聚合酶链反应快速检出耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的研究
作者：莫岚 王其南
单位：400016 重庆医科大学附属第一医院
关键词：凝固酶阴性葡萄球菌；聚合酶链反应；基因,mecA
中华传染病杂志980114
【摘要】 目的 快速检出耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌。方法 利用聚合酶链反应(PCR)检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌，建立一种从葡萄球菌中快速提取DNA方法，用粗提物为模板，检测编码耐甲氧西林葡萄球菌青霉素结合蛋白的mecA基因，扩增产物为533bp大小。结果 药敏法鉴定为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌21株，100% mecA基因阳性，23株对甲氧西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌中有9株用PCR扩增出mecA基因片段。利用r-32P标记寡核苷酸作为探针，Southern杂交结果与PCR检测结果完全一致，证实533bp片段为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因特异性片段。结论 PCR方法具有快速、敏感的优点，并能特异地检出临界(MIC=0.5～2mg/L)耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌株。
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Rapid detection of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci by using the polymerase chain reaction Mo Lan, Wang Qinan. Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University， Chongqing 400016
【Abstract】 Objective In this study, a simple and reliable method using PCR was devised to identify methicillin-resistant CNS (coagulase-negative staphylococci, CNS). Methods A rapid cell lysis procedure was established for the release of DNA from staphylococci. Using the crude extract of the strain as a template, a 533bp region of mecA gene, which was the structural gene of a low-affinity PBP2a, was amplified by PCR. Results obtained by this method were compared with those obtained by broth double-dilution MIC determination in 44 clinical isolates of CNS. Results In 21 mecA-positive CNS, all were oxacillin resistant and however, nine of 23 oxacillin-susceptilbe CNS stains were mecA positive. Southern blot analysis was used to test the PCR products of CNS, and the results of DNA hybridization accorded well with those of PCR test. Conclusion Therefore, we found that PCR could rapidly and specifically identified the oxacillin-resistant CNS strains with the borderline of MIC from 0.5～2mg/L.
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【Key words】 Coagulase-negative staphylococci Polymerase chain reaction Gene, mecA
耐甲氧西林葡萄球菌的检出率在常规培养条件和药敏试验方法中受到培养基成分，特别是NaCl含量、pH值、接种量、温育时间、温度以及培养基中是否加诱导剂等多种因素的影响[1]，从表型上进行诊断，结果有时不够准确。采用聚合酶链反应(PCR)检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negative staphylococci,CNS)主要通过扩增编码耐药菌特异的青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins, PBP)的mecA基因来鉴定该菌株是否为耐药菌，从基因序列上进行诊断。我们应用PCR对临床分离的44株CNS进行检测，并与药敏检测方法进行比较，现将结果报告如下。
材料与方法
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一、菌株
44株CNS为我院临床各科于1994年1月至1996年1月分离，并为我实验室所保存的菌种，用常规方法及生化试验重新鉴定。
二、引物的合成
寡核苷酸引物参照Murakami[2]报道的序列，委托中国科学院微生物研究所由OLIGO 1000 DNA合成仪合成，其核苷酸序列为：
primer 1: 5′ AAAATCGATGGTAAAGG-
TTGGC 3′
primer 2: 5′ AGTTCTGCAGTACCGGAT-
TTGG 3′
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probe： 5′ ATCTGTACTGGGTTAATC 3′
三、模板DNA制备
采用粗提DNA(crude extract)为模板，利用碱煮沸法(alkali-boiling method)，将平板上的单个菌落或增菌16小时的肉汤增菌液1ml放入1.5ml的Eppendorf管中离心收集细菌，用1ml TNE液(10mmol/L Tris-HCl,pH7.5,0.1mol/L NaCl,1mmol/L EDTA)洗涤，15000×g离心5分钟，沉淀悬于50μl 0.5mol/L KOH中，混匀，100°C煮沸5分钟，然后加入1mol/L Tris-HCl(pH6.76) 50μl混匀，15000×g离心5分钟，吸10μl上清液作为PCR扩增模板。PCR敏感性测定时将增菌液经10倍递减稀释后按上述方法提取DNA。
四、PCR扩增
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扩增反应总体积为50μl，其中灭菌三蒸水23μl、10×PCR反应缓冲液5μl、15mmol/L MgCl225μl、2.0mmol/L dNTP 5μl、25pmol primers各1μl、模板DNA 10μl、1.5U Taq DNA酶。置DNA热循环仪(PE公司)上进行自动化扩增反应。循环参数为94°C 30秒、55°C 30秒、73°C 100秒，共30个循环，最后一个循环于72°C延伸时间延长至5分钟。
五、扩增产物分析
采用琼脂糖凝胶电泳法，在含0.5μg/ml溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳30分钟，于紫外灯下观察结果并照相。
六、Southern杂交
用T4噬菌体多核苷酸激酶对寡核苷酸5′末端进行r-32P ATP标记，用Sephadex G-50柱纯化放射性标记探针。参照文献[3]进行杂交及放射自显影术检测。
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七、苯唑西林对CNS体外敏感度试验
采用试管双倍稀释法测定苯唑西林对CNS的最低抑菌浓度(MIC)。质控株为金葡菌ATCC25923。以MIC≥4mg/L判为耐甲氧西林CNS，MIC≤2mg/L判为甲氧西林敏感的CNS。
结 果
一、PCR扩增产物的电泳分析
mecA基因片段经PCR扩增，可见耐甲氧西林葡萄球菌株(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林CNS)扩增出一条533bp大小的DNA片段，而甲氧西林敏感的葡萄球菌及金葡菌标准株ATCC25923，均未扩增出特异长度的DNA片段，见图1，图2。
a.标准分子量(PCR Marker, 1543,994,695,515,377,237bp)， b～f.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌， g.甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌，h.金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923。
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图1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因扩增结果
a.标准分子量(×174,1353,1078,872,603,310bp),b～d.耐甲氧西林CNS，e.甲氧西林敏感CNS，f.金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923。图2 耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因扩增结果
二、PCR方法的敏感性
耐甲氧西林表皮葡萄球菌菌株经增菌(约3×108CFU/ml)后10倍递减稀释，用碱煮沸法制备模板DNA，经PCR扩增，300个细菌细胞可出现PCR阳性结果。
三、r-32P标记的探针与固定于硝酸纤维膜上的PCR扩增产物杂交结果
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杂交后经放射自显影，X光片上显示出部分耐甲氧西林CNS的mecA基因，而甲氧西林敏感的CNS及金葡菌ATCC25923未出现杂交带。即mecA基因经PCR扩增，其产物为533bp大小的DNA片段，经Southern杂交证实其为耐甲氧西林CNS特异性片段。
四、PCR方法和药敏法检测结果比较
44株CNS中，26株表皮葡萄球菌、9株腐生葡萄球菌、4株溶血葡萄球菌、4株人葡萄球菌和1株头葡萄球菌。用药敏法检出21株耐甲氧西林CNS(MIC≥4mg/L)，其PCR检测mecA基因均为阳性。对甲氧西林敏感的CNS23株中有9株PCR检出mecA基因，其中MIC=0.5mg/L1株，MIC=1mg/L 2株，MIC=2mg/L 6株。MIC<0.5mg/L的CNS 7株，PCR结果均为阴性。由此可见，对于MIC为0.5～2mg/L之间的菌株，药敏试验不太准确，需用PCR方法检测其是否为耐甲氧西林葡萄球菌。
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讨 论
大多数耐甲氧西林的CNS包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有相似的耐药机制，即低亲合力的青霉素结合蛋白PBP2a是耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药机制，mecA基因是PBP2a的结构基因，由它编码形成低亲合力的PBP2a。所以，mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药因子[4，5]。PCR方法通过直接检测细菌染色体上的mecA基因而确定该菌株是否为耐甲氧西林葡萄球菌，不受药敏试验条件的影响。并且编码PBP2a的mecA基因只存在于耐甲氧西林葡萄球菌中，因而特异性很高。本研究对44株CNS的检测发现，药敏法鉴定为耐甲氧西林的CNS 21株，PCR结果均为阳性，而敏感的CNS23株中有9株PCR结果阳性。可能是由于这些葡萄球菌虽然在体外敏感试验中对苯唑西林及其他抗生素敏感，但其染色体上却携带有mecA基因。因为在调节基因的作用特别强大而诱导剂作用较强时，尽管这些葡萄球菌含有mecA基因，mecA基因仍处于抑制状态，因而体外药敏试验呈敏感结果，而PCR结果阳性。该类细菌应视为耐甲氧西林葡萄球菌株，不能用β-内酰胺抗生素进行治疗，因为其一旦接触抗生素，即可使耐药性增加，导致治疗失败。
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PCR敏感度试验结果表明，约300个细菌细胞可呈PCR结果阳性，显示出较高的敏感性。
由于PCR具有对模板要求不高的优点，可不必事先纯化DNA，本文采用DNA快速制备方法，整个制备过程可在20分钟内完成，简单易行，从而大大缩短了检测时间，此法粗提的DNA模板用于PCR，同样取得了满意结果。使整个检测过程从模板DNA制备到PCR产物的检测，只需花费约3小时，极为简便快速。
由于甲氧西林与苯唑西林在检测耐甲氧西林葡萄球菌时有极好的相关性，且苯唑西林又有稳定、易贮存和重复性好等优点，更适合检测耐甲氧西林葡萄球菌株，故本研究用苯唑西林进行检测[6]。
参考文献
1 Canawati HN, Wiffe JL, Sapico FL. Temperature effect on the susceptibility of methicilin-resistant staphylococcus aureus to four different cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother, 1982,21:173-175.
, 百拇医药
2 Murakai K, Minamid W. Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1991, 29:2240-2244.
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. 2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Lab，1989.
4 Franciolli M, Bill J, Clauser MP, et al. Beta-lactam resistance mechanisms of methicillin-reistant S. aureus. J Infect Dis, 1991,163:514-543.
5 Matschashi M, Song MD, Ishino F, et al. Molecular cloning of thegene of a penicillin-binding protein supposed to cause high resistance to β-lactam antibiotics in S.aureus. J Bacteriol, 1986, 167:975-980.
6 朱德妹，汪复，刘陈谊，等.上海地区甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的研究.中华传染病杂志，1988,6:2-6., 百拇医药
单位：400016 重庆医科大学附属第一医院
关键词：凝固酶阴性葡萄球菌；聚合酶链反应；基因,mecA
中华传染病杂志980114
【摘要】 目的 快速检出耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌。方法 利用聚合酶链反应(PCR)检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌，建立一种从葡萄球菌中快速提取DNA方法，用粗提物为模板，检测编码耐甲氧西林葡萄球菌青霉素结合蛋白的mecA基因，扩增产物为533bp大小。结果 药敏法鉴定为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌21株，100% mecA基因阳性，23株对甲氧西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌中有9株用PCR扩增出mecA基因片段。利用r-32P标记寡核苷酸作为探针，Southern杂交结果与PCR检测结果完全一致，证实533bp片段为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因特异性片段。结论 PCR方法具有快速、敏感的优点，并能特异地检出临界(MIC=0.5～2mg/L)耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌株。
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Rapid detection of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci by using the polymerase chain reaction Mo Lan, Wang Qinan. Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University， Chongqing 400016
【Abstract】 Objective In this study, a simple and reliable method using PCR was devised to identify methicillin-resistant CNS (coagulase-negative staphylococci, CNS). Methods A rapid cell lysis procedure was established for the release of DNA from staphylococci. Using the crude extract of the strain as a template, a 533bp region of mecA gene, which was the structural gene of a low-affinity PBP2a, was amplified by PCR. Results obtained by this method were compared with those obtained by broth double-dilution MIC determination in 44 clinical isolates of CNS. Results In 21 mecA-positive CNS, all were oxacillin resistant and however, nine of 23 oxacillin-susceptilbe CNS stains were mecA positive. Southern blot analysis was used to test the PCR products of CNS, and the results of DNA hybridization accorded well with those of PCR test. Conclusion Therefore, we found that PCR could rapidly and specifically identified the oxacillin-resistant CNS strains with the borderline of MIC from 0.5～2mg/L.
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【Key words】 Coagulase-negative staphylococci Polymerase chain reaction Gene, mecA
耐甲氧西林葡萄球菌的检出率在常规培养条件和药敏试验方法中受到培养基成分，特别是NaCl含量、pH值、接种量、温育时间、温度以及培养基中是否加诱导剂等多种因素的影响[1]，从表型上进行诊断，结果有时不够准确。采用聚合酶链反应(PCR)检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negative staphylococci,CNS)主要通过扩增编码耐药菌特异的青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins, PBP)的mecA基因来鉴定该菌株是否为耐药菌，从基因序列上进行诊断。我们应用PCR对临床分离的44株CNS进行检测，并与药敏检测方法进行比较，现将结果报告如下。
材料与方法
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一、菌株
44株CNS为我院临床各科于1994年1月至1996年1月分离，并为我实验室所保存的菌种，用常规方法及生化试验重新鉴定。
二、引物的合成
寡核苷酸引物参照Murakami[2]报道的序列，委托中国科学院微生物研究所由OLIGO 1000 DNA合成仪合成，其核苷酸序列为：
primer 1: 5′ AAAATCGATGGTAAAGG-
TTGGC 3′
primer 2: 5′ AGTTCTGCAGTACCGGAT-
TTGG 3′
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probe： 5′ ATCTGTACTGGGTTAATC 3′
三、模板DNA制备
采用粗提DNA(crude extract)为模板，利用碱煮沸法(alkali-boiling method)，将平板上的单个菌落或增菌16小时的肉汤增菌液1ml放入1.5ml的Eppendorf管中离心收集细菌，用1ml TNE液(10mmol/L Tris-HCl,pH7.5,0.1mol/L NaCl,1mmol/L EDTA)洗涤，15000×g离心5分钟，沉淀悬于50μl 0.5mol/L KOH中，混匀，100°C煮沸5分钟，然后加入1mol/L Tris-HCl(pH6.76) 50μl混匀，15000×g离心5分钟，吸10μl上清液作为PCR扩增模板。PCR敏感性测定时将增菌液经10倍递减稀释后按上述方法提取DNA。
四、PCR扩增
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扩增反应总体积为50μl，其中灭菌三蒸水23μl、10×PCR反应缓冲液5μl、15mmol/L MgCl225μl、2.0mmol/L dNTP 5μl、25pmol primers各1μl、模板DNA 10μl、1.5U Taq DNA酶。置DNA热循环仪(PE公司)上进行自动化扩增反应。循环参数为94°C 30秒、55°C 30秒、73°C 100秒，共30个循环，最后一个循环于72°C延伸时间延长至5分钟。
五、扩增产物分析
采用琼脂糖凝胶电泳法，在含0.5μg/ml溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳30分钟，于紫外灯下观察结果并照相。
六、Southern杂交
用T4噬菌体多核苷酸激酶对寡核苷酸5′末端进行r-32P ATP标记，用Sephadex G-50柱纯化放射性标记探针。参照文献[3]进行杂交及放射自显影术检测。
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七、苯唑西林对CNS体外敏感度试验
采用试管双倍稀释法测定苯唑西林对CNS的最低抑菌浓度(MIC)。质控株为金葡菌ATCC25923。以MIC≥4mg/L判为耐甲氧西林CNS，MIC≤2mg/L判为甲氧西林敏感的CNS。
结 果
一、PCR扩增产物的电泳分析
mecA基因片段经PCR扩增，可见耐甲氧西林葡萄球菌株(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林CNS)扩增出一条533bp大小的DNA片段，而甲氧西林敏感的葡萄球菌及金葡菌标准株ATCC25923，均未扩增出特异长度的DNA片段，见图1，图2。
a.标准分子量(PCR Marker, 1543,994,695,515,377,237bp)， b～f.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌， g.甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌，h.金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923。
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图1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因扩增结果
a.标准分子量(×174,1353,1078,872,603,310bp),b～d.耐甲氧西林CNS，e.甲氧西林敏感CNS，f.金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923。图2 耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因扩增结果
二、PCR方法的敏感性
耐甲氧西林表皮葡萄球菌菌株经增菌(约3×108CFU/ml)后10倍递减稀释，用碱煮沸法制备模板DNA，经PCR扩增，300个细菌细胞可出现PCR阳性结果。
三、r-32P标记的探针与固定于硝酸纤维膜上的PCR扩增产物杂交结果
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杂交后经放射自显影，X光片上显示出部分耐甲氧西林CNS的mecA基因，而甲氧西林敏感的CNS及金葡菌ATCC25923未出现杂交带。即mecA基因经PCR扩增，其产物为533bp大小的DNA片段，经Southern杂交证实其为耐甲氧西林CNS特异性片段。
四、PCR方法和药敏法检测结果比较
44株CNS中，26株表皮葡萄球菌、9株腐生葡萄球菌、4株溶血葡萄球菌、4株人葡萄球菌和1株头葡萄球菌。用药敏法检出21株耐甲氧西林CNS(MIC≥4mg/L)，其PCR检测mecA基因均为阳性。对甲氧西林敏感的CNS23株中有9株PCR检出mecA基因，其中MIC=0.5mg/L1株，MIC=1mg/L 2株，MIC=2mg/L 6株。MIC<0.5mg/L的CNS 7株，PCR结果均为阴性。由此可见，对于MIC为0.5～2mg/L之间的菌株，药敏试验不太准确，需用PCR方法检测其是否为耐甲氧西林葡萄球菌。
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讨 论
大多数耐甲氧西林的CNS包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有相似的耐药机制，即低亲合力的青霉素结合蛋白PBP2a是耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药机制，mecA基因是PBP2a的结构基因，由它编码形成低亲合力的PBP2a。所以，mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药因子[4，5]。PCR方法通过直接检测细菌染色体上的mecA基因而确定该菌株是否为耐甲氧西林葡萄球菌，不受药敏试验条件的影响。并且编码PBP2a的mecA基因只存在于耐甲氧西林葡萄球菌中，因而特异性很高。本研究对44株CNS的检测发现，药敏法鉴定为耐甲氧西林的CNS 21株，PCR结果均为阳性，而敏感的CNS23株中有9株PCR结果阳性。可能是由于这些葡萄球菌虽然在体外敏感试验中对苯唑西林及其他抗生素敏感，但其染色体上却携带有mecA基因。因为在调节基因的作用特别强大而诱导剂作用较强时，尽管这些葡萄球菌含有mecA基因，mecA基因仍处于抑制状态，因而体外药敏试验呈敏感结果，而PCR结果阳性。该类细菌应视为耐甲氧西林葡萄球菌株，不能用β-内酰胺抗生素进行治疗，因为其一旦接触抗生素，即可使耐药性增加，导致治疗失败。
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PCR敏感度试验结果表明，约300个细菌细胞可呈PCR结果阳性，显示出较高的敏感性。
由于PCR具有对模板要求不高的优点，可不必事先纯化DNA，本文采用DNA快速制备方法，整个制备过程可在20分钟内完成，简单易行，从而大大缩短了检测时间，此法粗提的DNA模板用于PCR，同样取得了满意结果。使整个检测过程从模板DNA制备到PCR产物的检测，只需花费约3小时，极为简便快速。
由于甲氧西林与苯唑西林在检测耐甲氧西林葡萄球菌时有极好的相关性，且苯唑西林又有稳定、易贮存和重复性好等优点，更适合检测耐甲氧西林葡萄球菌株，故本研究用苯唑西林进行检测[6]。
参考文献
1 Canawati HN, Wiffe JL, Sapico FL. Temperature effect on the susceptibility of methicilin-resistant staphylococcus aureus to four different cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother, 1982,21:173-175.
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2 Murakai K, Minamid W. Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1991, 29:2240-2244.
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. 2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Lab，1989.
4 Franciolli M, Bill J, Clauser MP, et al. Beta-lactam resistance mechanisms of methicillin-reistant S. aureus. J Infect Dis, 1991,163:514-543.
5 Matschashi M, Song MD, Ishino F, et al. Molecular cloning of thegene of a penicillin-binding protein supposed to cause high resistance to β-lactam antibiotics in S.aureus. J Bacteriol, 1986, 167:975-980.
6 朱德妹，汪复，刘陈谊，等.上海地区甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的研究.中华传染病杂志，1988,6:2-6., 百拇医药