重组人肝再生增强因子抗肝损伤作用
作者：杨晓明 王爱民 周 平 王清明 吴祖泽 贺福初
单位：100850 北京放射医学研究所(杨晓明、王清明、吴祖泽、贺福初)；北京军区252医院(王爱民)；中国人民解放军空军总医院传染科(周 平)
关键词：
中华医学杂志971118 肝再生增强因子(ALR)是从新生大鼠肝组织中克隆到的一种肝增殖刺激因子，它在体内能促进肝细胞增殖[1]，其特异mRNA的表达与大鼠肝部分切除后肝细胞DNA合成密切相关[2]，并能显著提高中毒性肝衰竭动物的存活率[3]。我们完成了ALR人类同源分子的分子克隆，通过构建真核、原核表达质粒，对人ALR的生物学活性进行了研究[4]，现报道如下。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.动物：雄性6～8周Balb/c小鼠，体重20±4g，由本院实验动物中心提供。
2.重组人ALR(rhALR)：自行构建的pBV-hALR表达菌株[5]，经诱导表达、纯化，获纯度>95%的rhALR。
3.其它材料：CCl4为北京化工厂产品，含量>99.5%；细胞增殖试剂盒购自Amersham公司；Cytox96 non-radioactive cytotoxicity assay (G1780)试剂盒，Cell Titer96 AQUEOUSMTS Reagent Powder(G5421)试剂盒购自美国Promega公司；胶原酶为美国Sigma公司产品。
4.体外CCl4肝损伤模型的建立[6]：按王宇明[7]的原位灌注法分离Balb/c小鼠肝细胞。分离的细胞用含10%小牛血清，10-9mol/L胰岛素及青霉素，链霉素的1640培养液悬浮，按每孔100μl(细胞数3×104)接种于96孔细胞培养板，37℃ 5% CO2条件下培养10小时后，换含5mmol/L CCl4，10%小牛血清及不同浓度重组人ALR的1640培养液，分别于换液后不同时间进行LDH释放实验及细胞存活状态观察。
, 百拇医药
5.乳酸脱氢酶(LDH)释放实验：于换液后不同时间收集细胞培养上清，按Cytox96Non-
Radioactive Cytotoxicity Assay操作指南进行测定。LDH释放率=(实际释放数-自然释放数 )/(最大释放数-自然释放数)。
6.细胞存活状况：采用MTS法评价肝细胞存活状况。操作过程参见操作指南。每组4孔，共3次实验，用酶联检测仪检测各孔490nm吸光度A值。
7.体内肝损伤模型的建立：首先进行预实验，依据病死率、病理改变等确定4ml/kg(1体积CCl4∶1体积豆油)为最佳致死剂量，2ml/kg为最佳致伤剂量。取40只小鼠分别一次性每只腹腔注射CCl4 4ml/kg，4小时后随机分组，每组20只，治疗组每12小时腹腔注射重组ALR(rhALR) 40μg/kg，同时设生理盐水对照组，每日记录动物死亡情况，存活超过96小时计为存活动物。共进行3批实验，以观察rhALR对CCl4中毒肝衰竭动物的救治作用。取18只小鼠，按2ml/Kg腹腔注射CCl4，4小时后随机分为3组，1组：静脉注射rhALR 10μg/kg；2组：静脉注射rhALR 40μg/kg；3组：静脉注射生理盐水；每12小时注射1次，中毒后48小时，进行DNA增殖测定，同时取外周血清测定丙氨酸转氨酶(ALT)、LDH水平；取肝组织进行病理学检查。
, 百拇医药
8.DNA增殖测定：以5-氟尿嘧啶标记法进行肝细胞增殖检测。主要过程：最后1次注射rhALR后12小时，按1.0ml/kg腹腔注射标记液，2小时后活杀动物，于肝固定部位取肝组织于甲醛溶液固定，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，系列酒精脱水后，切片以PBS液洗涤3次，抗5-氟尿嘧啶单克隆抗体室温孵育60分钟，PBS洗涤2次，切片以过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG室温孵育30分钟，洗涤3次后，显色10分钟，脱水，透明，封片，显微镜下随机挑出5个视野，计数阳性细胞。
9.病理学检查：于肝右叶固定部位取肝组织置10%甲醛溶液，常规石蜡切片，病理检查。
10.统计学处理：采用t检验方法。
二、结果
1.rhALR体外抗肝损伤作用：在原代培养肝细胞体系中加入5mmol/L CCl4模拟体内肝损伤情况，并选择LDH释放及肝细胞存活状况为指标进行了观察。结果表明rhALR对正常肝细胞LDH释放无明显影响，但具有明显抑制CCl4诱导肝细胞LDH的释放，这种作用在各个时间点均具有剂量效应正相关。为较客观评价CCl4致损后培养肝细胞的存活状况，以MTS法检测细胞存活状况。在含5mmol/L CCl4条件下，培养24小时后细胞存活数明显下降，但ALR组(除10ng/ml组外)存活数均高于对照组(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.rhALR体内抗CCl4诱导肝损伤的作用：以4ml/Kg剂量CCl4，成功诱导小鼠发生肝功能衰竭，生理盐水组存活率为10%，rhALR治疗组为30%，两组比较P<0.01；以2ml/kg剂量CCl4诱导小鼠发生实验性肝炎，并以rhALR(10μg/kg、40μg/kg)和生理盐水进行治疗，损伤后48小时，两组动物外周血ALT、LDH水平均明显升高，但ALR治疗组水平较对照组降低，其中 40μg/kg组LDH水平降低34%，ALT水平降低38.3%；光镜下未治疗组肝细胞广泛肿胀、变性，中央静脉周围可见多处坏死，10μg/kg治疗组与未治疗组比较差异明显，40μ/kg治疗组变性及坏死均较未治疗组明显减轻；免疫组织化学检测CCl4诱导肝损伤后肝细胞DNA合成状况表明ALR具有促进DNA合成的作用，见附表。
附表 rhALR对CCl4诱导实验性肝炎小鼠肝细胞DNA增殖的影响(
±s) 组别
, 百拇医药
阳性细胞数/视野
刺激指数
正常组
2.6±0.01
对照组
33.8±14.90
rhALR10μg/kg组
55.0±29.40
1.7*
rhALR40μg/kg组
158.7±61.70
4.7**
, 百拇医药
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01
三、讨论
人ALR分子量为15 000，在体内、外均能刺激肝细胞增殖，其生物活性具有热稳定性，与存在于哺乳动物幼仔肝、胚胎肝组织中的肝刺激物(HSS)极为相似[8]，但人ALR是否具有HSS样抗肝损伤作用尚不清楚。原代培养肝细胞保留了体内正常的肝特异功能，并能对多种激素和生长因子反应，因此，原代培养的肝细胞在一定程度上能反应体内情况。CCl4是一种肝毒剂，在体内、外均能引发严重的肝损伤。本实验利用CCl4诱导肝损伤模型，表明rhALR在体外能提高受损肝细胞的存活，降低CCl4诱导损伤细胞LDH的释放；在体内能提高CCl4诱导肝功能 衰竭动物的存活率，促进肝细胞DNA合成，降低动物外周血ALT、LDH水平。另外，我们还发现70%肝部分切除后大鼠肝组织ALR mRNA表达明显增加，重组ALR能促进40%肝部分切除后大鼠肝细胞DNA的合成；所以我们认为ALR不仅是一种重要的肝再生刺激因子，而且在肝损伤修复过程中有重要作用；其阻止肝细胞坏死，促进肝细胞增殖的活性很可能是治疗中毒性肝炎的机理，并有可能应用临床治疗严重肝病。
, 百拇医药
本课题为国家863高科学技术计划资助项目
参考文献
1 Hagiya M, Francavilla A, Polimene L, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91：8142.
2 杨晓明，谢 玲，吴祖泽，等.大鼠2/3肝部分切除后肝再生增强因子mRNA表达增加.生理学报，1997，5：361.
3 杨晓明，谢 玲，邱兆华，等.大鼠肝再生增强因子的cDNA克隆、表达及表达产物的生物活性研究.生物化学杂志，1997，2：130.
, 百拇医药
4 杨晓明，邱兆华，谢 玲，等.新型人肝再生增强因子的分子克隆及其性能研究.中国科学，1997；5：1.
5 杨晓明，谢 玲，吴祖泽，等.肝再生增强因子在大肠杆菌中的高效表达级生物活性研究.生物物理与生物化学学报，1997，4：414.
6 Takehara T, Nakamura T. Protective effect of hepatocyte growth factor on in vitro hepatatitis in primary cultured hepatocytes. Biomedical Res, 1991, 12：335.
7 王宇明.分离小鼠肝细胞的一种简易灌流法.中国应用生理学杂志，1993；9：65.
8 涂 强，吴祖泽.人胎肝源肝细胞生长因子生物活性研究.中国应用生理学杂志，1990，6：199.
(收稿：1997-01-06 修回：1997-08-19), 百拇医药
单位：100850 北京放射医学研究所(杨晓明、王清明、吴祖泽、贺福初)；北京军区252医院(王爱民)；中国人民解放军空军总医院传染科(周 平)
关键词：
中华医学杂志971118 肝再生增强因子(ALR)是从新生大鼠肝组织中克隆到的一种肝增殖刺激因子，它在体内能促进肝细胞增殖[1]，其特异mRNA的表达与大鼠肝部分切除后肝细胞DNA合成密切相关[2]，并能显著提高中毒性肝衰竭动物的存活率[3]。我们完成了ALR人类同源分子的分子克隆，通过构建真核、原核表达质粒，对人ALR的生物学活性进行了研究[4]，现报道如下。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.动物：雄性6～8周Balb/c小鼠，体重20±4g，由本院实验动物中心提供。
2.重组人ALR(rhALR)：自行构建的pBV-hALR表达菌株[5]，经诱导表达、纯化，获纯度>95%的rhALR。
3.其它材料：CCl4为北京化工厂产品，含量>99.5%；细胞增殖试剂盒购自Amersham公司；Cytox96 non-radioactive cytotoxicity assay (G1780)试剂盒，Cell Titer96 AQUEOUSMTS Reagent Powder(G5421)试剂盒购自美国Promega公司；胶原酶为美国Sigma公司产品。
4.体外CCl4肝损伤模型的建立[6]：按王宇明[7]的原位灌注法分离Balb/c小鼠肝细胞。分离的细胞用含10%小牛血清，10-9mol/L胰岛素及青霉素，链霉素的1640培养液悬浮，按每孔100μl(细胞数3×104)接种于96孔细胞培养板，37℃ 5% CO2条件下培养10小时后，换含5mmol/L CCl4，10%小牛血清及不同浓度重组人ALR的1640培养液，分别于换液后不同时间进行LDH释放实验及细胞存活状态观察。
, 百拇医药
5.乳酸脱氢酶(LDH)释放实验：于换液后不同时间收集细胞培养上清，按Cytox96Non-
Radioactive Cytotoxicity Assay操作指南进行测定。LDH释放率=(实际释放数-自然释放数 )/(最大释放数-自然释放数)。
6.细胞存活状况：采用MTS法评价肝细胞存活状况。操作过程参见操作指南。每组4孔，共3次实验，用酶联检测仪检测各孔490nm吸光度A值。
7.体内肝损伤模型的建立：首先进行预实验，依据病死率、病理改变等确定4ml/kg(1体积CCl4∶1体积豆油)为最佳致死剂量，2ml/kg为最佳致伤剂量。取40只小鼠分别一次性每只腹腔注射CCl4 4ml/kg，4小时后随机分组，每组20只，治疗组每12小时腹腔注射重组ALR(rhALR) 40μg/kg，同时设生理盐水对照组，每日记录动物死亡情况，存活超过96小时计为存活动物。共进行3批实验，以观察rhALR对CCl4中毒肝衰竭动物的救治作用。取18只小鼠，按2ml/Kg腹腔注射CCl4，4小时后随机分为3组，1组：静脉注射rhALR 10μg/kg；2组：静脉注射rhALR 40μg/kg；3组：静脉注射生理盐水；每12小时注射1次，中毒后48小时，进行DNA增殖测定，同时取外周血清测定丙氨酸转氨酶(ALT)、LDH水平；取肝组织进行病理学检查。
, 百拇医药
8.DNA增殖测定：以5-氟尿嘧啶标记法进行肝细胞增殖检测。主要过程：最后1次注射rhALR后12小时，按1.0ml/kg腹腔注射标记液，2小时后活杀动物，于肝固定部位取肝组织于甲醛溶液固定，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，系列酒精脱水后，切片以PBS液洗涤3次，抗5-氟尿嘧啶单克隆抗体室温孵育60分钟，PBS洗涤2次，切片以过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG室温孵育30分钟，洗涤3次后，显色10分钟，脱水，透明，封片，显微镜下随机挑出5个视野，计数阳性细胞。
9.病理学检查：于肝右叶固定部位取肝组织置10%甲醛溶液，常规石蜡切片，病理检查。
10.统计学处理：采用t检验方法。
二、结果
1.rhALR体外抗肝损伤作用：在原代培养肝细胞体系中加入5mmol/L CCl4模拟体内肝损伤情况，并选择LDH释放及肝细胞存活状况为指标进行了观察。结果表明rhALR对正常肝细胞LDH释放无明显影响，但具有明显抑制CCl4诱导肝细胞LDH的释放，这种作用在各个时间点均具有剂量效应正相关。为较客观评价CCl4致损后培养肝细胞的存活状况，以MTS法检测细胞存活状况。在含5mmol/L CCl4条件下，培养24小时后细胞存活数明显下降，但ALR组(除10ng/ml组外)存活数均高于对照组(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.rhALR体内抗CCl4诱导肝损伤的作用：以4ml/Kg剂量CCl4，成功诱导小鼠发生肝功能衰竭，生理盐水组存活率为10%，rhALR治疗组为30%，两组比较P<0.01；以2ml/kg剂量CCl4诱导小鼠发生实验性肝炎，并以rhALR(10μg/kg、40μg/kg)和生理盐水进行治疗，损伤后48小时，两组动物外周血ALT、LDH水平均明显升高，但ALR治疗组水平较对照组降低，其中 40μg/kg组LDH水平降低34%，ALT水平降低38.3%；光镜下未治疗组肝细胞广泛肿胀、变性，中央静脉周围可见多处坏死，10μg/kg治疗组与未治疗组比较差异明显，40μ/kg治疗组变性及坏死均较未治疗组明显减轻；免疫组织化学检测CCl4诱导肝损伤后肝细胞DNA合成状况表明ALR具有促进DNA合成的作用，见附表。
附表 rhALR对CCl4诱导实验性肝炎小鼠肝细胞DNA增殖的影响(
±s) 组别, 百拇医药
阳性细胞数/视野
刺激指数
正常组
2.6±0.01
对照组
33.8±14.90
rhALR10μg/kg组
55.0±29.40
1.7*
rhALR40μg/kg组
158.7±61.70
4.7**
, 百拇医药
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01
三、讨论
人ALR分子量为15 000，在体内、外均能刺激肝细胞增殖，其生物活性具有热稳定性，与存在于哺乳动物幼仔肝、胚胎肝组织中的肝刺激物(HSS)极为相似[8]，但人ALR是否具有HSS样抗肝损伤作用尚不清楚。原代培养肝细胞保留了体内正常的肝特异功能，并能对多种激素和生长因子反应，因此，原代培养的肝细胞在一定程度上能反应体内情况。CCl4是一种肝毒剂，在体内、外均能引发严重的肝损伤。本实验利用CCl4诱导肝损伤模型，表明rhALR在体外能提高受损肝细胞的存活，降低CCl4诱导损伤细胞LDH的释放；在体内能提高CCl4诱导肝功能 衰竭动物的存活率，促进肝细胞DNA合成，降低动物外周血ALT、LDH水平。另外，我们还发现70%肝部分切除后大鼠肝组织ALR mRNA表达明显增加，重组ALR能促进40%肝部分切除后大鼠肝细胞DNA的合成；所以我们认为ALR不仅是一种重要的肝再生刺激因子，而且在肝损伤修复过程中有重要作用；其阻止肝细胞坏死，促进肝细胞增殖的活性很可能是治疗中毒性肝炎的机理，并有可能应用临床治疗严重肝病。
, 百拇医药
本课题为国家863高科学技术计划资助项目
参考文献
1 Hagiya M, Francavilla A, Polimene L, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91：8142.
2 杨晓明，谢 玲，吴祖泽，等.大鼠2/3肝部分切除后肝再生增强因子mRNA表达增加.生理学报，1997，5：361.
3 杨晓明，谢 玲，邱兆华，等.大鼠肝再生增强因子的cDNA克隆、表达及表达产物的生物活性研究.生物化学杂志，1997，2：130.
, 百拇医药
4 杨晓明，邱兆华，谢 玲，等.新型人肝再生增强因子的分子克隆及其性能研究.中国科学，1997；5：1.
5 杨晓明，谢 玲，吴祖泽，等.肝再生增强因子在大肠杆菌中的高效表达级生物活性研究.生物物理与生物化学学报，1997，4：414.
6 Takehara T, Nakamura T. Protective effect of hepatocyte growth factor on in vitro hepatatitis in primary cultured hepatocytes. Biomedical Res, 1991, 12：335.
7 王宇明.分离小鼠肝细胞的一种简易灌流法.中国应用生理学杂志，1993；9：65.
8 涂 强，吴祖泽.人胎肝源肝细胞生长因子生物活性研究.中国应用生理学杂志，1990，6：199.
(收稿：1997-01-06 修回：1997-08-19), 百拇医药