胆道良、恶性病变p53和bcl-2的表达及意义
作者：张 卫 钱光相△ 孟荣贵 张秀忠▲
单位：
关键词：胆囊肿瘤；胆管肿瘤；凋亡；基因；p53；基因；bcl-2；免疫组织化学
摘要 目的
摘要 目的:研究人胆道的良、恶性病变中凋亡抑制基因p53和bcl-2的表达及其意义。方法:33例胆囊腺癌及15例胆管癌石蜡包埋组织切片， 经免疫胶体金方法(IGSS)染色，并在显微镜下计数阳性细胞。结果:84.8%(28/33)的胆囊腺癌，66.7%(10/15)的胆管癌p53蛋白阳性，两者间有显著性差异(P<0.05)。60.6%(20/33)的胆囊腺癌，60.0%(9/15)的胆管癌bcl-2阳性，两者间无差异。胆囊炎、纤维间隔及正常组织p53及bcl-2 表达均为阴性。bcl-2阳性组中代表细胞增殖活性的ki-67指数显著高于bcl-2阴性组 (胆囊腺癌P<0.05，胆管癌P<0.01)。p53的表达与ki-67指数无相关性。 结论:bcl-2和突变型 p53对肿瘤细胞凋亡的抑制在胆道腺癌的发生、发展中共同发挥作用，但bcl-2和p53表达与肿瘤的预后无明显关系。ki-67 指数较高者的生存期较短。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 735.8
Gene expression significance of p53, bcl- 2 in human biliary tract benign and malignant disease
Zhang Wei, Qian Guangxiang, Meng Ronggui,Zhang Xiuzhong (Department of General Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University，Shanghai，200433)
Abstract Objective: To study the expression of apoptosis suppressor gene p53 and bcl-2 in benign and malignant disease of human biliary duct and its significance. Methods: Paraffin sections in 33 cases of gallbladder carcinoma and 15 cases of biliary duct carcinoma were examined using immunogold silver staining(IGSS),and then positive cells were detected under light microscope. Results:The positive rates of p53 were 84.8%(28/33) in gallbladder carcinoma and 66.7% (10/15) in biliary duct carcinoma, and there was statistically significant difference(P<0.05).The positive rates of bcl-2 were 60.6%(20/33) in gallbladder carcinoma and 60.0%(9/15) in biliary duct carcinoma, and there was no statistically significant difference. p53 and bcl-2 were negative in all adjacent normal tissue, stromal fibroblasts and cholecystitis . bcl-2 expression was associated with increased cell proliferation activity(P<0.01). Conclusion: p53 and bcl- 2 play a role in the occurrence and development of biliary tract carcinoma,but there is no relationship between p53 or bcl-2 expression and prognosis.The higher the ki-67 index, the shorter the servival time.
, 百拇医药
Key words gallbladder neoplasms; biliary duct neoplasms; apoptosis; gene, p53; genes bcl-2; immunohistochemistry
近期研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱有着密切的关系，而凋亡抑制基因bcl-2和突变型p53基因在抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生、发展中起着重要的作用[1]， 但有关这些基因在胆道癌中的表达及与胆道肿瘤发生、发展和增殖的关系的报道甚少。本实验就此问题作初步研究。
1 材料和方法
1.1 标本来源 33例胆囊腺癌，男16例，女17例，年龄24～73岁，平均59.2岁，其中11例胆囊腺癌肝转移，3例淋巴结转移，18例伴有胆囊结石。15例肝外胆管癌，男7例，女8例，年龄29～69岁，平均50.2岁，其中肝转移、淋巴结转移各3例，4例伴有肝内外胆管结石，6例胆囊腺瘤和3例胆囊炎。以上石蜡包埋组织均取自东方肝胆外科研究所1986年1月至1995年5月病理档案，每例均经切片、HE染色后行病理诊断，按WHO 标准组织学分级。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组织化学染色及单抗 采用免疫胶体金(IGSS)法[2]。bcl-2，124单抗；p53单抗和ki-67单抗均购自Dako公司。bcl-2 1∶200，p53 1∶500，ki-67 1∶100分别稀释后作为工作液。蛋白A-胶体金(10 nm) 由第二军医大学病理解剖学教研室提供。
1.3 结果判定 阳性颗粒为黑色，采用双盲法计数阳性细胞，请3位病理工作者分别计数100个细胞中的阳性细胞，然后求平均百分数。 染色强度判定标准为：未见黑色着色者为阴性(-)，少于10%的瘤细胞染色为弱阳性(+)，染色瘤细胞介于10%～60%间为中度阳性()，60%以上瘤细胞染色为强阳性。PBS代替一抗为阴性对照。
ki-67指数=ki-67阳性细胞数/100个细胞。
1.4 统计学处理 采用精确概率和χ2检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 免疫组织化学染色结果 肿瘤组织中bcl-2 阳性颗粒主要位于细胞的胞膜，部分胞浆亦见着色，阳性细胞主要位于腺管的基部(图1 A)。p53 蛋白阳性颗粒主要位于胞核，阳性细胞多位于腺体的基底部及癌巢中(图1 B)。腺瘤则主要位于不典型增生区。标本中存留的正常组织、间隔纤维组织以及胆囊炎组织中未见染色。
2.2 bcl-2，p53蛋白表达阳性率 由表1可见，胆囊腺癌和胆管癌p53蛋白表达的阳性率有显著性差异(P<0.05)，胆囊腺癌和胆囊腺瘤间无显著性差异。bcl-2的表达在胆囊腺癌和胆管癌， 胆囊腺癌和
图1 IGSS法检测胆囊腺癌中bcl-2蛋白(A)
, http://www.100md.com
和p53蛋白(B)(×108)
Fig 1 Immunohistochemical detection of
bcl-2 protein(A) and p53 protein(B) in
gallbladder carcinoma (×108)
表1 胆道良、恶性病变中bcl-2,p53 免疫组织化学染色结果
Tab 1 Results of bcl-2,p53 immunolabelling in malignant and benign disease of biliary duct
Diagnosis of
, http://www.100md.com
pathology
n
Positive numbers of p53
Positive numbers of bcl-2
+
Total(%)
+
Total(%)
, 百拇医药
GAC
33
3
14
11
28(84.8)
3
11
6
20(60.6)
GA
6
1
, http://www.100md.com 2
0
3(50.0)
1
2
1
4(66.7)
CC
3
0
0
0
0
0
, 百拇医药
0
0
0(0)
BDC
15
3
3
4
10(66.7)*
2
4
3
9(60.0)
, 百拇医药
GAC:Gallbladder adenocarcinoma; GA:Gallbladder adenoma; CC:Cholecystitis; BDC: Biliary duct carcinoma；* P<0.05 vs GAC
胆囊腺瘤之间相比均无显著差异。
2.3 bcl-2，p53表达与ki-67指数的关系 p53表达与ki-67 指数无明显相关，bcl-2阴性组中ki-67指数一般为0%～20%，胆囊腺癌(9.33±5.72)%，胆管癌(6.27±4.23)%；bcl-2阳性组中胆囊腺癌ki-67指数为0%～80%，平均(42.53±24.77)%，胆管癌为0%～70%,平均(38.67±20.58)%，且大多数在20%以上，阳性组和阴性组的ki-67指数的均数有显著性差异(胆囊腺癌P<0.05，胆管癌P<0.01)。
2.4 bcl-2,p53,ki-67表达与预后的关系 胆囊腺癌伴肝转移患者平均生存期为6个月,不伴转移者平均为11.7个月，而胆管癌平均生存期分别为3和16.5个月。虽然转移性肿瘤患者的生存期明显短于非转移性肿瘤，但两组患者中均有bcl-2和p53的高表达，显示与预后无明显相关趋势。而生存期在12个月以上的患者中，ki-67指数明显小于12个月以下的患者，胆囊腺癌平均为12.5%和30.4%，胆管癌平均为7.5%和40.0%。
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3 讨 论
p53及bcl-2作为调控凋亡的基因越来越受到人们的重视[3]。bcl-2作为广义的抗凋亡基因，可促进细胞增殖，导致肿瘤的发生。 本研究发现，bcl-2在正常组织及胆囊炎组织中不表达，而在60.6 %的胆囊腺癌，66.7%的胆囊腺瘤及60.0%的胆管癌中表达，说明bcl-2 不仅在胆囊腺瘤中有抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生的作用，而且在肿瘤形成后仍然起着促进肿瘤细胞增殖、促进肿瘤发展的作用。
在人类肿瘤中，抑癌基因p53是突变最频发的基因，已知在50%以上人类肿瘤中有p53基因的突变[4]。在我们的研究中发现，胆囊腺癌中p53 蛋白表达率为84.8%，胆管癌中为66.7%，两者有显著性差异(P<0.05)，结果与 Teh等[5]报道的一致。胆囊腺癌和胆管癌p53表达的差异提示两者在病因及成瘤机制上可能不同。Silvestri等[6]在研究人乳腺癌中发现，bcl-2与p53基因表达呈负相关，而本研究发现两者在胆囊腺瘤、 胆囊腺癌以及胆管癌中均有高表达，说明胆道癌的发生、发展是p53基因突变和bcl-2对凋亡的抑制共同作用的结果。
, 百拇医药
ki-67在细胞周期中可识别除G0期以外的细胞， 与肿瘤的有丝分裂活动有很好的相关性[7]，许多肿瘤，如肺癌、 乳腺癌及卵巢癌等均可通过检测ki-67抗原来判断这些细胞潜在的增殖活性[8]。我们的研究表明， bcl-2表达与细胞的增殖活性增高显著相关，因此bcl-2的表达在胆囊腺癌、 胆管癌的细胞增殖，促进肿瘤生长中起到了主要的作用。而生存期小于12个月组患者的ki-67指数明显高于生存期大于12个月组者，因此ki-67指数增高可能与预后不良有关，而bcl-2的表达与ki-67指数增高有非常显著的相关性，因此我们推断， bcl-2的表达也许可作为判断胆道癌预后的一个指标。
参 考 文 献
1 Carson DA,Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet, 1993,341(8855):1251
, http://www.100md.com
2 倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.北京:北京科学技术出版社,1993. 144～163
3 Lotem J, Sachs L.Regulation by bcl-2, c-myc and p53 of susceptibility to induction of apoptosis by heat shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and defective myeloid leukemic cells. Cell Growth Differ,1993,4(1):41
4 Levine AJ,Perry ME,Chang A,et al.The 1993 Walter Hubert Lecture: the role of the p53 tumor- suppressor gene in tumorigenesis. Br J Cancer ,1994,69(3):409
, http://www.100md.com
5 Teh M, Wee A, Raju GC, et al. An immunohistochemical study of p53 protein in gallbladder and extrahepatic bileduct/ampullary carcinoma.Cancer , 1994,74(5):1542
6 Silvestri R,Veneroil S,Daidone MG， et al.The bcl-2 protein: a prognostic indicator strongly related to p53 protein in lymphnode negative breast cancer patients. J Natl Cancer Inst, 1994,86(7):499
7 Weidner N, Moore DH, Vartanian R, et al. Correlation of ki-67 antigen expression with mitotic figure index and tumor grade in breast carcinomas using the novel paraffin -reactive MIB-I antibody. Hum Pathol,1994,25(4):337
8 Schwarting R.Little missed markers and ki-67. Lab Invest,1993,68(6): 597
(1997-09-19收稿,1997-12-30修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：胆囊肿瘤；胆管肿瘤；凋亡；基因；p53；基因；bcl-2；免疫组织化学
摘要 目的
摘要 目的:研究人胆道的良、恶性病变中凋亡抑制基因p53和bcl-2的表达及其意义。方法:33例胆囊腺癌及15例胆管癌石蜡包埋组织切片， 经免疫胶体金方法(IGSS)染色，并在显微镜下计数阳性细胞。结果:84.8%(28/33)的胆囊腺癌，66.7%(10/15)的胆管癌p53蛋白阳性，两者间有显著性差异(P<0.05)。60.6%(20/33)的胆囊腺癌，60.0%(9/15)的胆管癌bcl-2阳性，两者间无差异。胆囊炎、纤维间隔及正常组织p53及bcl-2 表达均为阴性。bcl-2阳性组中代表细胞增殖活性的ki-67指数显著高于bcl-2阴性组 (胆囊腺癌P<0.05，胆管癌P<0.01)。p53的表达与ki-67指数无相关性。 结论:bcl-2和突变型 p53对肿瘤细胞凋亡的抑制在胆道腺癌的发生、发展中共同发挥作用，但bcl-2和p53表达与肿瘤的预后无明显关系。ki-67 指数较高者的生存期较短。
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中国图书资料分类法分类号 R 735.8
Gene expression significance of p53, bcl- 2 in human biliary tract benign and malignant disease
Zhang Wei, Qian Guangxiang, Meng Ronggui,Zhang Xiuzhong (Department of General Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University，Shanghai，200433)
Abstract Objective: To study the expression of apoptosis suppressor gene p53 and bcl-2 in benign and malignant disease of human biliary duct and its significance. Methods: Paraffin sections in 33 cases of gallbladder carcinoma and 15 cases of biliary duct carcinoma were examined using immunogold silver staining(IGSS),and then positive cells were detected under light microscope. Results:The positive rates of p53 were 84.8%(28/33) in gallbladder carcinoma and 66.7% (10/15) in biliary duct carcinoma, and there was statistically significant difference(P<0.05).The positive rates of bcl-2 were 60.6%(20/33) in gallbladder carcinoma and 60.0%(9/15) in biliary duct carcinoma, and there was no statistically significant difference. p53 and bcl-2 were negative in all adjacent normal tissue, stromal fibroblasts and cholecystitis . bcl-2 expression was associated with increased cell proliferation activity(P<0.01). Conclusion: p53 and bcl- 2 play a role in the occurrence and development of biliary tract carcinoma,but there is no relationship between p53 or bcl-2 expression and prognosis.The higher the ki-67 index, the shorter the servival time.
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Key words gallbladder neoplasms; biliary duct neoplasms; apoptosis; gene, p53; genes bcl-2; immunohistochemistry
近期研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱有着密切的关系，而凋亡抑制基因bcl-2和突变型p53基因在抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生、发展中起着重要的作用[1]， 但有关这些基因在胆道癌中的表达及与胆道肿瘤发生、发展和增殖的关系的报道甚少。本实验就此问题作初步研究。
1 材料和方法
1.1 标本来源 33例胆囊腺癌，男16例，女17例，年龄24～73岁，平均59.2岁，其中11例胆囊腺癌肝转移，3例淋巴结转移，18例伴有胆囊结石。15例肝外胆管癌，男7例，女8例，年龄29～69岁，平均50.2岁，其中肝转移、淋巴结转移各3例，4例伴有肝内外胆管结石，6例胆囊腺瘤和3例胆囊炎。以上石蜡包埋组织均取自东方肝胆外科研究所1986年1月至1995年5月病理档案，每例均经切片、HE染色后行病理诊断，按WHO 标准组织学分级。
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1.2 免疫组织化学染色及单抗 采用免疫胶体金(IGSS)法[2]。bcl-2，124单抗；p53单抗和ki-67单抗均购自Dako公司。bcl-2 1∶200，p53 1∶500，ki-67 1∶100分别稀释后作为工作液。蛋白A-胶体金(10 nm) 由第二军医大学病理解剖学教研室提供。
1.3 结果判定 阳性颗粒为黑色，采用双盲法计数阳性细胞，请3位病理工作者分别计数100个细胞中的阳性细胞，然后求平均百分数。 染色强度判定标准为：未见黑色着色者为阴性(-)，少于10%的瘤细胞染色为弱阳性(+)，染色瘤细胞介于10%～60%间为中度阳性()，60%以上瘤细胞染色为强阳性。PBS代替一抗为阴性对照。
ki-67指数=ki-67阳性细胞数/100个细胞。
1.4 统计学处理 采用精确概率和χ2检验。
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2 结 果
2.1 免疫组织化学染色结果 肿瘤组织中bcl-2 阳性颗粒主要位于细胞的胞膜，部分胞浆亦见着色，阳性细胞主要位于腺管的基部(图1 A)。p53 蛋白阳性颗粒主要位于胞核，阳性细胞多位于腺体的基底部及癌巢中(图1 B)。腺瘤则主要位于不典型增生区。标本中存留的正常组织、间隔纤维组织以及胆囊炎组织中未见染色。
2.2 bcl-2，p53蛋白表达阳性率 由表1可见，胆囊腺癌和胆管癌p53蛋白表达的阳性率有显著性差异(P<0.05)，胆囊腺癌和胆囊腺瘤间无显著性差异。bcl-2的表达在胆囊腺癌和胆管癌， 胆囊腺癌和
图1 IGSS法检测胆囊腺癌中bcl-2蛋白(A)
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和p53蛋白(B)(×108)
Fig 1 Immunohistochemical detection of
bcl-2 protein(A) and p53 protein(B) in
gallbladder carcinoma (×108)
表1 胆道良、恶性病变中bcl-2,p53 免疫组织化学染色结果
Tab 1 Results of bcl-2,p53 immunolabelling in malignant and benign disease of biliary duct
Diagnosis of
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pathology
n
Positive numbers of p53
Positive numbers of bcl-2
+
Total(%)
+
Total(%)
, 百拇医药
GAC
33
3
14
11
28(84.8)
3
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20(60.6)
GA
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BDC
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9(60.0)
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GAC:Gallbladder adenocarcinoma; GA:Gallbladder adenoma; CC:Cholecystitis; BDC: Biliary duct carcinoma；* P<0.05 vs GAC
胆囊腺瘤之间相比均无显著差异。
2.3 bcl-2，p53表达与ki-67指数的关系 p53表达与ki-67 指数无明显相关，bcl-2阴性组中ki-67指数一般为0%～20%，胆囊腺癌(9.33±5.72)%，胆管癌(6.27±4.23)%；bcl-2阳性组中胆囊腺癌ki-67指数为0%～80%，平均(42.53±24.77)%，胆管癌为0%～70%,平均(38.67±20.58)%，且大多数在20%以上，阳性组和阴性组的ki-67指数的均数有显著性差异(胆囊腺癌P<0.05，胆管癌P<0.01)。
2.4 bcl-2,p53,ki-67表达与预后的关系 胆囊腺癌伴肝转移患者平均生存期为6个月,不伴转移者平均为11.7个月，而胆管癌平均生存期分别为3和16.5个月。虽然转移性肿瘤患者的生存期明显短于非转移性肿瘤，但两组患者中均有bcl-2和p53的高表达，显示与预后无明显相关趋势。而生存期在12个月以上的患者中，ki-67指数明显小于12个月以下的患者，胆囊腺癌平均为12.5%和30.4%，胆管癌平均为7.5%和40.0%。
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3 讨 论
p53及bcl-2作为调控凋亡的基因越来越受到人们的重视[3]。bcl-2作为广义的抗凋亡基因，可促进细胞增殖，导致肿瘤的发生。 本研究发现，bcl-2在正常组织及胆囊炎组织中不表达，而在60.6 %的胆囊腺癌，66.7%的胆囊腺瘤及60.0%的胆管癌中表达，说明bcl-2 不仅在胆囊腺瘤中有抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生的作用，而且在肿瘤形成后仍然起着促进肿瘤细胞增殖、促进肿瘤发展的作用。
在人类肿瘤中，抑癌基因p53是突变最频发的基因，已知在50%以上人类肿瘤中有p53基因的突变[4]。在我们的研究中发现，胆囊腺癌中p53 蛋白表达率为84.8%，胆管癌中为66.7%，两者有显著性差异(P<0.05)，结果与 Teh等[5]报道的一致。胆囊腺癌和胆管癌p53表达的差异提示两者在病因及成瘤机制上可能不同。Silvestri等[6]在研究人乳腺癌中发现，bcl-2与p53基因表达呈负相关，而本研究发现两者在胆囊腺瘤、 胆囊腺癌以及胆管癌中均有高表达，说明胆道癌的发生、发展是p53基因突变和bcl-2对凋亡的抑制共同作用的结果。
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ki-67在细胞周期中可识别除G0期以外的细胞， 与肿瘤的有丝分裂活动有很好的相关性[7]，许多肿瘤，如肺癌、 乳腺癌及卵巢癌等均可通过检测ki-67抗原来判断这些细胞潜在的增殖活性[8]。我们的研究表明， bcl-2表达与细胞的增殖活性增高显著相关，因此bcl-2的表达在胆囊腺癌、 胆管癌的细胞增殖，促进肿瘤生长中起到了主要的作用。而生存期小于12个月组患者的ki-67指数明显高于生存期大于12个月组者，因此ki-67指数增高可能与预后不良有关，而bcl-2的表达与ki-67指数增高有非常显著的相关性，因此我们推断， bcl-2的表达也许可作为判断胆道癌预后的一个指标。
参 考 文 献
1 Carson DA,Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet, 1993,341(8855):1251
, http://www.100md.com
2 倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.北京:北京科学技术出版社,1993. 144～163
3 Lotem J, Sachs L.Regulation by bcl-2, c-myc and p53 of susceptibility to induction of apoptosis by heat shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and defective myeloid leukemic cells. Cell Growth Differ,1993,4(1):41
4 Levine AJ,Perry ME,Chang A,et al.The 1993 Walter Hubert Lecture: the role of the p53 tumor- suppressor gene in tumorigenesis. Br J Cancer ,1994,69(3):409
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5 Teh M, Wee A, Raju GC, et al. An immunohistochemical study of p53 protein in gallbladder and extrahepatic bileduct/ampullary carcinoma.Cancer , 1994,74(5):1542
6 Silvestri R,Veneroil S,Daidone MG， et al.The bcl-2 protein: a prognostic indicator strongly related to p53 protein in lymphnode negative breast cancer patients. J Natl Cancer Inst, 1994,86(7):499
7 Weidner N, Moore DH, Vartanian R, et al. Correlation of ki-67 antigen expression with mitotic figure index and tumor grade in breast carcinomas using the novel paraffin -reactive MIB-I antibody. Hum Pathol,1994,25(4):337
8 Schwarting R.Little missed markers and ki-67. Lab Invest,1993,68(6): 597
(1997-09-19收稿,1997-12-30修回), http://www.100md.com