较成熟的精母细胞上的分布量，显著多于精原细胞和初级精母细胞上的量。(2)肾上腺：AT1B受体局限分布在肾上腺皮质的球状带细胞上，而在束状带、网状带和髓质均未发现AT1B受体的存在。(3)脑：AT1B受体局限分布在蛛网膜下腔和侧脑室脉络膜的血管壁上，间质中也有少量的分布，而在脑实质组织中未发现AT1B受体的存在。(4)垂体：AT1B受体在垂体前叶组织的各种细胞(嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嫌色细胞)上，均有微量的分布。在心、肾、肺、卵巢等组织中未发现AT1B受体的分布。
, http://www.100md.com
三、讨论
基因同源重组是目前转基因研究中最为先进也是最为复杂的基因靶向导入技术。通过基因转染的方法，把体外人工构建的与靶基因同源的DNA片段整合入受体细胞(通常为ES细胞)的基因组DNA中，使之与靶基因进行同源重组，从而抑活原有靶基因的功能。我们利用基因同源重组技术，用一个包含LacZ基因的AT1B同源DNA片段置换了小鼠AT1B基因外显子序列，一方面抑活了AT1B基因的功能，另一方面依据导入基因的功能，观察了AT1B受体的组织分布。结果显示AT1B受体主要分布在睾丸，肾上腺球状带和侧脑室脉络膜上，在垂体前叶也有少量分布，提示在正常生理条件下AT1B受体基因在这些脏器以外的器官组织中没有或有着极其微量的蛋白质合成。
参考文献
1 Chen Xiangmei, Li Wenge, Yoshida H, et al. Targeting deletion of angiotensin type 1B receptor gene in mice. Am J Physiol. 1997,41：F299.
2 陈香美，李文歌.肾素-血管紧张素系统基因打靶研究现状.中华肾脏病杂志.1996，12：383.
(收稿：1997-02-19 修回：1997-06-01), http://www.100md.com
单位：100853 中国人民解放军总医院肾内科
关键词：
中华医学杂志970921 我们利用基因同源重组技术，用一个包含编码β-半乳糖苷酶(Lac Z基因)基因的血管紧张素Ⅱ1BCAT1B)同源DNA片段，置换AT1B基因的外显子序列，通过示踪基因(Reporter Gene)Lac Z产生的β-半乳糖苷酶，在蛋白质水平上观察了AT1B受体的组织分布。
一、材料和方法
1.AT1B基因同源重组小鼠的产生：通过高压电转移的方法，把一个包含Lac Z基因的置换型AT1B同源DNA片段(又称基因打靶载体)导入129/Ola系小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中。通过基因同源重组原理，置换AT1B基因的第三外显子序列，筛选鉴定发生了基因同源重组的ES细胞。通过显微注射的方法，将经过同源重 组的ES细胞克隆注射入C57BL/6系小鼠的囊胚内，随后将囊胚移植入假孕小鼠的子宫中以产生嵌合体(chimeras)小鼠。利用嵌合体小鼠进行杂交，可产生AT1B杂合突变的小鼠，再利用杂合子小鼠间进行杂交即可产生纯合突变(AT1B基因完全缺失)的小鼠。AT1B基因缺陷小鼠的鉴定通过Southern和Northern印迹杂交的方法。AT1B基因缺陷小鼠的产生原理和详细过程见文献[1，2]。
, http://www.100md.com
2.β-半乳糖苷酶显色：将正常小鼠、AT1B杂合突变和纯合突变3种小鼠的新鲜组织置于含4%多聚甲醛的PBS中，在4℃条件下固定2小时，随后切成2～3 mm厚的组织，用含0.02% NP-40和0.01%脱氧胆酸钠的PBS洗涤3次后，将组织浸入含有0.02% NP-40、0.01%脱氧胆酸钠、20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、5 mmol/L K3Fe(CN)、5 mmol/L K4Fe(CN)6和1 mg/ml Bluo-Gal(美国GIBCO公司产品)的PBS中，放置在37℃孵箱中显色2～6天。将显色完毕的组织做常规石蜡切片，进行伊红染色。
二、结果
1.AT1B受体的组织分布：通过显色示踪基因Lac Z产生的β-半乳糖苷酶，我们观察到AT1B受体主要分布在睾丸、肾上腺和蛛网膜下腔血管及侧脑室脉络膜血管上，在垂体前叶组织中也有少量存在。分别详细描述如下。(1)睾丸：AT1B受体广泛分布在睾丸组织曲细精管内的各种细胞上，随着精母细胞的逐渐成熟，AT1B受体的分布量增多，在精子细胞和较成熟的精母细胞上的分布量，显著多于精原细胞和初级精母细胞上的量。(2)肾上腺：AT1B受体局限分布在肾上腺皮质的球状带细胞上，而在束状带、网状带和髓质均未发现AT1B受体的存在。(3)脑：AT1B受体局限分布在蛛网膜下腔和侧脑室脉络膜的血管壁上，间质中也有少量的分布，而在脑实质组织中未发现AT1B受体的存在。(4)垂体：AT1B受体在垂体前叶组织的各种细胞(嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嫌色细胞)上，均有微量的分布。在心、肾、肺、卵巢等组织中未发现AT1B受体的分布。
, http://www.100md.com
三、讨论
基因同源重组是目前转基因研究中最为先进也是最为复杂的基因靶向导入技术。通过基因转染的方法，把体外人工构建的与靶基因同源的DNA片段整合入受体细胞(通常为ES细胞)的基因组DNA中，使之与靶基因进行同源重组，从而抑活原有靶基因的功能。我们利用基因同源重组技术，用一个包含LacZ基因的AT1B同源DNA片段置换了小鼠AT1B基因外显子序列，一方面抑活了AT1B基因的功能，另一方面依据导入基因的功能，观察了AT1B受体的组织分布。结果显示AT1B受体主要分布在睾丸，肾上腺球状带和侧脑室脉络膜上，在垂体前叶也有少量分布，提示在正常生理条件下AT1B受体基因在这些脏器以外的器官组织中没有或有着极其微量的蛋白质合成。
参考文献
1 Chen Xiangmei, Li Wenge, Yoshida H, et al. Targeting deletion of angiotensin type 1B receptor gene in mice. Am J Physiol. 1997,41：F299.
2 陈香美，李文歌.肾素-血管紧张素系统基因打靶研究现状.中华肾脏病杂志.1996，12：383.
(收稿：1997-02-19 修回：1997-06-01), http://www.100md.com