高转移小鼠肺癌株细胞导入人基因组DNA后的转移表型抑制
作者：陆应麟 葛学铭 付生法 王升启 陈 坤 刘 爽
单位：100850 北京基础医学研究所(陆应麟、葛学铭、付生法、陈 坤、刘 爽)；北京放射医学研究所(王升启)
关键词：肿瘤转移；基因，抑制，肿瘤；转染，聚合酶链反应
中华医学杂志971108 目的 探讨从正常人细胞基因组DNA中寻找、分离并鉴定肿瘤转移抑制基因或相应DNA序列的新途径。方法 采用体内转移灶体外再培养及硬琼脂集落克隆化筛选，获体内90%以上高转移率小鼠肺腺癌LM2细胞株；使用磷酸钙共沉淀DNA转染技术，将正常细胞人基因组DNA随机片段，导入高转移小鼠肺癌细胞株LM2后，使用有限稀释法克隆化其中形态扁平的回复突变株。为证实细胞确实含有外源人DNA序列，设计人特异性Alu引物，对回复突变细胞DNA进行Inter Alu-PCR 扩增。并以nm23为探针进行southern杂交。对其中含人DNA小鼠细胞，进行生长速率及硬琼脂集落生成率检测；最后细胞接种在裸小鼠及同系T739小鼠项背部皮下以检验其自发转移率。结果 转染细胞经筛选获8株扁平状的回复突变株，经Inter Alu-PCR 扩增发现其中的6株含特异性人DNA，southern杂交除对照 k562细胞nm23 阳性外皆为阴性。12、20、32号生长速率及硬琼脂集落生成率明显低于母细胞LM2株。12、20号与LM2母细胞接种裸鼠后，全部长瘤，其中接种12号株6只裸小鼠，1只瘤体在40天后自发吸收消退且4只肺上无转移，而接种LM2母细胞的裸鼠全部有肺转移，最多者5叶肺上有120个转移灶。此外，12，17和20号在同系T739小鼠的自发转移率，均比对照LM2低。结论 导入人正常细胞基因组DNA可对高转移小鼠肺腺癌细胞转移表型产生一定的抑制作用，分离、鉴定小鼠癌细胞中插入的外源性人DNA分子，对寻找新的肿瘤转移抑制基因有重要价值。
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Suppression of metastatic phenotype of cloned mouse lung adenocarcinoma cells by transfer of human genomic DNA Lu Yinglin, Ge Xueming, Fu Shengfa, et al. Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850
Objective To isolate and identify human sequences with metastatic suppression ability. Methods Genomic DNA fragments isolated from normal human lung tissue were transfected into cloned highly metastatic mouse lung adenocarcinoma cells together with PSV2neo as selectable marker. Results 25 transfectants were cloned in medium containing G418 and Ouabain. Eight morphologically flat revertants exhibited a more normal phenotype. six clones containing human DNA were identified by a sensitive Inter Alu-PCR method. The rate of cell growth and colony formation in agar were detected in vitro. Clone 12， 20 and 32 showed a lower ratio than maternal untransfected cells. In vivo clone 12 showed more significent less spontaneous metastases in nude mice and syngeneic T739 mouse than control group. Conclusion The results indicated that the inserted human DNA may be responsible for suppression of metastatic phenotype of mouse lung adenocarcinoma cells.
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Key words Neoplasm metastasis Genes, suppressor, tumor Transfection，PCR
(Natl Med J China, 1997, 77:829-833)
鉴于肿瘤细胞与正常细胞融合后细胞恶性表型往往受抑，启示我们将寻找转移抑制基因的目标投向正常细胞。我们将人正常细胞基因组DNA用磷酸钙共沉淀法转染高转移小鼠肺腺癌LM2细胞，发现转染后细胞的转移表型受到一定的抑制，推断其外源人DNA对此有作用；并采用人特异性Inter Alu-PCR 技术，不仅能鉴定小鼠细胞是否含有人DNA序列，而且可将人DNA从小鼠细胞中扩增及分离出来，为进一步分析其结构和功能奠定了基础。
材料与方法
一、细胞及肿瘤组织的体外培养
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1.LA-795细胞系：引自天津医药科学研究所，是具有转移特性的小鼠肺腺癌细胞系。常规培养于含15%牛血清的RPMI-1640培养液中。
2.肿瘤组织：无菌操作取自实验小鼠肿瘤转移灶(肺，淋巴结等)，剪碎后置于培养瓶内，培养条件同上，取自瘤块向四周生长的单层细胞，加0.2%胰酶消化后，扩增传代。
3.硬琼脂培养：参考Li等[1]的方法，将细胞悬液在1.2%的硬琼脂中培养，倒置显微镜下择取细胞集落于培养瓶内扩增后，再重复上述硬琼脂培养法，长成的第2轮集落，经择取扩增，并使用有限稀释法在96孔板中克隆化，筛选克隆分别编号冻存备用。
二、 动物实验
1.小鼠：T739小鼠：引自中国医学科学院肿瘤研究所，鼠龄5～7周，体重20～25g。裸小鼠：为BALB/C nu/nu，为本院实验动物中心，鼠龄4～6周，体重15～20g，于三级SPF裸鼠实验室饲养。
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2.肿瘤接种实验：将肿瘤单细胞悬液，计数后接种于小鼠项背部皮下。待瘤大超过2cm直径，或荷瘤小鼠十分孱瘦时处死解剖，各脏器常规取材，并收集颌下、腋下、鼠蹊、肠系膜及纵隔淋巴结、常规制片，分别于光镜、电镜下观察。
三、DNA转染
常规提取人肺组织基因组DNA，随机切短，与PSV2neo按照美国promega公司的Gene Profection试剂盒提供的方法和试剂，对受体细胞进行磷酸钙共沉淀法转染。以G418与Quabain双重筛选活存细胞。转染细胞的生物学检测：(1) 生长速率测定：参照刘定干等[2]建立的细胞数测定法。(2) 琼脂集落形成试验：用0.6%～0.9%琼脂，常规培养细胞，CO2培养箱中培养2周后观察，显微镜下计数。
四、小鼠细胞含人外源DNA的鉴定(采用Inter Alu-PCR方法[3，4])
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1.模板DNA的制备：采用溶胞法进行[5]。溶胞液配方如下：50mmol KCL，10mmol Tris. HCL(pH8.3)，2.5mmol MgCl2， 0.1mg/ml白明胶，0.45%NP40，0.45%吐温20，高压灭菌，冻藏。使用时，先化冻，每100μl溶液加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(事先溶于水)。
2.引物：经计算机用Goldkey软件查询并设计了带EcoRⅠ的人特异的3′Alu引物(26mer)：5′CCGAATTCAGAGCG AGACTCCGTCTC 3′[3]，与啮齿类无同源性，无发夹结构。
3.Inter Alu-PCR条件: 预变性98℃，300秒，变性94℃，60秒,延伸72℃，100秒，退火55℃，30秒，循环30～50次，使用仪器为本院研制的PTC-51B型DNA扩增仪。所用的dNTP、Taq酶及缓冲液均购于华美公司。
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4.电泳： PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳。
五、转移相关基因nm23的检测
1.探针： nm23质粒系中国医学科学院高进教授惠赠，用BamHⅠ酶切电泳，冻融法回收0.9Kb的插入片断，用32P-dATP随机引物法标记nm23随机引物试剂盒购自美国promega公司。
2.核酸杂交：将不同细胞的Inter Alu-PCR扩增产物人DNA电泳凝胶产物转在国产硝酸纤维素膜上，经常规与nm23探针southern印迹杂交后洗膜，放射自显影。
结果
一、高转移克隆化肺腺癌细胞株LM2的获得
1.淋巴结转移：LA-795小鼠肺腺癌细胞系在同系T-739小鼠皮下接种后所有9只小鼠均于7～12天长出肿瘤，平均接种1个月处死，经解剖发现，有1例右腋窝淋巴结明显肿大，切片镜下可见淋巴结皮质区大部被转移的肿瘤细胞浸润。
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2.肺转移：LA-795小鼠肺腺癌细胞系在BALB/C nu/nu裸小鼠皮下接种后的5只中有2只其肺脏表面有多数栗粒样灰白色，露滴状半透明肿瘤灶，镜下可见肿瘤转移灶多分布在肺膜下或细支气管旁，可见血管内有瘤栓，肿瘤细胞异型性明显，可见多数核分裂像。
3.体外转移灶肿瘤组织的培养与克隆化筛选：上述肺内与腋窝淋巴结转移灶组织无菌操作于体外培养，3～4天即可见有辐射状扩增的肿瘤细胞自转移灶瘤组织块向四周生长，细胞形态基本上与母系LA-795细胞相似，以梭形和圆形细胞为主，并可见印戒状圆细胞，核被挤压在一侧。来自肺及淋巴结转移灶的肿瘤细胞，经两轮硬琼脂培养，经有限稀释法筛选出6株克隆化细胞株，其中起源于肺转移灶的3株，源于淋巴结转移灶的3株(有1株污染后丢弃)，上述各株细胞体外培养半年以上，生长稳定，连续传代，各株细胞形态表现为两类：一类为短梭形，另一类为圆形，并可见由前者向后者过渡状态的细胞，可能因胞内分泌物增多而胞体由梭形变圆。
4.克隆化细胞株在裸小鼠体内的肿瘤生物学表现：将上述5株细胞分别接种于38只裸小鼠皮下，全部长出肿瘤，经显微镜检查其肺与淋巴结自发转移率如表1示：肺内转移灶与其母系LA-795内转移灶相似，淋巴结转移灶多见腋窝淋巴结的皮质区，并部分破坏髓质，肿瘤异型性高。
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表1 各组瘤细胞于不同小鼠皮下接种后的成瘤率与转移率 细胞株
接种
动物
接种
细胞数
肿瘤
成癌率
转移
率
转移部位*
LA-
795系
, http://www.100md.com T-739鼠
1×106
9/9
1/9
淋巴结(1)
LA-
795系
BALB/C裸鼠
1×106
5/5
2/5
肺(2)
, 百拇医药 PM1株
BALB/C裸鼠
1×106
7/7
5/7
肺(5)
PM2株
BALB/C裸鼠
1×106
9/9
3/9
肺(3)
, 百拇医药 PM3株
BALB/C裸鼠
1×106
9/9
5/9
肺(5)
LM2株
BALB/C裸鼠
1×106
7/7
7/7
肺(6)，淋巴结(4)
, 百拇医药
LM3株
BALB/C裸鼠
1×106
6/6
4/6
肺(4)，淋巴结(1)
* 括号内数字为转移的动物数
5.电镜检查结果：LA-795细胞系经种植于T-739或BALB/C nu/nu小鼠皮下长成肿瘤的超微结构均显示瘤细胞分化差，但仍保留腺上皮肿瘤的某些特点，如腺腔样结构，衬以长短不等的微绒毛，并偶见桥粒样结构，在胞浆内分化差的高尔基器旁可见粘液空泡和类似板层小体的脂质体，故符合小鼠肺的腺癌组织学特点。
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二、含人基因组DNA转移表型抑制的小鼠肺腺癌株细胞的筛选
将7/7高转移的小鼠肺腺癌细胞株LM2细胞作为靶细胞使用磷酸钙共沉淀法，将含未知转移抑制基因的人胚肺基因DNA与PSV2neo质粒DNA转染LM2靶细胞，经G418和Ouabain双重筛选。并进一步经2次有限稀释法克隆于4块96孔板中，获得抗G418克隆25株，其中8株在倒置显微镜下呈现明显的回复突变[2]。即：细胞呈扁平镶嵌状生长，明显不同于未转染细胞。生长缓慢，贴壁性强，折光性差等(图1，2)。
图1 未被转染的LM2培养细胞，细胞贴壁性差，呈梭形与圆形，立体感及折光性强，生长快 ×100
, 百拇医药 图2 已转染人基因组DNA并呈现回复突变的细胞，细胞贴壁性强，呈扁平镶嵌状，立体感
及折光性差，生长缓慢(转染后第四代) ×100
上述克隆进一步扩增，用Inter Alu-PCR方法[3，4]，从8株扁平回复突变克隆中筛选出6株含人DNA的细胞克隆，未转染细胞阴性(图3)。将上述克隆分别编号为12、17、20、23、32、38，进一步进行了分子生物学行为检测，细胞生长集落形成速率：12、20及32号比未转染的LM2细胞生长速率低、集落形成明显被抑制。
在BALB/C裸鼠皮下，其中接种12号株6只裸小鼠，1只瘤体在40天后自发吸收消退，接种12及20号株组自发性淋巴结转移率与对照的LM2组比较差异无显著意义，但较肺自发转移率降低差异有显著意义。其中以12号克隆株为著，4只肺无转移，而接种LM2母细胞的裸鼠全部有肺转移，最多者5叶肺上有120个转移灶。在同系T-739小鼠皮下接种，12、17及20号株自发转移率均降低，其中12号肺转移率及17及20号淋巴结转移率较对照LM2组降低明显，见表2。
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三、Southern 杂交结果
转移相关nm23基因探针与不同细胞Inter Alu-PCR扩增的人源DNA产物杂交， 除对照k562人红白血病出现阳性杂交条带外，其它6株小鼠癌细胞的人源DNA未见与nm23基因探针杂交。
12、13、17、18、20、23、32及28分别为8株回复突变株细胞的编号；a:k562(人)阳性对照；
b:LM2(小鼠)阴性对照。13及18电泳呈阴性，其余均阳性
图3 Inter Alu-PCR扩增的不同细胞DNA样品凝胶电泳图
表2 含外源人DNA小鼠肺癌细胞株接种T-739同系小鼠皮下成瘤与转移情况 细胞
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成瘤
率
转移
率△
肺叶转移情况
淋巴结转移情况
肺叶数
%
淋巴结数
%
LM2*
11/11
9/11
, 百拇医药
39
70
28
45
12
10/10
6/10
7
14
13
17
17
10/10
, 百拇医药 4/8
6
15
5
9
20
10/10
3/9
10
22
5
7
注：* 不含外源人DNA小鼠高转移肺腺癌细胞株对照；△ 肺、淋巴结有转移的小鼠数/荷瘤小鼠数
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讨论
肿瘤转移的分子机理可能由与肿瘤细胞某些基因表达异常而具有转移能力。即可因促进转移的基因( 如某些癌基因)过度表达，也可因转移抑制基因的丢失或功能失活所致。人正常基因组DNA中含有稳定细胞防止转移的基因或调控序列， 这从肿瘤细胞与正常细胞融合杂交后部分丧失其恶性表型得到间接证明，但受当前技术水平的限制而对其结构和功能缺乏足够的认识。
Weissman 1995年率先提出的表型克隆概念是分子遗传学观念上的一次更新[6]，即设想在无须了解基因在染色体上的精确位置及其确切功能的前提下，对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因进行克隆分析。本研究目的在于验证人正常基因组DNA的片段导入小鼠高转移肺腺癌细胞株后能将后者转移表型抑制，产生回复突变细胞，进而为从该细胞DNA中分离插入的人外源序列进行结构和功能分析奠定基础。为此首先需选择异种高转移性靶细胞， LA-795系T-739近交系小鼠自发性肺腺癌体外连续传代细胞系，经验证其肺与淋巴结自发转移率不高且仍为异质性，因此采取体内外一系列方法使之单克隆化并提高转移率。本实验中提高肿瘤转移率的两个可行途径：第一，从体内转移灶瘤组织中分选的瘤细胞可具较高转移能力；第二，体外培养条件的改变，如使瘤细胞在高浓度(1.2%)硬琼脂培养基中培养，可筛出较高转移力的细胞株。Fidler等曾将小鼠B16黑色素瘤细胞接种同系小鼠皮下， 获肺转移灶瘤细胞，重复接种，再取转移灶瘤细胞，再重复接种，结果新代瘤细胞的转移能力比上代高，我们的结果与之相仿。因此从体内转移灶分离的瘤细胞是高转移肿瘤克隆株获得的关键。但所需时间太长。Li等[1]发现瘤细胞在硬琼脂培养基的生长与其在体内增殖浸润力相关，能在高浓度硬琼脂存活并长成集落的瘤细胞，在体内其侵袭的能力较强，其机理之一是具备高转移力的瘤细胞对生长因子等营养条件的需求不高，所以能在体内从原发灶克服重重阻力到达远隔器官，增长为转移灶，也是其在条件不利的硬琼脂中能长成集落的原因。我们正是将体内转移灶体外硬琼脂筛选相结合从一异质性瘤细胞群中筛选高转移细胞株的。
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利用小鼠高转移癌细胞株为受体细胞导入人正常基因组DNA，如进入细胞的DNA或cDNA含有抑制肿瘤转移表型的相关基因，则能够降低受染细胞的转移表型，筛选转移表型回复突变的小鼠癌细胞，采用Inter Alu-PCR分离该插入人DNA序列[3，4]，从中鉴定具转移负调控功能的人基因是条新途径。参照一些学者寻找抗癌基因的战略[2，7]，和其它表型克隆方法相比，此方法具有定向选择性，且节约时间。
总之，本实验证实导入人正常基因组DNA随机片段后，可使某些高转移小鼠肺癌细胞的转移表型发生逆转，应用Inter Alu-PCR技术可成功地将导入的人源DNA扩增分离，为进一步将该片段进行克隆鉴定及结构功能分析做准备。
参考文献
1 Li L, Price JE, Fan D,et al. Correlation of growth capacity of human tumor cells in hard agarose with their in vivo proliferative capacity at specific metastatic sites. J Natl Cancer Inst， 1989，81:1406.
, 百拇医药
2 刘定干， 王 达， 陈珍珍，等.具有抗癌活性的一个cDNA克隆.中国科学，1991，7：730-737.
3 Nelson DL, Ledbetter SA， Corbo L，et al. Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sci USA, 1989，86:6686.
4 葛学铭， 陆应麟.Alu-PCR的原理及其应用.生物技术通讯，1996，7：172.
5 Higuchi R. Perkin elmer/cetus newsletter. Amplifecations，1989，2：1.
, 百拇医药 6 Jossion JJ， Weissman SM. From mutation mapping to phenotype cloning. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：83.
7 Diathenko L， Lan YF， Campbell AP.et al. Suppression subtracyive hybridization: a methods for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probe and libraries. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：6025.
(收稿：1997-01-28 修回：1997-07-10), 百拇医药
单位：100850 北京基础医学研究所(陆应麟、葛学铭、付生法、陈 坤、刘 爽)；北京放射医学研究所(王升启)
关键词：肿瘤转移；基因，抑制，肿瘤；转染，聚合酶链反应
中华医学杂志971108 目的 探讨从正常人细胞基因组DNA中寻找、分离并鉴定肿瘤转移抑制基因或相应DNA序列的新途径。方法 采用体内转移灶体外再培养及硬琼脂集落克隆化筛选，获体内90%以上高转移率小鼠肺腺癌LM2细胞株；使用磷酸钙共沉淀DNA转染技术，将正常细胞人基因组DNA随机片段，导入高转移小鼠肺癌细胞株LM2后，使用有限稀释法克隆化其中形态扁平的回复突变株。为证实细胞确实含有外源人DNA序列，设计人特异性Alu引物，对回复突变细胞DNA进行Inter Alu-PCR 扩增。并以nm23为探针进行southern杂交。对其中含人DNA小鼠细胞，进行生长速率及硬琼脂集落生成率检测；最后细胞接种在裸小鼠及同系T739小鼠项背部皮下以检验其自发转移率。结果 转染细胞经筛选获8株扁平状的回复突变株，经Inter Alu-PCR 扩增发现其中的6株含特异性人DNA，southern杂交除对照 k562细胞nm23 阳性外皆为阴性。12、20、32号生长速率及硬琼脂集落生成率明显低于母细胞LM2株。12、20号与LM2母细胞接种裸鼠后，全部长瘤，其中接种12号株6只裸小鼠，1只瘤体在40天后自发吸收消退且4只肺上无转移，而接种LM2母细胞的裸鼠全部有肺转移，最多者5叶肺上有120个转移灶。此外，12，17和20号在同系T739小鼠的自发转移率，均比对照LM2低。结论 导入人正常细胞基因组DNA可对高转移小鼠肺腺癌细胞转移表型产生一定的抑制作用，分离、鉴定小鼠癌细胞中插入的外源性人DNA分子，对寻找新的肿瘤转移抑制基因有重要价值。
, http://www.100md.com
Suppression of metastatic phenotype of cloned mouse lung adenocarcinoma cells by transfer of human genomic DNA Lu Yinglin, Ge Xueming, Fu Shengfa, et al. Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850
Objective To isolate and identify human sequences with metastatic suppression ability. Methods Genomic DNA fragments isolated from normal human lung tissue were transfected into cloned highly metastatic mouse lung adenocarcinoma cells together with PSV2neo as selectable marker. Results 25 transfectants were cloned in medium containing G418 and Ouabain. Eight morphologically flat revertants exhibited a more normal phenotype. six clones containing human DNA were identified by a sensitive Inter Alu-PCR method. The rate of cell growth and colony formation in agar were detected in vitro. Clone 12， 20 and 32 showed a lower ratio than maternal untransfected cells. In vivo clone 12 showed more significent less spontaneous metastases in nude mice and syngeneic T739 mouse than control group. Conclusion The results indicated that the inserted human DNA may be responsible for suppression of metastatic phenotype of mouse lung adenocarcinoma cells.
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Key words Neoplasm metastasis Genes, suppressor, tumor Transfection，PCR
(Natl Med J China, 1997, 77:829-833)
鉴于肿瘤细胞与正常细胞融合后细胞恶性表型往往受抑，启示我们将寻找转移抑制基因的目标投向正常细胞。我们将人正常细胞基因组DNA用磷酸钙共沉淀法转染高转移小鼠肺腺癌LM2细胞，发现转染后细胞的转移表型受到一定的抑制，推断其外源人DNA对此有作用；并采用人特异性Inter Alu-PCR 技术，不仅能鉴定小鼠细胞是否含有人DNA序列，而且可将人DNA从小鼠细胞中扩增及分离出来，为进一步分析其结构和功能奠定了基础。
材料与方法
一、细胞及肿瘤组织的体外培养
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1.LA-795细胞系：引自天津医药科学研究所，是具有转移特性的小鼠肺腺癌细胞系。常规培养于含15%牛血清的RPMI-1640培养液中。
2.肿瘤组织：无菌操作取自实验小鼠肿瘤转移灶(肺，淋巴结等)，剪碎后置于培养瓶内，培养条件同上，取自瘤块向四周生长的单层细胞，加0.2%胰酶消化后，扩增传代。
3.硬琼脂培养：参考Li等[1]的方法，将细胞悬液在1.2%的硬琼脂中培养，倒置显微镜下择取细胞集落于培养瓶内扩增后，再重复上述硬琼脂培养法，长成的第2轮集落，经择取扩增，并使用有限稀释法在96孔板中克隆化，筛选克隆分别编号冻存备用。
二、 动物实验
1.小鼠：T739小鼠：引自中国医学科学院肿瘤研究所，鼠龄5～7周，体重20～25g。裸小鼠：为BALB/C nu/nu，为本院实验动物中心，鼠龄4～6周，体重15～20g，于三级SPF裸鼠实验室饲养。
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2.肿瘤接种实验：将肿瘤单细胞悬液，计数后接种于小鼠项背部皮下。待瘤大超过2cm直径，或荷瘤小鼠十分孱瘦时处死解剖，各脏器常规取材，并收集颌下、腋下、鼠蹊、肠系膜及纵隔淋巴结、常规制片，分别于光镜、电镜下观察。
三、DNA转染
常规提取人肺组织基因组DNA，随机切短，与PSV2neo按照美国promega公司的Gene Profection试剂盒提供的方法和试剂，对受体细胞进行磷酸钙共沉淀法转染。以G418与Quabain双重筛选活存细胞。转染细胞的生物学检测：(1) 生长速率测定：参照刘定干等[2]建立的细胞数测定法。(2) 琼脂集落形成试验：用0.6%～0.9%琼脂，常规培养细胞，CO2培养箱中培养2周后观察，显微镜下计数。
四、小鼠细胞含人外源DNA的鉴定(采用Inter Alu-PCR方法[3，4])
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1.模板DNA的制备：采用溶胞法进行[5]。溶胞液配方如下：50mmol KCL，10mmol Tris. HCL(pH8.3)，2.5mmol MgCl2， 0.1mg/ml白明胶，0.45%NP40，0.45%吐温20，高压灭菌，冻藏。使用时，先化冻，每100μl溶液加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(事先溶于水)。
2.引物：经计算机用Goldkey软件查询并设计了带EcoRⅠ的人特异的3′Alu引物(26mer)：5′CCGAATTCAGAGCG AGACTCCGTCTC 3′[3]，与啮齿类无同源性，无发夹结构。
3.Inter Alu-PCR条件: 预变性98℃，300秒，变性94℃，60秒,延伸72℃，100秒，退火55℃，30秒，循环30～50次，使用仪器为本院研制的PTC-51B型DNA扩增仪。所用的dNTP、Taq酶及缓冲液均购于华美公司。
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4.电泳： PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳。
五、转移相关基因nm23的检测
1.探针： nm23质粒系中国医学科学院高进教授惠赠，用BamHⅠ酶切电泳，冻融法回收0.9Kb的插入片断，用32P-dATP随机引物法标记nm23随机引物试剂盒购自美国promega公司。
2.核酸杂交：将不同细胞的Inter Alu-PCR扩增产物人DNA电泳凝胶产物转在国产硝酸纤维素膜上，经常规与nm23探针southern印迹杂交后洗膜，放射自显影。
结果
一、高转移克隆化肺腺癌细胞株LM2的获得
1.淋巴结转移：LA-795小鼠肺腺癌细胞系在同系T-739小鼠皮下接种后所有9只小鼠均于7～12天长出肿瘤，平均接种1个月处死，经解剖发现，有1例右腋窝淋巴结明显肿大，切片镜下可见淋巴结皮质区大部被转移的肿瘤细胞浸润。
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2.肺转移：LA-795小鼠肺腺癌细胞系在BALB/C nu/nu裸小鼠皮下接种后的5只中有2只其肺脏表面有多数栗粒样灰白色，露滴状半透明肿瘤灶，镜下可见肿瘤转移灶多分布在肺膜下或细支气管旁，可见血管内有瘤栓，肿瘤细胞异型性明显，可见多数核分裂像。
3.体外转移灶肿瘤组织的培养与克隆化筛选：上述肺内与腋窝淋巴结转移灶组织无菌操作于体外培养，3～4天即可见有辐射状扩增的肿瘤细胞自转移灶瘤组织块向四周生长，细胞形态基本上与母系LA-795细胞相似，以梭形和圆形细胞为主，并可见印戒状圆细胞，核被挤压在一侧。来自肺及淋巴结转移灶的肿瘤细胞，经两轮硬琼脂培养，经有限稀释法筛选出6株克隆化细胞株，其中起源于肺转移灶的3株，源于淋巴结转移灶的3株(有1株污染后丢弃)，上述各株细胞体外培养半年以上，生长稳定，连续传代，各株细胞形态表现为两类：一类为短梭形，另一类为圆形，并可见由前者向后者过渡状态的细胞，可能因胞内分泌物增多而胞体由梭形变圆。
4.克隆化细胞株在裸小鼠体内的肿瘤生物学表现：将上述5株细胞分别接种于38只裸小鼠皮下，全部长出肿瘤，经显微镜检查其肺与淋巴结自发转移率如表1示：肺内转移灶与其母系LA-795内转移灶相似，淋巴结转移灶多见腋窝淋巴结的皮质区，并部分破坏髓质，肿瘤异型性高。
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表1 各组瘤细胞于不同小鼠皮下接种后的成瘤率与转移率 细胞株
接种
动物
接种
细胞数
肿瘤
成癌率
转移
率
转移部位*
LA-
795系
, http://www.100md.com T-739鼠
1×106
9/9
1/9
淋巴结(1)
LA-
795系
BALB/C裸鼠
1×106
5/5
2/5
肺(2)
, 百拇医药 PM1株
BALB/C裸鼠
1×106
7/7
5/7
肺(5)
PM2株
BALB/C裸鼠
1×106
9/9
3/9
肺(3)
, 百拇医药 PM3株
BALB/C裸鼠
1×106
9/9
5/9
肺(5)
LM2株
BALB/C裸鼠
1×106
7/7
7/7
肺(6)，淋巴结(4)
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LM3株
BALB/C裸鼠
1×106
6/6
4/6
肺(4)，淋巴结(1)
* 括号内数字为转移的动物数
5.电镜检查结果：LA-795细胞系经种植于T-739或BALB/C nu/nu小鼠皮下长成肿瘤的超微结构均显示瘤细胞分化差，但仍保留腺上皮肿瘤的某些特点，如腺腔样结构，衬以长短不等的微绒毛，并偶见桥粒样结构，在胞浆内分化差的高尔基器旁可见粘液空泡和类似板层小体的脂质体，故符合小鼠肺的腺癌组织学特点。
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二、含人基因组DNA转移表型抑制的小鼠肺腺癌株细胞的筛选
将7/7高转移的小鼠肺腺癌细胞株LM2细胞作为靶细胞使用磷酸钙共沉淀法，将含未知转移抑制基因的人胚肺基因DNA与PSV2neo质粒DNA转染LM2靶细胞，经G418和Ouabain双重筛选。并进一步经2次有限稀释法克隆于4块96孔板中，获得抗G418克隆25株，其中8株在倒置显微镜下呈现明显的回复突变[2]。即：细胞呈扁平镶嵌状生长，明显不同于未转染细胞。生长缓慢，贴壁性强，折光性差等(图1，2)。
图1 未被转染的LM2培养细胞，细胞贴壁性差，呈梭形与圆形，立体感及折光性强，生长快 ×100
, 百拇医药 图2 已转染人基因组DNA并呈现回复突变的细胞，细胞贴壁性强，呈扁平镶嵌状，立体感
及折光性差，生长缓慢(转染后第四代) ×100
上述克隆进一步扩增，用Inter Alu-PCR方法[3，4]，从8株扁平回复突变克隆中筛选出6株含人DNA的细胞克隆，未转染细胞阴性(图3)。将上述克隆分别编号为12、17、20、23、32、38，进一步进行了分子生物学行为检测，细胞生长集落形成速率：12、20及32号比未转染的LM2细胞生长速率低、集落形成明显被抑制。
在BALB/C裸鼠皮下，其中接种12号株6只裸小鼠，1只瘤体在40天后自发吸收消退，接种12及20号株组自发性淋巴结转移率与对照的LM2组比较差异无显著意义，但较肺自发转移率降低差异有显著意义。其中以12号克隆株为著，4只肺无转移，而接种LM2母细胞的裸鼠全部有肺转移，最多者5叶肺上有120个转移灶。在同系T-739小鼠皮下接种，12、17及20号株自发转移率均降低，其中12号肺转移率及17及20号淋巴结转移率较对照LM2组降低明显，见表2。
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三、Southern 杂交结果
转移相关nm23基因探针与不同细胞Inter Alu-PCR扩增的人源DNA产物杂交， 除对照k562人红白血病出现阳性杂交条带外，其它6株小鼠癌细胞的人源DNA未见与nm23基因探针杂交。
12、13、17、18、20、23、32及28分别为8株回复突变株细胞的编号；a:k562(人)阳性对照；
b:LM2(小鼠)阴性对照。13及18电泳呈阴性，其余均阳性
图3 Inter Alu-PCR扩增的不同细胞DNA样品凝胶电泳图
表2 含外源人DNA小鼠肺癌细胞株接种T-739同系小鼠皮下成瘤与转移情况 细胞
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成瘤
率
转移
率△
肺叶转移情况
淋巴结转移情况
肺叶数
%
淋巴结数
%
LM2*
11/11
9/11
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39
70
28
45
12
10/10
6/10
7
14
13
17
17
10/10
, 百拇医药 4/8
6
15
5
9
20
10/10
3/9
10
22
5
7
注：* 不含外源人DNA小鼠高转移肺腺癌细胞株对照；△ 肺、淋巴结有转移的小鼠数/荷瘤小鼠数
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讨论
肿瘤转移的分子机理可能由与肿瘤细胞某些基因表达异常而具有转移能力。即可因促进转移的基因( 如某些癌基因)过度表达，也可因转移抑制基因的丢失或功能失活所致。人正常基因组DNA中含有稳定细胞防止转移的基因或调控序列， 这从肿瘤细胞与正常细胞融合杂交后部分丧失其恶性表型得到间接证明，但受当前技术水平的限制而对其结构和功能缺乏足够的认识。
Weissman 1995年率先提出的表型克隆概念是分子遗传学观念上的一次更新[6]，即设想在无须了解基因在染色体上的精确位置及其确切功能的前提下，对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因进行克隆分析。本研究目的在于验证人正常基因组DNA的片段导入小鼠高转移肺腺癌细胞株后能将后者转移表型抑制，产生回复突变细胞，进而为从该细胞DNA中分离插入的人外源序列进行结构和功能分析奠定基础。为此首先需选择异种高转移性靶细胞， LA-795系T-739近交系小鼠自发性肺腺癌体外连续传代细胞系，经验证其肺与淋巴结自发转移率不高且仍为异质性，因此采取体内外一系列方法使之单克隆化并提高转移率。本实验中提高肿瘤转移率的两个可行途径：第一，从体内转移灶瘤组织中分选的瘤细胞可具较高转移能力；第二，体外培养条件的改变，如使瘤细胞在高浓度(1.2%)硬琼脂培养基中培养，可筛出较高转移力的细胞株。Fidler等曾将小鼠B16黑色素瘤细胞接种同系小鼠皮下， 获肺转移灶瘤细胞，重复接种，再取转移灶瘤细胞，再重复接种，结果新代瘤细胞的转移能力比上代高，我们的结果与之相仿。因此从体内转移灶分离的瘤细胞是高转移肿瘤克隆株获得的关键。但所需时间太长。Li等[1]发现瘤细胞在硬琼脂培养基的生长与其在体内增殖浸润力相关，能在高浓度硬琼脂存活并长成集落的瘤细胞，在体内其侵袭的能力较强，其机理之一是具备高转移力的瘤细胞对生长因子等营养条件的需求不高，所以能在体内从原发灶克服重重阻力到达远隔器官，增长为转移灶，也是其在条件不利的硬琼脂中能长成集落的原因。我们正是将体内转移灶体外硬琼脂筛选相结合从一异质性瘤细胞群中筛选高转移细胞株的。
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利用小鼠高转移癌细胞株为受体细胞导入人正常基因组DNA，如进入细胞的DNA或cDNA含有抑制肿瘤转移表型的相关基因，则能够降低受染细胞的转移表型，筛选转移表型回复突变的小鼠癌细胞，采用Inter Alu-PCR分离该插入人DNA序列[3，4]，从中鉴定具转移负调控功能的人基因是条新途径。参照一些学者寻找抗癌基因的战略[2，7]，和其它表型克隆方法相比，此方法具有定向选择性，且节约时间。
总之，本实验证实导入人正常基因组DNA随机片段后，可使某些高转移小鼠肺癌细胞的转移表型发生逆转，应用Inter Alu-PCR技术可成功地将导入的人源DNA扩增分离，为进一步将该片段进行克隆鉴定及结构功能分析做准备。
参考文献
1 Li L, Price JE, Fan D,et al. Correlation of growth capacity of human tumor cells in hard agarose with their in vivo proliferative capacity at specific metastatic sites. J Natl Cancer Inst， 1989，81:1406.
, 百拇医药
2 刘定干， 王 达， 陈珍珍，等.具有抗癌活性的一个cDNA克隆.中国科学，1991，7：730-737.
3 Nelson DL, Ledbetter SA， Corbo L，et al. Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sci USA, 1989，86:6686.
4 葛学铭， 陆应麟.Alu-PCR的原理及其应用.生物技术通讯，1996，7：172.
5 Higuchi R. Perkin elmer/cetus newsletter. Amplifecations，1989，2：1.
, 百拇医药 6 Jossion JJ， Weissman SM. From mutation mapping to phenotype cloning. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：83.
7 Diathenko L， Lan YF， Campbell AP.et al. Suppression subtracyive hybridization: a methods for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probe and libraries. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：6025.
(收稿：1997-01-28 修回：1997-07-10), 百拇医药