单纯疱疹病毒胸苷激酶基因工程化细胞和更昔洛韦系统的急慢性毒性
作者：张晓鹏 胡加飞 蔡如珏 袁国梁 董 萍 文淑华 黄承瑶 卢亦成 张光霁 朱 诚
单位：
关键词：神经胶质瘤；基因治疗；单纯疱疹病毒；更昔洛韦
摘要 目的
摘要 目的：探讨单纯疱疹病毒 Ⅰ型胸苷激酶基因工程化细胞(pLTKcSN/VPC)和更昔洛韦(GCV)系统的动物体内急、慢性毒性。方法：将pLTKcSN/VPC和(或)以β-半乳糖苷酶基因为报告基因的PA317细胞悬液注入小鼠、大鼠和灵长类动物体内，7 d后部分动物再全身应用GCV。分批处死动物，观察pLTKcSN/VPC和GCV系统在不同种属动物的体内急、慢性毒性。采用PCR和原位杂交方法直接检测胸苷激酶基因在动物脑和全身各脏器内的整合及表达情况。结合原位杂交和X-gal染色结果，判断注射细胞在动物脑内的存活时间。结果：pLTKcSN/VPC和GCV系统对动物的心、肝、肺和肾有一定的急性损害作用。该细胞在大鼠和猴脑内的存活时间为3周。结论：pLTKcSN/VPC和GCV系统的动物体内毒副作用轻微。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 730.5
Toxicity studies of retroviral-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transfer and ganciclovir administration
Zhang Xiaopeng, Hu Jiafei, Cai Rujue, Yuan Guoliang, Dong Ping, Wen Shuhua, Huang Chengyao, Lu Yicheng, Zhang Guangji, Zhu Cheng (Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To study the toxicities of the retroviral-vector producer cells of herpes simplex virus thymidine kinase gene(pLTKcSN/VPC) and the ganciclovir(GCV) system in mice, rats and primates. Methods: pLTKcSN/VPC and/or the cell suspension of PA317 cells modified by the β-gal reporter gene were injected into the animal bodies, and 7 d later, some of the animals were given GCV. The animals were then sacrificed as scheduled, and the acute and long term toxicities of this treatment system were evaluated through histological studies and direct detection of the transduction and expression of the thymidine kinase (TK) gene in animal brain and other organs. The survival interval of the xenogenic cells in rat and monkey brain was determined by the X-gal staining and the in situ hybridization of the TK gene in brain. Results: The pLTKcSN/VPC and GCV system had certain acute side effects on heart, liver, lung and kidney, but no long term toxicities could be detected. The survival time of pLTKcSN/VPC in the brain of rats and primates was 3 weeks. Conclusion: The pLTKcSN/VPC and GCV system has slight toxicities when applied in vivo.
, 百拇医药
Key words glioma; gene therapy; herpes simplex virus; ganciclovir
利用逆转录病毒载体特异性感染分裂细胞的特点，可将其所携带的药物敏感基因转染于恶性神经胶质瘤细胞的DNA中。外源性基因在肿瘤细胞内的表达产物通常是一种酶，可以使肿瘤细胞对相应的药物产生敏感性而被杀伤[1,2]。体外和体内实验结果表明，中国株单纯疱疹病毒 Ⅰ型胸苷激酶基因工程化细胞(pLTKcSN/VPC)及更昔洛韦(GCV)对恶性神经胶质瘤有明确的杀伤作用。为探索该方法临床治疗神经胶质瘤的可能性，我们研究了pLTKcSN/VPC及GCV系统对动物各脏器的急性和慢性毒性作用。
1 材料和方法
1.1 实验细胞 pLTKcSN/VPC及以β-半乳糖苷酶(β-gal)基因为报告基因的PA317细胞(β-gal/nVPC)，由上海市肿瘤研究所提供。pLTKcSN/VPC细胞：将国内克隆的中国株单纯疱疹病毒 Ⅰ型胸苷激酶(TK)基因片段插入自制的pLSN载体内，用美国ATCC提供的PA317细胞包装，经扩增和筛选完成pLTKcSN/VPC种子细胞库的建立和纯化，由复旦大学分子遗传学研究所检测证实不含野生型病毒和支原体。种子细胞在含10%小牛血清和1 mg/ml G418(Sigma公司)、50 μg/ml的DMEM(Gibco公司)完全培养液中培养传代。实验开始时，细胞消化离心去除培养液上清，用PBS缓冲液洗涤并离心两遍，最后制成用于动物体内注射的细胞悬液。根据动物与人的体质量数量级的差别，小鼠静脉注射(iv)和腹腔注射(ip)细胞数量级分别定于105和106，大鼠脑内注射106，灵长类动物脑内注射107。
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1.2 动物分组
1.2.1 小鼠实验 小鼠48只，体质量20 g，雌雄各半。参照NIH 的实验设计[3]，经ip和iv pLTKcSN/VPC，细胞悬液量分别定为5×106个/只和5×105个/只。细胞悬液注射后7 d，半数动物ip GCV，共7 d。用药结束后4 d和1个月分别处死半数动物，进行急慢性毒性观察。
1.2.2 大鼠实验 SD大鼠24只，体质量200 g，雌雄各半，随机分为两组，通过立体定向方法将pLTKcSN/VPC或β-gal/nVPC 5×106个接种于两组动物的右侧额叶白质内。接种pLTKcSN/VPC的动物7 d后ip GCV，共7 d，给药结束后处死动物，观察颅内接种pLTKcSN/VPC联合GCV应用的急性毒性；接种β-gal/nVPC的动物在细胞接种后第9，14，21和30天处死，对脑组织进行冷冻连续切片，X-gal 染色，观察包装细胞在大鼠脑内的存活时间。
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1.2.3 灵长类实验 参照NIH的实验方案[3]，选择成年恒河猴7只，雄性4只，雌性3只，体质量为4.5～6.0 kg。在全麻下开颅进行右侧额叶白质细胞悬液接种，7 d后，其中3只iv GCV，另外3只不给药。有1只动物未进行任何处理，作为空白对照。分别于细胞悬液接种后第14天处死1只，第3周2只，第3月2只(其中1只是空白对照)，余2只长期观察。毒性作用评价包括4个方面：(1)神经系统临床表现；(2)头颅影像学改变；(3)血、脑脊液细胞学、生化及免疫指标的检测；(4)各主要器官组织学检查，TK序列的整合及表达检测。采用自制的神经功能评分表进行动物神经系统临床评价，主要指标包括运动、摄食和对伤害性刺激的反应[4]。
1.3 更昔洛韦 由Roche公司提供。小鼠ip 100 mg/(kg*d)，2次/d，共7 d。大鼠ip 15 mg/(kg*d)，2次/d，共7 d。恒河猴iv 10 mg/(kg*d)，1次/d，共14 d。
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1.4 内脏标本检查 在注射细胞后不同时间点处死动物，取脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠和生殖系统等器官标本，除常规切片HE染色组织学检查外，取各脏器标本进行TK序列DNA PCR及RNA原位杂交，以分析TK序列在全身各脏器内的整合及表达情况。为间接判断VPC在异种动物脑内的存活时间，对颅内注射β-gal/nVPC的大鼠和猴脑切片进行X-gal组织化学染色，观察β-gal基因在动物脑内的表达时间。由于β-gal/nVPC及pLTKcSN/VPC均来源于PA317细胞，所以两种细胞在异种动物脑内的存活时间是一致的。
2 结 果
2.1 小鼠体内急、慢性毒性 小鼠在ip pLTKcSN/VPC 后至GCV给药前，体质量、进食和进水量无明显变化。GCV给药的动物在用药期间体质量明显减轻，并有厌食和萎靡表现，可恢复。器官标本检查发现，观察急性毒性的动物肝脏病理检查可见非特异性肝细胞嗜酸性变，脑、心、肺、肾、大小肠和性腺等器官常规组织学检查均未见异常改变。各器官标本TK序列DNA PCR检测呈阴性。TK序列mRNA 原位杂交见接受两种途径细胞注射的动物，在急性期心、脑和肺组织中有零星杂交阳性细胞存在。
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2.2 大鼠体内急性毒性 接种pLTKcSN/VPC组大鼠除2只手术死亡外，其余在实验中无体质量和神经系统异常改变。接种pLTKcSN/VPC的动物器官组织学检查见手术部位普遍存在蛛网膜下腔出血，2只动物有心肌间质性炎症，3只动物有肝细胞脂肪变性，1只动物有肺内灶性出血改变，各器官标本的TK序列DNA PCR检测均为阴性，TK序列mRNA原位杂交见动物心、肝、大肠粘膜和肺组织中有零星阳性细胞存在。注射β-gal/nVPC组的动物X-gal染色结果见接种后3周内细胞在大鼠的脑中存在，提示pLTKcSN/VPC在不给GCV的情况下可存活约3周。
2.3 灵长类动物体内急、慢性毒性 出现与开颅手术有关的并发症有癫痫、心律失常和手术伤口不愈合。血和脑脊液常规及生化检查结果，提示有反应性脑膜炎症、肝脏和造血系统轻度损害。头颅MRI检查见细胞接种部位和同侧大脑半球有明显脑水肿和血脑屏障破坏表现。器官病理组织学检查结果表明，3周内处死的动物脑内细胞接种部位有出血和软化，脑干有脱髓鞘改变，肝、肾和肺有局灶性变性改变；3个月处死的动物各器官均无明显病理改变，动物脑内无包装细胞的局部增殖现象。 对动物器官标本进行TK序列DNA PCR检测结果均为阴性。对动物脑组织切片进行TK序列mRNA 原位杂交，发现细胞注射后3周内注射部位有杂交阳性细胞存在，3个月后杂交为阴性结果，X-gal 染色结果与之相同。组织学检查未见注射细胞部位有pLTKcSN/VPC的局部增殖现象，这提示pLTKcSN/VPC在灵长类动物体内的存活期是3周，与大鼠实验结果一致。
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3 讨 论
pLTKcSN/VPC中的TK基因片段为1.2 kb，与McKnight[5]所报道的HSV-tk片段序列相比较有6个碱基变异，造成表达的胸苷激酶多肽中有2个氨基酸变异。体外实验证实，TK基因在转染阳性细胞内的表达效率明显提高。动物体内实验证实，pLTKcSN/VPC联合GCV对恶性神经胶质瘤有显著的治疗效果。 pLTKcSN/VPC源于小鼠的成纤维细胞PA317，注射入人脑中可能会引起排异反应，或在局部增殖形成肿瘤；该细胞在脑内释放的逆转录病毒有可能发生同源性重组，形成野生型病毒；脑内释放的逆转录病毒有可能通过血脑屏障进入大循环，将所携带的TK转染于其他脏器；GCV对肝、肾、生殖系统和造血系统也有一定的毒性。由于我们研究的是载体生产细胞和GCV结合这一治疗体系，而非其中之一的毒性，所以实验设计有其特殊性，国内尚无先例，我们参照了美国NIH的实验计划设计了本实验[3,6]。与NIH的设计不同之处在于对TK基因的示踪方法，NIH以β-gal基因为报告基因构建了相应的逆转录病毒载体生产细胞，将两种载体生产细胞混合注射入动物体内，通过X-gal染色，间接检测TK在动物体内的分布和载体生产细胞的存活情况。由于我们没有成功地构建以β-gal为报告基因的载体生产细胞，所以本实验中，我们采用PCR和原位杂交直接检测TK序列的整合与表达情况，并结合转染β-gal基因的PA317细胞在大鼠和猴脑内的存在时间，判断pLTKcSN/VPC在异种动物脑内的存活时间。
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实验可得出如下初步结论：(1)pLTKcSN/VPC在大鼠和猴脑内的存活时间为3周左右，无局部增殖现象；(2)pLTKcSN/VPC脑实质内注射可引起脑膜炎性反应，但是临床表现不明显；(3)脑内注射pLTKcSN/VPC可引起脑干神经元轴突脱髓鞘变性，并可在心、肝、肺和大肠粘膜等脏器中检测出零星TK基因的整合及表达；(4)pLTKcSN/VPC和GCV系统对动物心、肝、肾和肺有一定的急性器质性损害作用，但对相应器官的功能损害不明显。上述初步结论与NIH的结论相似。
NIH自1992年首次进行逆转录病毒介导TK转染，联合GCV治疗神经胶质瘤的 Ⅰ期临床试验[6]，目前尚无严重人体毒副作用报道。经过审批，我国卫生部已经认可本毒性研究结果，并于1996年11月13日批准进行pLTKcSN/VPC和GCV系统治疗神经胶质瘤的 Ⅰ期临床试验，进一步探讨该治疗体系的人体安全性。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Culver KW, Ram Z, Walbridges S, et al. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for the treatment of experimental brain tumors. Science, 1992, 256(5063): 1550
2 张晓鹏，胡加飞，蔡如珏，等. pLTKcSN/VPC及GCV系统的旁观者效应观察. 第二军医大学学报，1997, 18(4): 325
3 Ram Z, Culver KW, Walbridge S, et al. Toxicity studies of retroviral-mediated gene transfer for the treatment of brain tumors. J Neurosurg, 1993, 79(3): 400
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4 张晓鹏，胡加飞，蔡如珏，等. 一种灵长类动物的中枢神经功能评价方法. 第二军医大学学报，1997, 18(3)：285
5 McKnight SL. The nucleotide sequence and transcript map of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Nucleic Acids Res, 1980， 8(24): 5949
6 Oldfeild EH, Ram Z, Culver KW, et al. Gene therapy of the treatment of brain tumors using intratumoral transduction with the thymidine kinase gene and intravenous ganciclovir. Hum Gene Ther, 1993, 4(1): 39
(1997-10-31收稿，1998-03-03修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：神经胶质瘤；基因治疗；单纯疱疹病毒；更昔洛韦
摘要 目的
摘要 目的：探讨单纯疱疹病毒 Ⅰ型胸苷激酶基因工程化细胞(pLTKcSN/VPC)和更昔洛韦(GCV)系统的动物体内急、慢性毒性。方法：将pLTKcSN/VPC和(或)以β-半乳糖苷酶基因为报告基因的PA317细胞悬液注入小鼠、大鼠和灵长类动物体内，7 d后部分动物再全身应用GCV。分批处死动物，观察pLTKcSN/VPC和GCV系统在不同种属动物的体内急、慢性毒性。采用PCR和原位杂交方法直接检测胸苷激酶基因在动物脑和全身各脏器内的整合及表达情况。结合原位杂交和X-gal染色结果，判断注射细胞在动物脑内的存活时间。结果：pLTKcSN/VPC和GCV系统对动物的心、肝、肺和肾有一定的急性损害作用。该细胞在大鼠和猴脑内的存活时间为3周。结论：pLTKcSN/VPC和GCV系统的动物体内毒副作用轻微。
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中国图书资料分类法分类号 R 730.5
Toxicity studies of retroviral-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transfer and ganciclovir administration
Zhang Xiaopeng, Hu Jiafei, Cai Rujue, Yuan Guoliang, Dong Ping, Wen Shuhua, Huang Chengyao, Lu Yicheng, Zhang Guangji, Zhu Cheng (Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To study the toxicities of the retroviral-vector producer cells of herpes simplex virus thymidine kinase gene(pLTKcSN/VPC) and the ganciclovir(GCV) system in mice, rats and primates. Methods: pLTKcSN/VPC and/or the cell suspension of PA317 cells modified by the β-gal reporter gene were injected into the animal bodies, and 7 d later, some of the animals were given GCV. The animals were then sacrificed as scheduled, and the acute and long term toxicities of this treatment system were evaluated through histological studies and direct detection of the transduction and expression of the thymidine kinase (TK) gene in animal brain and other organs. The survival interval of the xenogenic cells in rat and monkey brain was determined by the X-gal staining and the in situ hybridization of the TK gene in brain. Results: The pLTKcSN/VPC and GCV system had certain acute side effects on heart, liver, lung and kidney, but no long term toxicities could be detected. The survival time of pLTKcSN/VPC in the brain of rats and primates was 3 weeks. Conclusion: The pLTKcSN/VPC and GCV system has slight toxicities when applied in vivo.
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Key words glioma; gene therapy; herpes simplex virus; ganciclovir
利用逆转录病毒载体特异性感染分裂细胞的特点，可将其所携带的药物敏感基因转染于恶性神经胶质瘤细胞的DNA中。外源性基因在肿瘤细胞内的表达产物通常是一种酶，可以使肿瘤细胞对相应的药物产生敏感性而被杀伤[1,2]。体外和体内实验结果表明，中国株单纯疱疹病毒 Ⅰ型胸苷激酶基因工程化细胞(pLTKcSN/VPC)及更昔洛韦(GCV)对恶性神经胶质瘤有明确的杀伤作用。为探索该方法临床治疗神经胶质瘤的可能性，我们研究了pLTKcSN/VPC及GCV系统对动物各脏器的急性和慢性毒性作用。
1 材料和方法
1.1 实验细胞 pLTKcSN/VPC及以β-半乳糖苷酶(β-gal)基因为报告基因的PA317细胞(β-gal/nVPC)，由上海市肿瘤研究所提供。pLTKcSN/VPC细胞：将国内克隆的中国株单纯疱疹病毒 Ⅰ型胸苷激酶(TK)基因片段插入自制的pLSN载体内，用美国ATCC提供的PA317细胞包装，经扩增和筛选完成pLTKcSN/VPC种子细胞库的建立和纯化，由复旦大学分子遗传学研究所检测证实不含野生型病毒和支原体。种子细胞在含10%小牛血清和1 mg/ml G418(Sigma公司)、50 μg/ml的DMEM(Gibco公司)完全培养液中培养传代。实验开始时，细胞消化离心去除培养液上清，用PBS缓冲液洗涤并离心两遍，最后制成用于动物体内注射的细胞悬液。根据动物与人的体质量数量级的差别，小鼠静脉注射(iv)和腹腔注射(ip)细胞数量级分别定于105和106，大鼠脑内注射106，灵长类动物脑内注射107。
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1.2 动物分组
1.2.1 小鼠实验 小鼠48只，体质量20 g，雌雄各半。参照NIH 的实验设计[3]，经ip和iv pLTKcSN/VPC，细胞悬液量分别定为5×106个/只和5×105个/只。细胞悬液注射后7 d，半数动物ip GCV，共7 d。用药结束后4 d和1个月分别处死半数动物，进行急慢性毒性观察。
1.2.2 大鼠实验 SD大鼠24只，体质量200 g，雌雄各半，随机分为两组，通过立体定向方法将pLTKcSN/VPC或β-gal/nVPC 5×106个接种于两组动物的右侧额叶白质内。接种pLTKcSN/VPC的动物7 d后ip GCV，共7 d，给药结束后处死动物，观察颅内接种pLTKcSN/VPC联合GCV应用的急性毒性；接种β-gal/nVPC的动物在细胞接种后第9，14，21和30天处死，对脑组织进行冷冻连续切片，X-gal 染色，观察包装细胞在大鼠脑内的存活时间。
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1.2.3 灵长类实验 参照NIH的实验方案[3]，选择成年恒河猴7只，雄性4只，雌性3只，体质量为4.5～6.0 kg。在全麻下开颅进行右侧额叶白质细胞悬液接种，7 d后，其中3只iv GCV，另外3只不给药。有1只动物未进行任何处理，作为空白对照。分别于细胞悬液接种后第14天处死1只，第3周2只，第3月2只(其中1只是空白对照)，余2只长期观察。毒性作用评价包括4个方面：(1)神经系统临床表现；(2)头颅影像学改变；(3)血、脑脊液细胞学、生化及免疫指标的检测；(4)各主要器官组织学检查，TK序列的整合及表达检测。采用自制的神经功能评分表进行动物神经系统临床评价，主要指标包括运动、摄食和对伤害性刺激的反应[4]。
1.3 更昔洛韦 由Roche公司提供。小鼠ip 100 mg/(kg*d)，2次/d，共7 d。大鼠ip 15 mg/(kg*d)，2次/d，共7 d。恒河猴iv 10 mg/(kg*d)，1次/d，共14 d。
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1.4 内脏标本检查 在注射细胞后不同时间点处死动物，取脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠和生殖系统等器官标本，除常规切片HE染色组织学检查外，取各脏器标本进行TK序列DNA PCR及RNA原位杂交，以分析TK序列在全身各脏器内的整合及表达情况。为间接判断VPC在异种动物脑内的存活时间，对颅内注射β-gal/nVPC的大鼠和猴脑切片进行X-gal组织化学染色，观察β-gal基因在动物脑内的表达时间。由于β-gal/nVPC及pLTKcSN/VPC均来源于PA317细胞，所以两种细胞在异种动物脑内的存活时间是一致的。
2 结 果
2.1 小鼠体内急、慢性毒性 小鼠在ip pLTKcSN/VPC 后至GCV给药前，体质量、进食和进水量无明显变化。GCV给药的动物在用药期间体质量明显减轻，并有厌食和萎靡表现，可恢复。器官标本检查发现，观察急性毒性的动物肝脏病理检查可见非特异性肝细胞嗜酸性变，脑、心、肺、肾、大小肠和性腺等器官常规组织学检查均未见异常改变。各器官标本TK序列DNA PCR检测呈阴性。TK序列mRNA 原位杂交见接受两种途径细胞注射的动物，在急性期心、脑和肺组织中有零星杂交阳性细胞存在。
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2.2 大鼠体内急性毒性 接种pLTKcSN/VPC组大鼠除2只手术死亡外，其余在实验中无体质量和神经系统异常改变。接种pLTKcSN/VPC的动物器官组织学检查见手术部位普遍存在蛛网膜下腔出血，2只动物有心肌间质性炎症，3只动物有肝细胞脂肪变性，1只动物有肺内灶性出血改变，各器官标本的TK序列DNA PCR检测均为阴性，TK序列mRNA原位杂交见动物心、肝、大肠粘膜和肺组织中有零星阳性细胞存在。注射β-gal/nVPC组的动物X-gal染色结果见接种后3周内细胞在大鼠的脑中存在，提示pLTKcSN/VPC在不给GCV的情况下可存活约3周。
2.3 灵长类动物体内急、慢性毒性 出现与开颅手术有关的并发症有癫痫、心律失常和手术伤口不愈合。血和脑脊液常规及生化检查结果，提示有反应性脑膜炎症、肝脏和造血系统轻度损害。头颅MRI检查见细胞接种部位和同侧大脑半球有明显脑水肿和血脑屏障破坏表现。器官病理组织学检查结果表明，3周内处死的动物脑内细胞接种部位有出血和软化，脑干有脱髓鞘改变，肝、肾和肺有局灶性变性改变；3个月处死的动物各器官均无明显病理改变，动物脑内无包装细胞的局部增殖现象。 对动物器官标本进行TK序列DNA PCR检测结果均为阴性。对动物脑组织切片进行TK序列mRNA 原位杂交，发现细胞注射后3周内注射部位有杂交阳性细胞存在，3个月后杂交为阴性结果，X-gal 染色结果与之相同。组织学检查未见注射细胞部位有pLTKcSN/VPC的局部增殖现象，这提示pLTKcSN/VPC在灵长类动物体内的存活期是3周，与大鼠实验结果一致。
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3 讨 论
pLTKcSN/VPC中的TK基因片段为1.2 kb，与McKnight[5]所报道的HSV-tk片段序列相比较有6个碱基变异，造成表达的胸苷激酶多肽中有2个氨基酸变异。体外实验证实，TK基因在转染阳性细胞内的表达效率明显提高。动物体内实验证实，pLTKcSN/VPC联合GCV对恶性神经胶质瘤有显著的治疗效果。 pLTKcSN/VPC源于小鼠的成纤维细胞PA317，注射入人脑中可能会引起排异反应，或在局部增殖形成肿瘤；该细胞在脑内释放的逆转录病毒有可能发生同源性重组，形成野生型病毒；脑内释放的逆转录病毒有可能通过血脑屏障进入大循环，将所携带的TK转染于其他脏器；GCV对肝、肾、生殖系统和造血系统也有一定的毒性。由于我们研究的是载体生产细胞和GCV结合这一治疗体系，而非其中之一的毒性，所以实验设计有其特殊性，国内尚无先例，我们参照了美国NIH的实验计划设计了本实验[3,6]。与NIH的设计不同之处在于对TK基因的示踪方法，NIH以β-gal基因为报告基因构建了相应的逆转录病毒载体生产细胞，将两种载体生产细胞混合注射入动物体内，通过X-gal染色，间接检测TK在动物体内的分布和载体生产细胞的存活情况。由于我们没有成功地构建以β-gal为报告基因的载体生产细胞，所以本实验中，我们采用PCR和原位杂交直接检测TK序列的整合与表达情况，并结合转染β-gal基因的PA317细胞在大鼠和猴脑内的存在时间，判断pLTKcSN/VPC在异种动物脑内的存活时间。
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实验可得出如下初步结论：(1)pLTKcSN/VPC在大鼠和猴脑内的存活时间为3周左右，无局部增殖现象；(2)pLTKcSN/VPC脑实质内注射可引起脑膜炎性反应，但是临床表现不明显；(3)脑内注射pLTKcSN/VPC可引起脑干神经元轴突脱髓鞘变性，并可在心、肝、肺和大肠粘膜等脏器中检测出零星TK基因的整合及表达；(4)pLTKcSN/VPC和GCV系统对动物心、肝、肾和肺有一定的急性器质性损害作用，但对相应器官的功能损害不明显。上述初步结论与NIH的结论相似。
NIH自1992年首次进行逆转录病毒介导TK转染，联合GCV治疗神经胶质瘤的 Ⅰ期临床试验[6]，目前尚无严重人体毒副作用报道。经过审批，我国卫生部已经认可本毒性研究结果，并于1996年11月13日批准进行pLTKcSN/VPC和GCV系统治疗神经胶质瘤的 Ⅰ期临床试验，进一步探讨该治疗体系的人体安全性。
参 考 文 献
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1 Culver KW, Ram Z, Walbridges S, et al. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for the treatment of experimental brain tumors. Science, 1992, 256(5063): 1550
2 张晓鹏，胡加飞，蔡如珏，等. pLTKcSN/VPC及GCV系统的旁观者效应观察. 第二军医大学学报，1997, 18(4): 325
3 Ram Z, Culver KW, Walbridge S, et al. Toxicity studies of retroviral-mediated gene transfer for the treatment of brain tumors. J Neurosurg, 1993, 79(3): 400
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4 张晓鹏，胡加飞，蔡如珏，等. 一种灵长类动物的中枢神经功能评价方法. 第二军医大学学报，1997, 18(3)：285
5 McKnight SL. The nucleotide sequence and transcript map of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Nucleic Acids Res, 1980， 8(24): 5949
6 Oldfeild EH, Ram Z, Culver KW, et al. Gene therapy of the treatment of brain tumors using intratumoral transduction with the thymidine kinase gene and intravenous ganciclovir. Hum Gene Ther, 1993, 4(1): 39
(1997-10-31收稿，1998-03-03修回), http://www.100md.com