反义RNA对培养的红系细胞βIVS-2-654 C→T基因剪接缺陷的纠正
作者：顾小锋 宫 澜 张威冰 任兆瑞 黄淑帧 曾溢滔
单位：200040 上海市儿童医院上海医学遗传研究所
关键词：RNA，反义；地中海贫血，β；剪接
中华医学杂志971105 目的 观察反义RNA A2对培养的红系细胞中βIVS-2-654C→T(β654)突变基因剪接异常的纠正作用。方法 将构建的反义核酸真核表达载体通过脂质体介导转染培养的成人红系细胞(hAE)，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)定量测定β珠蛋白mRNA及微量珠蛋白生物合成技术分析转染前后hAE细胞内珠蛋白基因表达的变化。结果 β654/β41-42基因型hAE细胞内，正常剪接的β mRNA占总β mRNA的比例从转染前的0.024上升到第8天的0.380；β654/βA基因型hAE细胞从0.396上升到0.883；与此相应，新合成的β珠蛋白链也出现升高：β654/β41-42基因型hAE细胞β/α比值从0.052升至0.359，β654/βA基因型hAE细胞从0.624升至0.820；正常人hAE细胞珠蛋白基因表达不受反义RNA的影响。结论 反义RNA A2能有效地纠正hAE细胞内β654mRNA前体异常剪接，进而明显地升高β珠蛋白链的合成，为β654地中海贫血的反义RNA治疗提供了科学依据。
, http://www.100md.com
Repair of the splicing defect of thalassemic allele β IVS-2-654 C→T in cultured human erythroid cells by antisense RNA Gu Xiaofeng, Gong Lan, Zhang Weibing, et al. Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children′s Hospital, Shanghai 200040
Objective To investigate the repair of the splicing defect of thalassemic allele β IVS-2-654 C→T (β654) in cultured human adult erythroid cells (hAE) by antisense RNA A2. Methods Vectors expressing antisense RNA fragments A2 which targeted against the aberrant splice sites of β654 pre- mRNA were introduced into hAE by lipid-mediated DNA-transfection method. Quantitation of β-globin mRNA by RT-PCR and micro-biosynthesis of globin chain assay were used to measure the expression of globin genes in hAE from day 0 to day 8 after transfection. Meanwhile, hAE transfected with random antisense sequence was used as control. Results Antisense RNA A2 treatment restored the correct splicing of β654 pre-mRNA. The proportions of correctly spliced β-globin mRNA (β/β+β*) increased from 0.024 (before transfection) to 0.380 (8th day after transfection) in hAE obtained from individual with β654/β41-42 mutations and, from 0.396 to 0.883 in hAE obtained from individual with β654/βA genotype. Correspondently, microglobin biosynthesis of chain revealed that the ratio of β/α increased from 0.052 to 0.359 in the former and, from 0.624 to 0.820 in the later case, respectively. There was no difference with or without antisense RNA A2 treatment on hAE obtained from normal controls. Conclusions Antisense RNA A2 treatment could restore efficiently the correct splicing of β654 pre-mRNA and, consequently improve the imbalance of globin chains in thalassemic cells. This method is of potential clinical interest in gene therapy of the disease.
, 百拇医药
Key words RNA, antisense Thalassemia, β Splice
(Natl Med J China, 1997, 77:815-818)
β珠蛋白基因第二内含子第654位核苷酸C→T点突变(IVS-2-654C→T，简称β654)是一种剪接缺陷性基因突变，也是中国人最常见的β地中海贫血(简称β地贫)基因突变类型之一[1]。根据该突变特点，我们构建了一个反义核酸真核表达载体pCMVA2，其表达的反义RNA A2片段能与β654位点特异结合，从而封闭β654mRNA前体异常剪接。这在非细胞系统及重组HeLa细胞内已得到证实[2]。为了探讨临床应用该反义片段治疗β654地贫的可能性，我们用脂质体方法将pCMVA2导入源自β654地贫个体的培养红系细胞(hAE)内，并分析了导入前后hAE细胞内珠蛋白基因表达变化。
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对象和方法
一、对象
重型β地贫患儿1例，7岁，男性，基因型为β654/β41-42双重杂合子(β41-42表示β珠蛋白基因外显子第41～42密码子间缺失4bp)，外周血珠蛋白链生物合成显示β+γ/α比值为0.325；另1例为该患者母亲，基因型为β654/βA杂合子，外周血珠蛋白链生物合成显示β+γ/α为0.710；对照为健康献血员2名。研究对象的β地贫基因型由本所鉴定，α基因组织结构无异常。
二、方法
1.主要试剂材料：细胞培养用的α MEM、胎牛血清、无钙镁磷酸缓冲液(PBS，pH 7.2)、脂质体购自美国Gibco公司；铁饱和转铁蛋白、重组人促红细胞生成素(rhEPO)、重组人干细胞生长因子(rhSCF)购自美国Sigma公司；二巯基乙醇购自瑞士Fluka公司，塑料培养瓶购自美国Felcon公司；β珠蛋白mRNA测定用32 P-dCTP(29.6 GBg/mol)、珠蛋白链合成测定用[3，4]3 H-L-亮氨酸(5.22 TBg/mmol)购自英国Amersham公司；反向高效液相层析分析系统(RP-HPLC)为法国Gilson公司产品。
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2.pCMVA2真核表达载体：由本所构建，pCMVA2携带的反义片段A2长207 bp，能同时封闭β654mRNA前体的5′异常剪接位点及3′隐匿剪接位点；所用的表达载体骨架pcDNA3是非病毒性人工载体，并带有一系列功能强大的元件，如hCMV启动子、牛生长激素基因(BGH)加多聚腺苷信号、SV40病毒复制子等。
3.成人外周血红系细胞液体培养：在征得研究对象同意后，取其外周血25 ml，按文献[3]方法进行红系细胞二步法液体培养。
4.细胞转染：细胞进入培养第二步第6天时，收集细胞悬液，离心后吸尽上清培养液并无菌保存。沉淀细胞经PBS洗涤2次后，细胞分为实验组及对照组2组，并按文献[4]方法分别进行脂质体转染。前者转染pCMVA2，后者转染与β654位点无关的随机片段真核表达载体。脂质体转染效率约90%。8～12小时后，分别收集细胞悬液，离心后吸弃上清液。沉淀细胞用原保存的上清培养液悬浮，并在37℃、饱和湿度及5%CO2培养箱内继续培养。
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5.β珠蛋白mRNA相对定量及微量珠蛋白生物合成分析：以细胞转染当天为0天，取适量转染前的细胞分别进行总RNA抽提、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法定量测定β珠蛋白mRNA[5]及微量珠蛋白生物合成技术分析珠蛋白[6]，计算正常剪接的β珠蛋白mRNA(β)与总β珠蛋白mRNA[正常+异常剪接的β珠蛋白mRNA，以(β+β*)表示]比值，及新合成的各珠蛋白链比值。在转染的第3、第6及第8天分别取细胞重复测定。
结果
一、反义RNA A2的细胞毒性
反义核酸真核表达载体经脂质体介导转染hAE细胞后，实验及对照组在细胞数目上差异无显著意义(P>0.05)；细胞形态学观察亦无中毒表现，表明在本实验条件下，脂质体和反义RNA A2对hAE细胞的毒性作用非常小。
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二、反义RNA作用的有效性
β654/β41～42双重杂合子hAE细胞在反义RNA A2处理后3天，正常剪接的β珠蛋白mRNA[β/(β+β*)]从转染前的0.024上升到0.115，至第8天时上升到0.380，而对照组在第8天时仅上升至0.039(图1A)；同样，β654/βA单纯杂合子hAE细胞在反义RNA A2处理后，β/(β+β*)明显升高，而对照组无明显变化(图1B)。与此同时，微量珠蛋白生物合成速率分析显示反义RNA A2处理后，β珠蛋白链合成增加，表现为β654/β41-42基因型hAE细胞β/α比值从0.052升至0.359(图2A)，β654/βA基因型hAE细胞从0.624升至0.820(图2B)，反映剪接缺陷纠正后升高的β珠蛋白mRNA具有正常的翻译功能。反义RNA对正常人hAE细胞珠蛋白基因表达无影响(图1C，图2C)。
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反之RNA A2处理时间(天)
图1 反义RNA对β654/β41-42基因型(A)、β654/βA基因型(B)及正常人
(C)hAE细胞βmRNA前体剪接的影响
反义RNA A2处理时间(天)
图2 反义RNA对β654/β41-42基因型(A)、β654/βA基因型(B)及正常人(C)hAE
细胞新合成珠蛋白链β/α比值的影响
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讨论
本研究结果显示，pCMVA2进入hAE细胞核后，转录出来的反义RNA A2与β654突变位点特异结合，迫使剪接体选择β654mRNA前体正常剪接位点，使得被转染hAE细胞内正常剪接的β珠蛋白mRNA增加；同时，增加的β珠蛋白mRNA具有正常的翻译功能，因而细胞内β珠蛋白链的合成随之增加，细胞内α与非α珠蛋白链比例失衡得到改善。进一步分析具有β654/β41-42基因型的hAE细胞经反义RNA A2处理后的结果，由于β41-42是一种β0地贫基因突变型，不产生正常β珠蛋白mRNA转录本及β珠蛋白链合成，说明检测到的正常β珠蛋白mRNA(从转染前的0.024上升到第8天的0.380)及合成的β珠蛋白链(β/α比值从0.052升至0.359)升高，都是纠正了β654珠蛋白mRNA前体异常剪接的结果。因而反义RNA A2在hAE细胞内的作用是确实有效、并具有特异性的。由于hAE细胞是源自β654地贫个体的培养原代细胞，反义RNA A2能有效纠正hAE细胞内β654基因的异常剪接，提示若将该反义RNA导入β654患者体内，有可能达到纠正β654基因异常剪接，治疗β654地贫的目的。
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脂质体对hAE细胞生长发育无明显影响。其介导的细胞转染效率高达90%，稳定转染效率为3%～4%[4]；本研究的pCMVA2表达载体采用pCDNA3为骨架，具有表达效率高、转录出的反义RNA不易受核酸酶攻击降解及具有高度自身复制能力等特点。因而转染后第8天，未观察到反义RNA A2纠正β654基因异常剪接效应的减弱。反义RNA技术治疗剪接缺陷型遗传性疾病是完全有可能的。但在正式应用于临床之前，还须进行一系列安全性检测。此外我们的反义RNA治疗策略对剪接缺陷型突变遗传病具有借鉴意义。
本课题为国家自然科学基金、上海生命科学研究中心科学基金及上海市青年科学技术启明星基金资助项目
参考文献
1 Zeng YT, Huang SZ. Disorders of haemoglobin in China. J Med Genet, 1987, 24:578.
, http://www.100md.com
2 宫 澜，孙 琼，任兆瑞，等.反义核酸对β地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究.高技术通讯，1997，7：39.
3 黄淑帧，Fibach E, 顾小锋，等.正常成人外周血红系细胞液体培养-细胞成熟分化与珠蛋白基因表达.中华血液学杂志，1995，16：403.
4 Felgner PL, Gadek TR, Holm M, et al. Lipofection: a highly efficient lipidmediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad USA, 1987, 84:7413.
5 Huang SZ, Rodgers GP, Zeng FY, et al. Diagnosis of thalassemia using cDNA amplification of circulating erythroid cell mRNA with the polymerace chian reaction. Blood, 1991, 78:2433.
6 顾小锋，黄淑帧，曾溢滔.培养成人外周血红系细胞珠蛋白生物合成研究.中华血液学杂志，1996，17：439.
(收稿：1997-01-22 修回：1997-07-29), 百拇医药
单位：200040 上海市儿童医院上海医学遗传研究所
关键词：RNA，反义；地中海贫血，β；剪接
中华医学杂志971105 目的 观察反义RNA A2对培养的红系细胞中βIVS-2-654C→T(β654)突变基因剪接异常的纠正作用。方法 将构建的反义核酸真核表达载体通过脂质体介导转染培养的成人红系细胞(hAE)，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)定量测定β珠蛋白mRNA及微量珠蛋白生物合成技术分析转染前后hAE细胞内珠蛋白基因表达的变化。结果 β654/β41-42基因型hAE细胞内，正常剪接的β mRNA占总β mRNA的比例从转染前的0.024上升到第8天的0.380；β654/βA基因型hAE细胞从0.396上升到0.883；与此相应，新合成的β珠蛋白链也出现升高：β654/β41-42基因型hAE细胞β/α比值从0.052升至0.359，β654/βA基因型hAE细胞从0.624升至0.820；正常人hAE细胞珠蛋白基因表达不受反义RNA的影响。结论 反义RNA A2能有效地纠正hAE细胞内β654mRNA前体异常剪接，进而明显地升高β珠蛋白链的合成，为β654地中海贫血的反义RNA治疗提供了科学依据。
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Repair of the splicing defect of thalassemic allele β IVS-2-654 C→T in cultured human erythroid cells by antisense RNA Gu Xiaofeng, Gong Lan, Zhang Weibing, et al. Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children′s Hospital, Shanghai 200040
Objective To investigate the repair of the splicing defect of thalassemic allele β IVS-2-654 C→T (β654) in cultured human adult erythroid cells (hAE) by antisense RNA A2. Methods Vectors expressing antisense RNA fragments A2 which targeted against the aberrant splice sites of β654 pre- mRNA were introduced into hAE by lipid-mediated DNA-transfection method. Quantitation of β-globin mRNA by RT-PCR and micro-biosynthesis of globin chain assay were used to measure the expression of globin genes in hAE from day 0 to day 8 after transfection. Meanwhile, hAE transfected with random antisense sequence was used as control. Results Antisense RNA A2 treatment restored the correct splicing of β654 pre-mRNA. The proportions of correctly spliced β-globin mRNA (β/β+β*) increased from 0.024 (before transfection) to 0.380 (8th day after transfection) in hAE obtained from individual with β654/β41-42 mutations and, from 0.396 to 0.883 in hAE obtained from individual with β654/βA genotype. Correspondently, microglobin biosynthesis of chain revealed that the ratio of β/α increased from 0.052 to 0.359 in the former and, from 0.624 to 0.820 in the later case, respectively. There was no difference with or without antisense RNA A2 treatment on hAE obtained from normal controls. Conclusions Antisense RNA A2 treatment could restore efficiently the correct splicing of β654 pre-mRNA and, consequently improve the imbalance of globin chains in thalassemic cells. This method is of potential clinical interest in gene therapy of the disease.
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Key words RNA, antisense Thalassemia, β Splice
(Natl Med J China, 1997, 77:815-818)
β珠蛋白基因第二内含子第654位核苷酸C→T点突变(IVS-2-654C→T，简称β654)是一种剪接缺陷性基因突变，也是中国人最常见的β地中海贫血(简称β地贫)基因突变类型之一[1]。根据该突变特点，我们构建了一个反义核酸真核表达载体pCMVA2，其表达的反义RNA A2片段能与β654位点特异结合，从而封闭β654mRNA前体异常剪接。这在非细胞系统及重组HeLa细胞内已得到证实[2]。为了探讨临床应用该反义片段治疗β654地贫的可能性，我们用脂质体方法将pCMVA2导入源自β654地贫个体的培养红系细胞(hAE)内，并分析了导入前后hAE细胞内珠蛋白基因表达变化。
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对象和方法
一、对象
重型β地贫患儿1例，7岁，男性，基因型为β654/β41-42双重杂合子(β41-42表示β珠蛋白基因外显子第41～42密码子间缺失4bp)，外周血珠蛋白链生物合成显示β+γ/α比值为0.325；另1例为该患者母亲，基因型为β654/βA杂合子，外周血珠蛋白链生物合成显示β+γ/α为0.710；对照为健康献血员2名。研究对象的β地贫基因型由本所鉴定，α基因组织结构无异常。
二、方法
1.主要试剂材料：细胞培养用的α MEM、胎牛血清、无钙镁磷酸缓冲液(PBS，pH 7.2)、脂质体购自美国Gibco公司；铁饱和转铁蛋白、重组人促红细胞生成素(rhEPO)、重组人干细胞生长因子(rhSCF)购自美国Sigma公司；二巯基乙醇购自瑞士Fluka公司，塑料培养瓶购自美国Felcon公司；β珠蛋白mRNA测定用32 P-dCTP(29.6 GBg/mol)、珠蛋白链合成测定用[3，4]3 H-L-亮氨酸(5.22 TBg/mmol)购自英国Amersham公司；反向高效液相层析分析系统(RP-HPLC)为法国Gilson公司产品。
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2.pCMVA2真核表达载体：由本所构建，pCMVA2携带的反义片段A2长207 bp，能同时封闭β654mRNA前体的5′异常剪接位点及3′隐匿剪接位点；所用的表达载体骨架pcDNA3是非病毒性人工载体，并带有一系列功能强大的元件，如hCMV启动子、牛生长激素基因(BGH)加多聚腺苷信号、SV40病毒复制子等。
3.成人外周血红系细胞液体培养：在征得研究对象同意后，取其外周血25 ml，按文献[3]方法进行红系细胞二步法液体培养。
4.细胞转染：细胞进入培养第二步第6天时，收集细胞悬液，离心后吸尽上清培养液并无菌保存。沉淀细胞经PBS洗涤2次后，细胞分为实验组及对照组2组，并按文献[4]方法分别进行脂质体转染。前者转染pCMVA2，后者转染与β654位点无关的随机片段真核表达载体。脂质体转染效率约90%。8～12小时后，分别收集细胞悬液，离心后吸弃上清液。沉淀细胞用原保存的上清培养液悬浮，并在37℃、饱和湿度及5%CO2培养箱内继续培养。
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5.β珠蛋白mRNA相对定量及微量珠蛋白生物合成分析：以细胞转染当天为0天，取适量转染前的细胞分别进行总RNA抽提、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法定量测定β珠蛋白mRNA[5]及微量珠蛋白生物合成技术分析珠蛋白[6]，计算正常剪接的β珠蛋白mRNA(β)与总β珠蛋白mRNA[正常+异常剪接的β珠蛋白mRNA，以(β+β*)表示]比值，及新合成的各珠蛋白链比值。在转染的第3、第6及第8天分别取细胞重复测定。
结果
一、反义RNA A2的细胞毒性
反义核酸真核表达载体经脂质体介导转染hAE细胞后，实验及对照组在细胞数目上差异无显著意义(P>0.05)；细胞形态学观察亦无中毒表现，表明在本实验条件下，脂质体和反义RNA A2对hAE细胞的毒性作用非常小。
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二、反义RNA作用的有效性
β654/β41～42双重杂合子hAE细胞在反义RNA A2处理后3天，正常剪接的β珠蛋白mRNA[β/(β+β*)]从转染前的0.024上升到0.115，至第8天时上升到0.380，而对照组在第8天时仅上升至0.039(图1A)；同样，β654/βA单纯杂合子hAE细胞在反义RNA A2处理后，β/(β+β*)明显升高，而对照组无明显变化(图1B)。与此同时，微量珠蛋白生物合成速率分析显示反义RNA A2处理后，β珠蛋白链合成增加，表现为β654/β41-42基因型hAE细胞β/α比值从0.052升至0.359(图2A)，β654/βA基因型hAE细胞从0.624升至0.820(图2B)，反映剪接缺陷纠正后升高的β珠蛋白mRNA具有正常的翻译功能。反义RNA对正常人hAE细胞珠蛋白基因表达无影响(图1C，图2C)。
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图1 反义RNA对β654/β41-42基因型(A)、β654/βA基因型(B)及正常人
(C)hAE细胞βmRNA前体剪接的影响
反义RNA A2处理时间(天)
图2 反义RNA对β654/β41-42基因型(A)、β654/βA基因型(B)及正常人(C)hAE
细胞新合成珠蛋白链β/α比值的影响
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本研究结果显示，pCMVA2进入hAE细胞核后，转录出来的反义RNA A2与β654突变位点特异结合，迫使剪接体选择β654mRNA前体正常剪接位点，使得被转染hAE细胞内正常剪接的β珠蛋白mRNA增加；同时，增加的β珠蛋白mRNA具有正常的翻译功能，因而细胞内β珠蛋白链的合成随之增加，细胞内α与非α珠蛋白链比例失衡得到改善。进一步分析具有β654/β41-42基因型的hAE细胞经反义RNA A2处理后的结果，由于β41-42是一种β0地贫基因突变型，不产生正常β珠蛋白mRNA转录本及β珠蛋白链合成，说明检测到的正常β珠蛋白mRNA(从转染前的0.024上升到第8天的0.380)及合成的β珠蛋白链(β/α比值从0.052升至0.359)升高，都是纠正了β654珠蛋白mRNA前体异常剪接的结果。因而反义RNA A2在hAE细胞内的作用是确实有效、并具有特异性的。由于hAE细胞是源自β654地贫个体的培养原代细胞，反义RNA A2能有效纠正hAE细胞内β654基因的异常剪接，提示若将该反义RNA导入β654患者体内，有可能达到纠正β654基因异常剪接，治疗β654地贫的目的。
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脂质体对hAE细胞生长发育无明显影响。其介导的细胞转染效率高达90%，稳定转染效率为3%～4%[4]；本研究的pCMVA2表达载体采用pCDNA3为骨架，具有表达效率高、转录出的反义RNA不易受核酸酶攻击降解及具有高度自身复制能力等特点。因而转染后第8天，未观察到反义RNA A2纠正β654基因异常剪接效应的减弱。反义RNA技术治疗剪接缺陷型遗传性疾病是完全有可能的。但在正式应用于临床之前，还须进行一系列安全性检测。此外我们的反义RNA治疗策略对剪接缺陷型突变遗传病具有借鉴意义。
本课题为国家自然科学基金、上海生命科学研究中心科学基金及上海市青年科学技术启明星基金资助项目
参考文献
1 Zeng YT, Huang SZ. Disorders of haemoglobin in China. J Med Genet, 1987, 24:578.
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2 宫 澜，孙 琼，任兆瑞，等.反义核酸对β地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究.高技术通讯，1997，7：39.
3 黄淑帧，Fibach E, 顾小锋，等.正常成人外周血红系细胞液体培养-细胞成熟分化与珠蛋白基因表达.中华血液学杂志，1995，16：403.
4 Felgner PL, Gadek TR, Holm M, et al. Lipofection: a highly efficient lipidmediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad USA, 1987, 84:7413.
5 Huang SZ, Rodgers GP, Zeng FY, et al. Diagnosis of thalassemia using cDNA amplification of circulating erythroid cell mRNA with the polymerace chian reaction. Blood, 1991, 78:2433.
6 顾小锋，黄淑帧，曾溢滔.培养成人外周血红系细胞珠蛋白生物合成研究.中华血液学杂志，1996，17：439.
(收稿：1997-01-22 修回：1997-07-29), 百拇医药