三种方法检测急性白血病患者多药耐药基因表达
作者：艾辉胜 杜耀斌 王桂林 楼方定 赖春宁 胡美茹 胡良平
单位：100039 北京，中国人民解放军军事医学科学院附属医院(艾辉胜、杜耀斌、王桂林)；中国人民解放军总医院(楼方定)；中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所(赖春宁、胡美茹)；军事医学科学院统计教研室(胡良平)
关键词：
中华医学杂志971122 我们联合采用链亲和素胶体金原位杂交(ISH-SAG)、抗碱性磷酸酶(APAAP)免疫细胞化学技术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，检测了54例急性白血病(AL)患者的多药耐药(MDR1)基因和P170糖蛋白(Pgp)表达，现将结果报道如下。
一、对象和方法
1.对象：全部AL54例，男33例，女21例。均符合 FAB诊断标 准并经免疫分型确诊，检测时骨髓或外周血中原 始和幼 稚细胞数均≥60%。除12例为解放军总医院提供外，其余42例均为我院住院患者。急性髓性白血病(AML)37例，急性淋巴细胞白血病(ALL)17例，初治36例，复发或难治18例。
, 百拇医药
2.方法：取白血病患者肝素抗凝骨髓或外周血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，一部分单个核细胞悬液用RT-PCR检测，另一部分离心甩片，封存在-20℃冰箱中备用。(1) 原位杂交：参见本实验室常规方法[1]；(2) 免疫细胞化学：参见本实验室常规方法[1]；(3) RT-PCR：细胞总RNA提取，用异硫氰酸胍一步法。RT-PCR反应体系及反应条件见文献[2]；(4) 诱导化疗：ALL诱导化 疗以VDLP 4周方案为主(长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶和泼尼松)；AML以DA方案(柔红霉素和阿糖胞苷)或HA(三尖杉酯碱和阿糖胞苷)7天方案为主。疗效评定按1987年全国白血病化学治疗讨论会标准；(5) 统计学处理：用SAS软件Fisher精确检验法。
二、结果
1.原位杂交检测AL的MDR1基因表达：31例(57.4%)表达MDR1基因(表1)，其 中初治AL17例(47.2%)，复发难治AL14例(77.8%)。4例正常骨髓MDR1基因表达率0%～11%，形态学观察MDR1基因阳性细胞多数为中晚幼粒细胞和淋巴细胞。
, 百拇医药
2.免疫组织化学检测AL的Pgp表达：27例(50%)表达Pgp，其中初治AL15例(41.2%)，复发难治AL12例(66.7%)。4例正常骨髓 均未检测到Pgp表达。
表1 三种方法检测急性白血病MDR1基因和Pgp表达 方法
例数
MDR1/Pgp阳性
MDR1/Pgp阴性
P值
初治
复治
初治
复治
, 百拇医药
ISH
54
17
19
14
4
0.0431
APAAP
54
15
21
12
6
, 百拇医药 0.155
RT-PCR
16
12
16
12
4
0.0644
注：ISH(原位杂交)，APAAP(抗碱性磷酸酶)；下表同表2 三种方法检测急性白血病MDR1/Pgp表达的比较 方法
例数
结果
一致
, 百拇医药
结果
不一致
符合
率(%)
ISH+RT-PCR
16
11
5
68.8
+APAAP
ISH+RT-PCR
16
14
, http://www.100md.com
2
87.5
RT-PCR+APAAP
16
12
2
75.0
ISH+APAAP*
16
12
4
75.0
3.PCR检测AL的MDR1基因表达：16例初治病例用PCR方法检测了MDR1基因，其中6例表达MDR1基因(37.5%)，其余10例未检测到MDR1基因。
, 百拇医药
4.三种方法的比较：54例AL同时用ISH-SAG和APAAP两种方法检测了MDR1/Pgp表达，其中MDR/Pgp同时阳性者24例(44.4%)，同时 阴性者20例(37.0%)，两种方法的一致率为81.2%。54例AL中16例同时用ISH，PCR和APAAP三种方法检测了MDR1/Pgp表达(表2)，三种方法均阳性者3例(18.8%)，均阴性者8例(50.0%)，三种方法的总一致率为68.8%，其中ISH-SAG与PCR一致者14例(87.5%)，ISH-SAG与APAAP和PCR与APAAP一致者均为12例(75%)。
5.MDR1表达与临床疗效：54例AL中，三种方法检测MDR1/Pgp阳性AL患者的完全缓解率为33.3%～42.3%，明显低于MDR1/Pgp阴性患者的70.4%～82.8%，差异有非常显著意义(P<0.01)。
三、讨论
关于MDR1基因的检测，文献几乎均用PCR等方法，较少见到用原位杂交检测MDR1基因的报道。Brophy等[3]用PCR、同位素ISH、Northeren blot和免疫组化等四种方法检测了36例AL的MDR1表达，结果四种方法的一致率为39%，其中RT-PCR和ISH一致率最 高达80%。Hellen等[4]用 PCR、同位素ISH、Northeren blot等八种方法检测AL的MDR1基因表达亦有类似结果。本组联合用ISH-SAG，APAAP和PCR三种方法检测MDR1/Pgp表达，有较好的一致性，其中ISH-SAG和PCR的敏感性高、特异性较强，是较可靠的两种检测方法，但ISH-SAG可以同时观察细胞形态学并精确定位，而且非同位素原位杂交更为简便实用，不需特殊设备，实验周期短。此外，曾有文献报道，正常骨髓细胞中亦可有较弱的MDR1基因表达。我们用ISH-SAG和APAAP检测了4例正常献髓员的MDR1表达，结果APAAP方法检测4例均为阴性，而ISH-SAG在3例正常骨髓中检测到了1%～11%的MDR1表达，而且形态学观察阳性细胞多数为中晚幼粒细胞和淋巴细胞。
, 百拇医药
多数学者认为，MDR1/Pgp高表达的AL预后不好[5]。本组检测MDR1/Pgp阳性组AL的完全缓解率均明显低于MDR1/Pgp阴性患者，说明ISH-SAG和PCR方法检测AL的MDR1基因表达不但有较高的敏感性和特异性，并能指导临床治疗。
本课题为全军九五医学科研基金资助项目
参考文献
1 杜耀斌，艾辉胜，王桂林，等.链亲和素-胶体金原位杂交检测急性白血病的多药耐药基因表达.实验血液学杂志，1996，3：299.
2 浦 津，刘海川，楼方定，等.急性白血病多药耐药基因表达的临床研究.中华内科杂志，1995，34：655.
3 Brophy NA, Marie JP, Rojas VA, et al. MDR1 gene expression in childhood acute lymphoblastic leukemias and lymphomas: A critical evaluation by four techniques. Leukemia, 1994, 8：327.
, http://www.100md.com
4 Hellen SL, De Boer G, Haddad G, et al. Multidrug resistance in pediatric malignancies. Hematol Oncol Cli North Am, 1995, 9：2755.
5 Pirker R, Wallner J, Geisssler K, et al. MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia. J Natl Cancer Inst, 1991, 83：708.
(收稿：1996-11-05 修回：1997-08-07), 百拇医药
单位：100039 北京，中国人民解放军军事医学科学院附属医院(艾辉胜、杜耀斌、王桂林)；中国人民解放军总医院(楼方定)；中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所(赖春宁、胡美茹)；军事医学科学院统计教研室(胡良平)
关键词：
中华医学杂志971122 我们联合采用链亲和素胶体金原位杂交(ISH-SAG)、抗碱性磷酸酶(APAAP)免疫细胞化学技术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，检测了54例急性白血病(AL)患者的多药耐药(MDR1)基因和P170糖蛋白(Pgp)表达，现将结果报道如下。
一、对象和方法
1.对象：全部AL54例，男33例，女21例。均符合 FAB诊断标 准并经免疫分型确诊，检测时骨髓或外周血中原 始和幼 稚细胞数均≥60%。除12例为解放军总医院提供外，其余42例均为我院住院患者。急性髓性白血病(AML)37例，急性淋巴细胞白血病(ALL)17例，初治36例，复发或难治18例。
, 百拇医药
2.方法：取白血病患者肝素抗凝骨髓或外周血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，一部分单个核细胞悬液用RT-PCR检测，另一部分离心甩片，封存在-20℃冰箱中备用。(1) 原位杂交：参见本实验室常规方法[1]；(2) 免疫细胞化学：参见本实验室常规方法[1]；(3) RT-PCR：细胞总RNA提取，用异硫氰酸胍一步法。RT-PCR反应体系及反应条件见文献[2]；(4) 诱导化疗：ALL诱导化 疗以VDLP 4周方案为主(长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶和泼尼松)；AML以DA方案(柔红霉素和阿糖胞苷)或HA(三尖杉酯碱和阿糖胞苷)7天方案为主。疗效评定按1987年全国白血病化学治疗讨论会标准；(5) 统计学处理：用SAS软件Fisher精确检验法。
二、结果
1.原位杂交检测AL的MDR1基因表达：31例(57.4%)表达MDR1基因(表1)，其 中初治AL17例(47.2%)，复发难治AL14例(77.8%)。4例正常骨髓MDR1基因表达率0%～11%，形态学观察MDR1基因阳性细胞多数为中晚幼粒细胞和淋巴细胞。
, 百拇医药
2.免疫组织化学检测AL的Pgp表达：27例(50%)表达Pgp，其中初治AL15例(41.2%)，复发难治AL12例(66.7%)。4例正常骨髓 均未检测到Pgp表达。
表1 三种方法检测急性白血病MDR1基因和Pgp表达 方法
例数
MDR1/Pgp阳性
MDR1/Pgp阴性
P值
初治
复治
初治
复治
, 百拇医药
ISH
54
17
19
14
4
0.0431
APAAP
54
15
21
12
6
, 百拇医药 0.155
RT-PCR
16
12
16
12
4
0.0644
注：ISH(原位杂交)，APAAP(抗碱性磷酸酶)；下表同表2 三种方法检测急性白血病MDR1/Pgp表达的比较 方法
例数
结果
一致
, 百拇医药
结果
不一致
符合
率(%)
ISH+RT-PCR
16
11
5
68.8
+APAAP
ISH+RT-PCR
16
14
, http://www.100md.com
2
87.5
RT-PCR+APAAP
16
12
2
75.0
ISH+APAAP*
16
12
4
75.0
3.PCR检测AL的MDR1基因表达：16例初治病例用PCR方法检测了MDR1基因，其中6例表达MDR1基因(37.5%)，其余10例未检测到MDR1基因。
, 百拇医药
4.三种方法的比较：54例AL同时用ISH-SAG和APAAP两种方法检测了MDR1/Pgp表达，其中MDR/Pgp同时阳性者24例(44.4%)，同时 阴性者20例(37.0%)，两种方法的一致率为81.2%。54例AL中16例同时用ISH，PCR和APAAP三种方法检测了MDR1/Pgp表达(表2)，三种方法均阳性者3例(18.8%)，均阴性者8例(50.0%)，三种方法的总一致率为68.8%，其中ISH-SAG与PCR一致者14例(87.5%)，ISH-SAG与APAAP和PCR与APAAP一致者均为12例(75%)。
5.MDR1表达与临床疗效：54例AL中，三种方法检测MDR1/Pgp阳性AL患者的完全缓解率为33.3%～42.3%，明显低于MDR1/Pgp阴性患者的70.4%～82.8%，差异有非常显著意义(P<0.01)。
三、讨论
关于MDR1基因的检测，文献几乎均用PCR等方法，较少见到用原位杂交检测MDR1基因的报道。Brophy等[3]用PCR、同位素ISH、Northeren blot和免疫组化等四种方法检测了36例AL的MDR1表达，结果四种方法的一致率为39%，其中RT-PCR和ISH一致率最 高达80%。Hellen等[4]用 PCR、同位素ISH、Northeren blot等八种方法检测AL的MDR1基因表达亦有类似结果。本组联合用ISH-SAG，APAAP和PCR三种方法检测MDR1/Pgp表达，有较好的一致性，其中ISH-SAG和PCR的敏感性高、特异性较强，是较可靠的两种检测方法，但ISH-SAG可以同时观察细胞形态学并精确定位，而且非同位素原位杂交更为简便实用，不需特殊设备，实验周期短。此外，曾有文献报道，正常骨髓细胞中亦可有较弱的MDR1基因表达。我们用ISH-SAG和APAAP检测了4例正常献髓员的MDR1表达，结果APAAP方法检测4例均为阴性，而ISH-SAG在3例正常骨髓中检测到了1%～11%的MDR1表达，而且形态学观察阳性细胞多数为中晚幼粒细胞和淋巴细胞。
, 百拇医药
多数学者认为，MDR1/Pgp高表达的AL预后不好[5]。本组检测MDR1/Pgp阳性组AL的完全缓解率均明显低于MDR1/Pgp阴性患者，说明ISH-SAG和PCR方法检测AL的MDR1基因表达不但有较高的敏感性和特异性，并能指导临床治疗。
本课题为全军九五医学科研基金资助项目
参考文献
1 杜耀斌，艾辉胜，王桂林，等.链亲和素-胶体金原位杂交检测急性白血病的多药耐药基因表达.实验血液学杂志，1996，3：299.
2 浦 津，刘海川，楼方定，等.急性白血病多药耐药基因表达的临床研究.中华内科杂志，1995，34：655.
3 Brophy NA, Marie JP, Rojas VA, et al. MDR1 gene expression in childhood acute lymphoblastic leukemias and lymphomas: A critical evaluation by four techniques. Leukemia, 1994, 8：327.
, http://www.100md.com
4 Hellen SL, De Boer G, Haddad G, et al. Multidrug resistance in pediatric malignancies. Hematol Oncol Cli North Am, 1995, 9：2755.
5 Pirker R, Wallner J, Geisssler K, et al. MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia. J Natl Cancer Inst, 1991, 83：708.
(收稿：1996-11-05 修回：1997-08-07), 百拇医药