肝组织中丙型肝炎病毒抗原的表达及其临床意义
作者：袁和俊 胡德昌 翟为溶 徐永华 刘厚钰 George Q.W.Ye
单位：200032 上海医科大学中山医院(袁和俊、胡德昌、刘厚钅玉)；上海医科大学(翟为溶)；中国科学院上海细胞生物学研究所(徐永华)；Yes Bniotech Laboratory, Canada (George Q.W. Ye)
关键词：肝炎病毒，丙型；免疫组织化学
中华传染病杂志980103 【摘要】 目的 研究肝炎患者肝组织中丙型肝炎病毒抗原的表达及其临床意义。方法 以抗-HCV NS4 McAb对77例肝炎患者肝穿标本进行检测。结果 HCV-Ag(NS4)呈细小颗粒状位于肝细胞浆中。急慢性肝炎肝组织HCV-Ag阳性肝细胞呈散在分布；慢性重型肝炎肝内HCV-Ag阳性肝细胞呈弥漫分布。15例血清抗-HCV(+)和HCV RNA(+)患者中有12例肝HCV-Ag(+)；11例血清抗-HCV(+)而HCV RNA(-)患者中有3例肝HCV-Ag(+)。结论 肝HCV-Ag表达与血清HCV RNA关系较为密切，HCV-Ag表达与HCV致病机制有关。
, 百拇医药
Expression of hepatitis C virus nonstructure 4 antigen in liver tissue from patients with hepatitis
Yuan Hejun, Hu Dechang, Zhai Weirong, et al. Department of gastroenterology, Zhongshan hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To investigate the expression of HCV-NS4 antigen in liver tissue and its clinical significance. Methods We detected 77 liver spicimens from patients with hepatitis by immunohistochemical method with monoclonal antibody to HCV-NS4. Results HCV-Ag were presented as granule in the cytoplasm of liver cell. The HCV-Ag positive hepatocytes were found to distribute sporadically or clustering in the liver tissue from acute and chronic hepatitis patients and diffusely in the liver tissue from chronic fulminant hepatitis patients. HCV-Ag positive staining was found in liver tissue from 12 of 15 patients with both HCV-Ab and HCV RNA seropositive, whereas 3 of 11 patients with HCV-Ab seropositive only. Conclusion The results suggested that the expression of hepatic HCV-Ag had distinct relationship with the level of serum HCV RNA, and might take part in the pathogenesis of HCV.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis C virus Immunohistochemistry
丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒，其基因组由大约9 400个核苷酸组成，中间有一开读框架(ORF)，依次编码核壳体蛋白(C)，包膜蛋白(E1，E2/NS1)和非结构蛋白(NS2-5)。HCV各区段基因的克隆及表达成功使抗各组份的McAb、PcAb的制备成为可能。近年来国内[1，2]已有关于肝组织中HCV C、NS3表达状况的研究报道。我们应用抗-HCV NS4 McAb,以免疫组化方法研究肝炎患者肝内HCV-Ag表达状况及其临床意义。
材料与方法
一、病例选择
77例均为1990年1月至1995年3月中山医院住院患者，男59例，女18例。临床诊断参照1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案。血清病毒标志HBsAg、抗-HBs、抗-HBc、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc-IgM应用美国Abbott或上海科华试剂以ELISA检测。血清抗-HCV采用上海科华产品第二代试剂ELISA检测。部分病例检测HCV RNA(PCR)。所有病例均经肝穿刺活检或死后即刻肝穿刺病理诊断证实。急性丙型肝炎3例，慢性肝炎58例(包括慢性丙型肝炎29例、慢性乙型肝炎23例、非乙非丙型肝炎6例)，慢性重型肝炎16例。
, 百拇医药
二、检测方法
HCV NS4应用酶标链霉亲和素化二抗方法(LAB法)检测。鼠抗-HCV NS4 McAb(5D4)由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记链霉亲和素均为DAKO公司产品。
三、结果判断
1. 染色结果经双盲法观察。
2. HCV-Ag阳性肝细胞半定量(于高倍镜×400)：
1+：HCV-Ag阳性肝细胞偶见或少数呈散在分布，最密处<5/HP；
3+：HCV-Ag阳性肝细胞易见散在分布或灶性分布，最密处>20/HP；
2+：介于1+和3+之间最密处置5-20/HP。
, 百拇医药
3. HE切片中肝组织病变活动程度参照Kno-
dell计分法(HAI)[3]。
四、统计方法
t检验或χ2检验。
结果
一、抗-HCV阳性形态和分布及检出率
免疫组化染色显示HCV-Ag阳性染色物呈细小颗粒状弥漫或聚集成粗颗粒，乃至斑块状位于肝细胞浆中，以近核处较为多见，细胞膜和细胞核处阴性，肝窦内皮细胞、枯否细胞、胆管上皮细胞及炎症细胞均未见阳性染色(见图1、2)。
急、慢性和慢性重型肝炎肝内HCV-Ag阳性细胞检出情况见表1。其中急慢性肝炎肝组织中，HCV-Ag阳性肝细胞较少，多数呈散在或灶性分布，易见于汇管区或碎屑样坏死周围，重型肝炎患者肝内HCV-Ag阳性肝细胞多呈弥漫分布，部分坏死肝细胞中亦可见阳性染色。
, 百拇医药
图1 HCV-Ag阳性染色呈颗粒状聚结成斑块位于肝细胞浆内
图2 HCV-Ag染色阴性
表1 各型肝炎肝组织中HCV-Ag表达状况 临床诊断
受检
例数
阳性
例数
阳性染色
检出率
(%)
1+
, 百拇医药
2+
3+
急性丙型肝炎
3
2
2
0
0
66.7
慢性丙型肝炎
29
15
12
2
, 百拇医药
1
51.3
慢性乙型肝炎
23
1
1
0
0
4.3
慢性非丙非乙型肝炎
6
2
2
, 百拇医药 0
0
33.3
慢性重型肝炎
16
9
1
4
4
56.3
二、血清抗-HCV、HCV RNA与肝内HCV-Ag的关系
66例患者检测血清抗-HCV，结果显示35例血清抗-HCV阳性患者中的肝内HCV-Ag阳性19例(54.3%)，31例血清抗-HCV阴性患者中的肝内HCV-Ag阳性10例(32.3%)(P<0.05)。其中28例同时检测血清HCV RNA，结果显示15例血清抗-HCV和HCV RNA均阳性患者中的肝内HCV-Ag阳性12例，11例抗-HCV(+)而HCV RNA(-)患者中的HCV-Ag阳性3例(P<0.01)。
, 百拇医药
三、肝组织学改变与HCV-Ag
表2显示32例急慢性丙型肝炎患者不同肝组织病变类型间，肝内HCV-Ag阳性检出率差异无显著性。表3显示HCV-Ag阳性患者肝内汇管区及汇管周围炎症活动程度计分略高于HCV-Ag阴性患者，但差异无显著性。
表2 丙型肝炎肝组织不同病变类型与HCV-Ag 病理类型
受检例数
HCV-Ag阳性例数
急性肝炎
3
2
轻度慢性肝炎
7
, 百拇医药
3
中度慢性肝炎
18
10
重度慢性肝炎
3
2
肝硬化
1
0
表3 肝内HCV-Ag表达与肝组织HAI计分关系(
±s) 组别
汇管区周围炎
, http://www.100md.com
症或桥样坏死
小叶内变
性坏死
汇管区
炎症
前三项
总分
纤维化
程度
HCV-Ag(+)
2.97±1.75
2.17±1.00
2.58±1.17
, 百拇医药
7.76
1.56±1.20
HCV-Ag(-)
2.37±1.20
2.25±1.18
2.46±1.21
7.42
1.50±1.15
讨 论
国外学者[4]应用抗-HCV不同区段基因编码蛋白(E，C，NS3)的McAb检测发现其阳性产物均位于肝细胞浆中，且经连续切片观察发现HCV-Ag阳性肝细胞于肝组织中分布部位亦相同。另有学者[5]同时比较免疫组化显示HCV-Ag(C、NS3)与原位杂交显示HCV RNA正负链，发现两者在肝中分布规律亦相同；国内学者[1，2]报道HCV C或NS3抗原呈颗粒状位于胞浆内；本研究中我们应用抗-HCV NS4 McAb检测肝炎肝组织，发现HCV-Ag(NS4)分布于肝细胞浆中，其阳性染色形态及分布特征与国内外多数学者报道结果相符，提示可用抗-HCV单个组份蛋白的McAb或PcAb检测HCV的存在。
, 百拇医药
本组15例血清抗-HCV和HCV RNA均阳性患者中的12例(80%)肝内HCV-Ag阳性，11例抗-HCV(+)而HCV RNA(-)患者中的3例(27.3%)HCV-Ag阳性，提示血清HCV RNA水平与肝内HCV-Ag表达关系较为密切。此与国外学者[6]报道一致。但并非血清HCV RNA结果总与肝内HCV-Ag表达状况相一致，本组中3例血清HCV RNA阳性而肝内HCV-Ag阴性。这可能由于：(1) 肝内HCV-Ag分布不均匀或表达量低于检测极限；(2) HCV型或亚型不同，其抗原性亦不同；(3) HCV高度高异性，新出现变异株与原先优势病毒株在慢性感染过程中相互消长[7]，肝内HCV-Ag表达与血清HCV RNA水平出现时间上交错。
另一方面在HCV感染早期血清抗-HCV检出率较低，且血清抗-HCV检测存在假阴性。本组31例血清阴性患者中，10例肝内HCV-Ag阳性，提示肝内HCV-Ag的检测可有助于HCV感染的诊断。
, 百拇医药
HCV致肝细胞损害的机制尚不清楚，该研究表明慢性肝炎肝内HCV-Ag阳性肝细胞数较少；而重症肝炎肝内阳性肝细胞多呈弥漫分布。但是两者肝中阳性肝细胞均较易见于汇管区或碎屑样坏死周围，仅少数坏死肝细胞中亦见HCV-Ag表达，提示除HCV的直接致病性外，免疫系统可能起重要作用。
参考文献
1 梁英锐，吴名耀，林莹，等.丙型肝炎抗原在肝炎肝癌组织中的表达.中华医学杂志，1994，77：476-477.
2 赵西平，杨东亮，程玉芳，等.丙型肝炎病毒感染者肝组织中病毒相关抗原的表达.中华传染病杂志，1996，14：81-84.
3 Knodell BG, Ishak KG, Black WC, et al. Formulation and application of numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology,1981,1:431-435.
, http://www.100md.com
4 Naoki H, Hayashi N, Haruna Y, et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus-infected hepatocytes in chronic liver disease with monoclonal antibodies to Core, Envelope and NS3 reigions of the hepatitis C virus genome. Hepatology,1992,16:306-311.
5 Gotaro Y, Hiroshi N, Hisashi E, et al. Localization of hepatitis C viral RNA and capsid protein in human liver. Ddiddgd Dis Sci,1993,38:282.
6 Infantolino D, Chiaramonte M, Zaneeti AR, et al. Localization of hepatitis C virus antigen by immunohistochemistry on fixed-embedded liver tissue. Arch Virol,1992(suppl),4:191-195.
7 Simmonds P. Variability of hepatitis C virus. Hepatology,1995,21:570-583., 百拇医药
单位：200032 上海医科大学中山医院(袁和俊、胡德昌、刘厚钅玉)；上海医科大学(翟为溶)；中国科学院上海细胞生物学研究所(徐永华)；Yes Bniotech Laboratory, Canada (George Q.W. Ye)
关键词：肝炎病毒，丙型；免疫组织化学
中华传染病杂志980103 【摘要】 目的 研究肝炎患者肝组织中丙型肝炎病毒抗原的表达及其临床意义。方法 以抗-HCV NS4 McAb对77例肝炎患者肝穿标本进行检测。结果 HCV-Ag(NS4)呈细小颗粒状位于肝细胞浆中。急慢性肝炎肝组织HCV-Ag阳性肝细胞呈散在分布；慢性重型肝炎肝内HCV-Ag阳性肝细胞呈弥漫分布。15例血清抗-HCV(+)和HCV RNA(+)患者中有12例肝HCV-Ag(+)；11例血清抗-HCV(+)而HCV RNA(-)患者中有3例肝HCV-Ag(+)。结论 肝HCV-Ag表达与血清HCV RNA关系较为密切，HCV-Ag表达与HCV致病机制有关。
, 百拇医药
Expression of hepatitis C virus nonstructure 4 antigen in liver tissue from patients with hepatitis
Yuan Hejun, Hu Dechang, Zhai Weirong, et al. Department of gastroenterology, Zhongshan hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To investigate the expression of HCV-NS4 antigen in liver tissue and its clinical significance. Methods We detected 77 liver spicimens from patients with hepatitis by immunohistochemical method with monoclonal antibody to HCV-NS4. Results HCV-Ag were presented as granule in the cytoplasm of liver cell. The HCV-Ag positive hepatocytes were found to distribute sporadically or clustering in the liver tissue from acute and chronic hepatitis patients and diffusely in the liver tissue from chronic fulminant hepatitis patients. HCV-Ag positive staining was found in liver tissue from 12 of 15 patients with both HCV-Ab and HCV RNA seropositive, whereas 3 of 11 patients with HCV-Ab seropositive only. Conclusion The results suggested that the expression of hepatic HCV-Ag had distinct relationship with the level of serum HCV RNA, and might take part in the pathogenesis of HCV.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis C virus Immunohistochemistry
丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒，其基因组由大约9 400个核苷酸组成，中间有一开读框架(ORF)，依次编码核壳体蛋白(C)，包膜蛋白(E1，E2/NS1)和非结构蛋白(NS2-5)。HCV各区段基因的克隆及表达成功使抗各组份的McAb、PcAb的制备成为可能。近年来国内[1，2]已有关于肝组织中HCV C、NS3表达状况的研究报道。我们应用抗-HCV NS4 McAb,以免疫组化方法研究肝炎患者肝内HCV-Ag表达状况及其临床意义。
材料与方法
一、病例选择
77例均为1990年1月至1995年3月中山医院住院患者，男59例，女18例。临床诊断参照1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案。血清病毒标志HBsAg、抗-HBs、抗-HBc、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc-IgM应用美国Abbott或上海科华试剂以ELISA检测。血清抗-HCV采用上海科华产品第二代试剂ELISA检测。部分病例检测HCV RNA(PCR)。所有病例均经肝穿刺活检或死后即刻肝穿刺病理诊断证实。急性丙型肝炎3例，慢性肝炎58例(包括慢性丙型肝炎29例、慢性乙型肝炎23例、非乙非丙型肝炎6例)，慢性重型肝炎16例。
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二、检测方法
HCV NS4应用酶标链霉亲和素化二抗方法(LAB法)检测。鼠抗-HCV NS4 McAb(5D4)由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记链霉亲和素均为DAKO公司产品。
三、结果判断
1. 染色结果经双盲法观察。
2. HCV-Ag阳性肝细胞半定量(于高倍镜×400)：
1+：HCV-Ag阳性肝细胞偶见或少数呈散在分布，最密处<5/HP；
3+：HCV-Ag阳性肝细胞易见散在分布或灶性分布，最密处>20/HP；
2+：介于1+和3+之间最密处置5-20/HP。
, 百拇医药
3. HE切片中肝组织病变活动程度参照Kno-
dell计分法(HAI)[3]。
四、统计方法
t检验或χ2检验。
结果
一、抗-HCV阳性形态和分布及检出率
免疫组化染色显示HCV-Ag阳性染色物呈细小颗粒状弥漫或聚集成粗颗粒，乃至斑块状位于肝细胞浆中，以近核处较为多见，细胞膜和细胞核处阴性，肝窦内皮细胞、枯否细胞、胆管上皮细胞及炎症细胞均未见阳性染色(见图1、2)。
急、慢性和慢性重型肝炎肝内HCV-Ag阳性细胞检出情况见表1。其中急慢性肝炎肝组织中，HCV-Ag阳性肝细胞较少，多数呈散在或灶性分布，易见于汇管区或碎屑样坏死周围，重型肝炎患者肝内HCV-Ag阳性肝细胞多呈弥漫分布，部分坏死肝细胞中亦可见阳性染色。
, 百拇医药
图1 HCV-Ag阳性染色呈颗粒状聚结成斑块位于肝细胞浆内
图2 HCV-Ag染色阴性
表1 各型肝炎肝组织中HCV-Ag表达状况 临床诊断
受检
例数
阳性
例数
阳性染色
检出率
(%)
1+
, 百拇医药
2+
3+
急性丙型肝炎
3
2
2
0
0
66.7
慢性丙型肝炎
29
15
12
2
, 百拇医药
1
51.3
慢性乙型肝炎
23
1
1
0
0
4.3
慢性非丙非乙型肝炎
6
2
2
, 百拇医药 0
0
33.3
慢性重型肝炎
16
9
1
4
4
56.3
二、血清抗-HCV、HCV RNA与肝内HCV-Ag的关系
66例患者检测血清抗-HCV，结果显示35例血清抗-HCV阳性患者中的肝内HCV-Ag阳性19例(54.3%)，31例血清抗-HCV阴性患者中的肝内HCV-Ag阳性10例(32.3%)(P<0.05)。其中28例同时检测血清HCV RNA，结果显示15例血清抗-HCV和HCV RNA均阳性患者中的肝内HCV-Ag阳性12例，11例抗-HCV(+)而HCV RNA(-)患者中的HCV-Ag阳性3例(P<0.01)。
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三、肝组织学改变与HCV-Ag
表2显示32例急慢性丙型肝炎患者不同肝组织病变类型间，肝内HCV-Ag阳性检出率差异无显著性。表3显示HCV-Ag阳性患者肝内汇管区及汇管周围炎症活动程度计分略高于HCV-Ag阴性患者，但差异无显著性。
表2 丙型肝炎肝组织不同病变类型与HCV-Ag 病理类型
受检例数
HCV-Ag阳性例数
急性肝炎
3
2
轻度慢性肝炎
7
, 百拇医药
3
中度慢性肝炎
18
10
重度慢性肝炎
3
2
肝硬化
1
0
表3 肝内HCV-Ag表达与肝组织HAI计分关系(
±s) 组别汇管区周围炎
, http://www.100md.com
症或桥样坏死
小叶内变
性坏死
汇管区
炎症
前三项
总分
纤维化
程度
HCV-Ag(+)
2.97±1.75
2.17±1.00
2.58±1.17
, 百拇医药
7.76
1.56±1.20
HCV-Ag(-)
2.37±1.20
2.25±1.18
2.46±1.21
7.42
1.50±1.15
讨 论
国外学者[4]应用抗-HCV不同区段基因编码蛋白(E，C，NS3)的McAb检测发现其阳性产物均位于肝细胞浆中，且经连续切片观察发现HCV-Ag阳性肝细胞于肝组织中分布部位亦相同。另有学者[5]同时比较免疫组化显示HCV-Ag(C、NS3)与原位杂交显示HCV RNA正负链，发现两者在肝中分布规律亦相同；国内学者[1，2]报道HCV C或NS3抗原呈颗粒状位于胞浆内；本研究中我们应用抗-HCV NS4 McAb检测肝炎肝组织，发现HCV-Ag(NS4)分布于肝细胞浆中，其阳性染色形态及分布特征与国内外多数学者报道结果相符，提示可用抗-HCV单个组份蛋白的McAb或PcAb检测HCV的存在。
, 百拇医药
本组15例血清抗-HCV和HCV RNA均阳性患者中的12例(80%)肝内HCV-Ag阳性，11例抗-HCV(+)而HCV RNA(-)患者中的3例(27.3%)HCV-Ag阳性，提示血清HCV RNA水平与肝内HCV-Ag表达关系较为密切。此与国外学者[6]报道一致。但并非血清HCV RNA结果总与肝内HCV-Ag表达状况相一致，本组中3例血清HCV RNA阳性而肝内HCV-Ag阴性。这可能由于：(1) 肝内HCV-Ag分布不均匀或表达量低于检测极限；(2) HCV型或亚型不同，其抗原性亦不同；(3) HCV高度高异性，新出现变异株与原先优势病毒株在慢性感染过程中相互消长[7]，肝内HCV-Ag表达与血清HCV RNA水平出现时间上交错。
另一方面在HCV感染早期血清抗-HCV检出率较低，且血清抗-HCV检测存在假阴性。本组31例血清阴性患者中，10例肝内HCV-Ag阳性，提示肝内HCV-Ag的检测可有助于HCV感染的诊断。
, 百拇医药
HCV致肝细胞损害的机制尚不清楚，该研究表明慢性肝炎肝内HCV-Ag阳性肝细胞数较少；而重症肝炎肝内阳性肝细胞多呈弥漫分布。但是两者肝中阳性肝细胞均较易见于汇管区或碎屑样坏死周围，仅少数坏死肝细胞中亦见HCV-Ag表达，提示除HCV的直接致病性外，免疫系统可能起重要作用。
参考文献
1 梁英锐，吴名耀，林莹，等.丙型肝炎抗原在肝炎肝癌组织中的表达.中华医学杂志，1994，77：476-477.
2 赵西平，杨东亮，程玉芳，等.丙型肝炎病毒感染者肝组织中病毒相关抗原的表达.中华传染病杂志，1996，14：81-84.
3 Knodell BG, Ishak KG, Black WC, et al. Formulation and application of numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology,1981,1:431-435.
, http://www.100md.com
4 Naoki H, Hayashi N, Haruna Y, et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus-infected hepatocytes in chronic liver disease with monoclonal antibodies to Core, Envelope and NS3 reigions of the hepatitis C virus genome. Hepatology,1992,16:306-311.
5 Gotaro Y, Hiroshi N, Hisashi E, et al. Localization of hepatitis C viral RNA and capsid protein in human liver. Ddiddgd Dis Sci,1993,38:282.
6 Infantolino D, Chiaramonte M, Zaneeti AR, et al. Localization of hepatitis C virus antigen by immunohistochemistry on fixed-embedded liver tissue. Arch Virol,1992(suppl),4:191-195.
7 Simmonds P. Variability of hepatitis C virus. Hepatology,1995,21:570-583., 百拇医药