BHRF1基因表达对CNE2细胞生长的影响
作者：黄 海 潘星华△ 余 龙▲ 孔宪涛□ 周水淼 李兆基 傅 强▲ 孙喜元▲
单位：
关键词：EB病毒；鼻咽癌；凋亡
摘 要 目的摘 要 目的：观察EB病毒基因BHRF1的表达对鼻咽癌细胞生存能力的影响。方法：通过构建携有BHRF1的高表达载体，并转染低分化鼻咽癌细胞株CNE2细胞。检测转染后癌细胞周期各时相分布的改变和在缺乏营养条件下的生长情况。结果：BHRF1的表达能使G1期细胞百分比升高，S期细胞百分比下降，癌细胞在缺血清条件下生存时间延长。结论：BHRF1的表达能促使鼻咽癌细胞周期的重新分布，以增强其在缺乏营养条件下的生存能力。
中国图书资料分类法分类号 Q 739.620.231
The effect of BHRF1 expression on CNE2 cell growth
, 百拇医药
Huang Hai, Pan Xinghua, Yu Long, Kong Xiantao, Zhou Shuimiao, Li Zhaoji, Fu Qiang, Sun Xiyuan (Department of Otolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To observe the effect of BHRF1 expression on the growth of the cell of nasopharyngeal carcinoma. Methods: High expression vector for BHRF1 was set up and transfected in low grade cell line of nasopharyngeal carcinoma, CNE2. Then the cells were tested for redistribution of cell cycle and cultivated under the condition of insufficient nutrition. Results: BHRF1 expression increased cell percentage in G1 phase and decreased cell percentage in S phase, which prolonged cell survival under the condition of nutrition deprivation. Conclusion: BHRF1 expression can redistribute cell cycle and enhance survival of tumor cells.
, 百拇医药
Key words Epstein-Barr virus ; nasopharyngeal carcinoma ; apoptosis
EB病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明确相关。在鼻咽癌患者的血清中VCA-IgA多为阳性，且其滴度改变与病情变化呈正相关。研究发现大多数鼻咽癌标本中存在EB病毒基因。EB病毒基因组为双链DNA，包含17.2万碱基对，编码100多个基因，其中有约10个与病毒介导的细胞增生有关。虽然EB病毒潜伏基因与细胞恶变有关，但参与EB病毒复制的病毒蛋白也可能影响致瘤过程。BHRF1是EB病毒编码的一种即早期蛋白，具有抑制细胞凋亡的作用。本研究通过向低分化鼻咽癌细胞株CNE2细胞中转染携有BHRF1的高表达载体，以探讨BHRF1表达对鼻咽癌细胞生长的影响。
1 材料和方法
1.1 BHRF1重组表达载体构建和鉴定 分别将BHRF1-pSG5(英国Dawson教授惠赠)和pcDNA3质粒用XbaⅠ和EcoRⅠ(Pharmacia公司)进行酶切，经低熔点凝胶回收0.9 kb的BHRF1和5.4 kb的pcDNA3片段。3 mol/L乙酸钠、无水乙醇提纯，70%乙醇漂洗，晾干后溶于纯水，凝胶电泳鉴定。将50 ng的BHRF1与50 ng的pcDNA3混合，T4连接酶16℃连接过夜，转化感受态细胞。柱抽提法提取质粒，酶切鉴定。
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1.2 脂质体介导载体转染 转染前先将细胞培养24 h；分别将重组表达质粒或空载体质粒2 μg以及6 μl的脂质体分别与100 μl无血清的培养基混匀，再将两者混匀，室温温育45 min；将细胞用无血清的培养基洗两遍；向质粒与脂质体形成的复合物中加入800 μl的无血清培养基并混匀后，加到转染细胞的表面，温育5 h；将细胞用PBS冲洗两遍后，加入含血清的培养基温育72 h；加G418选择稳定表达新霉素抗性基因的细胞，并进行扩增。
1.3 Northern杂交检测转染细胞BHRF1的表达 收取培养24 h的CNE2细胞、含空载体的CNE2细胞及BHRF1-CNE2细胞，利用细胞总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提细胞的总RNA。于1%甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳，将凝胶中的总RNA转移到尼龙膜上，80℃烘2 h固定、预杂交。取酶切提纯的BHRF1片段，随机引物扩增法制备32P标记探针，检测标记率约为80%。G50柱过滤标记物，煮沸后注入杂交盒中杂交18 h。反复洗膜。-80℃放射自显影，洗片。
, 百拇医药
1.4 流式细胞仪检测细胞周期分布 细胞传代培养24 d，胰酶消化，生理盐水漂洗，70%乙醇固定，0.05%碘化丙啶染色，取1×106个/ml用流式细胞仪分析细胞周期的分布。
1.5 BHRF1表达对CNE2细胞在缺血清条件下生存能力的影响 将CNE2细胞、含有空载体的CNE2细胞及BHRF1转染细胞分别接种于96孔平底板(4×103个/孔)，培养24 h。吸去培养液，加入新鲜的不含血清的培养液，再继续培养10 d，并不再加入新鲜培养液。每天每组用MTT处理3孔，以检测活细胞的数量。
1.6 统计学处理 数据以
±s表示，采用χ2检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 重组BHRF1高表达载体的酶切鉴定 将重组BHRF1-pcDNA3质粒及BHRF1-pSG5质粒分别用XbaⅠ和EcoRⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，检查发现其均有大小约0.9 kb的片段，提示重组高表达载体构建成功(图1)。
2.2 转染细胞中BHRF1表达的检测 BHRF1-CNE2细胞的杂交结果为阳性，而CNE2和含空载体的对照细胞的结果为阴性，说明BHRF1在转染细胞中已经表达(图2)。
2.3 BHRF1表达对细胞周期各时相分布的影响 从表1可见，BHRF1-CNE2细胞位于G1期的细胞比较CNE2及空载体-CNE2细胞为高，而位于S期的细胞百分比下降，其间的差异有显著的意义(P<0.05)。而空载体-CNE2与CNE2细胞周期分布间的差异无显著意义。
2.4 BHRF1表达对CNE2细胞在缺血清条件下增殖的影响 如表2所示，空载体-CNE2细胞和CNE2细胞组的细胞数在第1～3天轻度下降；在第4～6天细胞数明显下降，其增殖率下降约达50%，至第8天细胞基本死亡。而BHRF1-CNE2细胞数
, 百拇医药
图1 重组高表达载体BHRF1-pcDNA3的构建
Fig 1 Reconstruction of high expression
vector BHRF1-pcDNA3
A: pcDNA3 plasmid; B: pcDNA3 plasmid digested by XbaⅠ and EcoRⅠ; C: BHRF1 fragment; D: BHRF1-pcDNA3 plasmid digested by XbaⅠ and EcoRⅠ; E: λDNA/Hin Ⅲ+EcoRⅠ Markers; F: BHRF1-pSG5 plasmid digested by XbaⅠ and EcoRⅠ; G: BHRF1-pSG5 plasmid
, 百拇医药
图2 Northern杂交检测含BHRF1-pcDNA3
质粒的CNE2细胞BHRF1的表达
Fig 2 BHRF1 expression in CNE2 which
included BHRF1-pcDNA3 expression
vector by Northern hybridization
a: BHRF1-CNE2 cells; b: Vector-CNE2 cells; c: CNE2 cells
表1 BHRF1表达对CNE2细胞周期分布的影响
Tab 1 The effect of BHRF1 expression on
, http://www.100md.com
CNE2 cell cycle redistribution(±s,%)
Group
G1
G2
S
CNE2
46.6± 8.6
17.2±5.9
36.2
, 百拇医药
Vector-CNE2
28.5± 9.7
18.4±4.4
33.1
BHRF1-CNE2
59.2±11.3*
23.2±6.4*
17.6*
*P<0.05 vs CNE2 groups
则表现缓慢的下降。
, 百拇医药 3 讨 论
BHRF1与原癌基因Bcl-2有22%的同源序列。 通过转 基因技术将 BHRF1转染到人鳞癌细胞株
表2 BHRF1表达对CNE2细胞在缺血清条件下增殖的影响
Tab 2 The effect of BHRF1 expression on CNE2 cell proliferation under serum free condition
Group
Day (t/d)
1
2
3
, 百拇医药
4
5
6
7
8
9
10
CNE2
0.53
0.50
0.43
0.22
0.10
, 百拇医药 0.06
0.03
0.02
0.01
0.00
Vector-CNE2
0.56
0.52
0.46
0.26
0.16
0.07
0.05
, 百拇医药
0.03
0.02
0.01
BHRF1-CNE2
0.55
0.53
0.52
0.49*
0.45**
0.37**
0.33**
0.27**
, http://www.100md.com
0.25**
0.19**
The numerical values in the table are the ratio of the light density of survival cells dissolved by MTT to that of pure water at room temperature;*P<0.05, **P<0.01 vs CNE2 groups
SCC12F细胞中，发现BHRF1在肿瘤细胞中的表达可延缓细胞的终末分化，有增加抵抗DNA损伤药物的能力，促进其在无血清情况下生存，以防止细胞凋亡的发生[1]。用细胞分馏分析发现，BHRF1存在于线粒体、微粒体和核体内，类似于Bcl-2[2,3]。BHRF1和Bcl-2具有部分相同的氨基酸序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机制，即有抑制细胞凋亡、维持持续生长的能力[4,5]。
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本研究将BHRF1转入鼻咽癌细胞株CNE2中，结果发现，BHRF1的表达可以促使癌细胞周期各时相的重新分布，使G1期细胞的百分比升高，S期细胞百分比下降。由于处于静息期的细胞增多，导致其对低血清条件的耐受性增强，生存时间明显延长，提示BHRF1具有促进EB病毒感染细胞生存的能力，并可能在EB病毒诱发鼻咽癌的过程中起一定的作用。
参 考 文 献
1 Tarodi B, Subramanian T, Chinnadurai G. Epstein-Barr virus BHRF1 protein protects against cell death induced by DNA-damaging agents and heterologous viral infection. Virology, 1994, 201(2):404
2 Hickish T, Robertson D, Clarke P, et al. Ultrastructural localization of BHRF1: an Epstein-Barr virus gene product which has homology with bcl-2. Cancer Res, 1994, 54(10): 2808
, http://www.100md.com
3 Dawson CW,Eliopoulos AG,Dawson J, et al. BHRF1, a viral homologue of the Bcl-2 oncogene, disturbs epithelial cell differentiation. Oncogene,1995,9(1):69
4 陈鸿霖，Sham J，Choy D, 等. Epstein-Barr病毒基因组在鼻咽癌组织中转录的特征. 病毒学报，1995,11(1):1
5 游绍进，姚开泰，曹 亚, 等. Epstein-Barr病毒潜伏状态与鼻咽癌的关系. 中华肿瘤杂志，1996,18(1):23
(1997-08-15收稿，1997-12-03修回), 百拇医药
单位：
关键词：EB病毒；鼻咽癌；凋亡
摘 要 目的摘 要 目的：观察EB病毒基因BHRF1的表达对鼻咽癌细胞生存能力的影响。方法：通过构建携有BHRF1的高表达载体，并转染低分化鼻咽癌细胞株CNE2细胞。检测转染后癌细胞周期各时相分布的改变和在缺乏营养条件下的生长情况。结果：BHRF1的表达能使G1期细胞百分比升高，S期细胞百分比下降，癌细胞在缺血清条件下生存时间延长。结论：BHRF1的表达能促使鼻咽癌细胞周期的重新分布，以增强其在缺乏营养条件下的生存能力。
中国图书资料分类法分类号 Q 739.620.231
The effect of BHRF1 expression on CNE2 cell growth
, 百拇医药
Huang Hai, Pan Xinghua, Yu Long, Kong Xiantao, Zhou Shuimiao, Li Zhaoji, Fu Qiang, Sun Xiyuan (Department of Otolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To observe the effect of BHRF1 expression on the growth of the cell of nasopharyngeal carcinoma. Methods: High expression vector for BHRF1 was set up and transfected in low grade cell line of nasopharyngeal carcinoma, CNE2. Then the cells were tested for redistribution of cell cycle and cultivated under the condition of insufficient nutrition. Results: BHRF1 expression increased cell percentage in G1 phase and decreased cell percentage in S phase, which prolonged cell survival under the condition of nutrition deprivation. Conclusion: BHRF1 expression can redistribute cell cycle and enhance survival of tumor cells.
, 百拇医药
Key words Epstein-Barr virus ; nasopharyngeal carcinoma ; apoptosis
EB病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明确相关。在鼻咽癌患者的血清中VCA-IgA多为阳性，且其滴度改变与病情变化呈正相关。研究发现大多数鼻咽癌标本中存在EB病毒基因。EB病毒基因组为双链DNA，包含17.2万碱基对，编码100多个基因，其中有约10个与病毒介导的细胞增生有关。虽然EB病毒潜伏基因与细胞恶变有关，但参与EB病毒复制的病毒蛋白也可能影响致瘤过程。BHRF1是EB病毒编码的一种即早期蛋白，具有抑制细胞凋亡的作用。本研究通过向低分化鼻咽癌细胞株CNE2细胞中转染携有BHRF1的高表达载体，以探讨BHRF1表达对鼻咽癌细胞生长的影响。
1 材料和方法
1.1 BHRF1重组表达载体构建和鉴定 分别将BHRF1-pSG5(英国Dawson教授惠赠)和pcDNA3质粒用XbaⅠ和EcoRⅠ(Pharmacia公司)进行酶切，经低熔点凝胶回收0.9 kb的BHRF1和5.4 kb的pcDNA3片段。3 mol/L乙酸钠、无水乙醇提纯，70%乙醇漂洗，晾干后溶于纯水，凝胶电泳鉴定。将50 ng的BHRF1与50 ng的pcDNA3混合，T4连接酶16℃连接过夜，转化感受态细胞。柱抽提法提取质粒，酶切鉴定。
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1.2 脂质体介导载体转染 转染前先将细胞培养24 h；分别将重组表达质粒或空载体质粒2 μg以及6 μl的脂质体分别与100 μl无血清的培养基混匀，再将两者混匀，室温温育45 min；将细胞用无血清的培养基洗两遍；向质粒与脂质体形成的复合物中加入800 μl的无血清培养基并混匀后，加到转染细胞的表面，温育5 h；将细胞用PBS冲洗两遍后，加入含血清的培养基温育72 h；加G418选择稳定表达新霉素抗性基因的细胞，并进行扩增。
1.3 Northern杂交检测转染细胞BHRF1的表达 收取培养24 h的CNE2细胞、含空载体的CNE2细胞及BHRF1-CNE2细胞，利用细胞总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提细胞的总RNA。于1%甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳，将凝胶中的总RNA转移到尼龙膜上，80℃烘2 h固定、预杂交。取酶切提纯的BHRF1片段，随机引物扩增法制备32P标记探针，检测标记率约为80%。G50柱过滤标记物，煮沸后注入杂交盒中杂交18 h。反复洗膜。-80℃放射自显影，洗片。
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1.4 流式细胞仪检测细胞周期分布 细胞传代培养24 d，胰酶消化，生理盐水漂洗，70%乙醇固定，0.05%碘化丙啶染色，取1×106个/ml用流式细胞仪分析细胞周期的分布。
1.5 BHRF1表达对CNE2细胞在缺血清条件下生存能力的影响 将CNE2细胞、含有空载体的CNE2细胞及BHRF1转染细胞分别接种于96孔平底板(4×103个/孔)，培养24 h。吸去培养液，加入新鲜的不含血清的培养液，再继续培养10 d，并不再加入新鲜培养液。每天每组用MTT处理3孔，以检测活细胞的数量。
1.6 统计学处理 数据以
±s表示，采用χ2检验。, 百拇医药
2 结 果
2.1 重组BHRF1高表达载体的酶切鉴定 将重组BHRF1-pcDNA3质粒及BHRF1-pSG5质粒分别用XbaⅠ和EcoRⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，检查发现其均有大小约0.9 kb的片段，提示重组高表达载体构建成功(图1)。
2.2 转染细胞中BHRF1表达的检测 BHRF1-CNE2细胞的杂交结果为阳性，而CNE2和含空载体的对照细胞的结果为阴性，说明BHRF1在转染细胞中已经表达(图2)。
2.3 BHRF1表达对细胞周期各时相分布的影响 从表1可见，BHRF1-CNE2细胞位于G1期的细胞比较CNE2及空载体-CNE2细胞为高，而位于S期的细胞百分比下降，其间的差异有显著的意义(P<0.05)。而空载体-CNE2与CNE2细胞周期分布间的差异无显著意义。
2.4 BHRF1表达对CNE2细胞在缺血清条件下增殖的影响 如表2所示，空载体-CNE2细胞和CNE2细胞组的细胞数在第1～3天轻度下降；在第4～6天细胞数明显下降，其增殖率下降约达50%，至第8天细胞基本死亡。而BHRF1-CNE2细胞数
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图1 重组高表达载体BHRF1-pcDNA3的构建
Fig 1 Reconstruction of high expression
vector BHRF1-pcDNA3
A: pcDNA3 plasmid; B: pcDNA3 plasmid digested by XbaⅠ and EcoRⅠ; C: BHRF1 fragment; D: BHRF1-pcDNA3 plasmid digested by XbaⅠ and EcoRⅠ; E: λDNA/Hin Ⅲ+EcoRⅠ Markers; F: BHRF1-pSG5 plasmid digested by XbaⅠ and EcoRⅠ; G: BHRF1-pSG5 plasmid
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图2 Northern杂交检测含BHRF1-pcDNA3
质粒的CNE2细胞BHRF1的表达
Fig 2 BHRF1 expression in CNE2 which
included BHRF1-pcDNA3 expression
vector by Northern hybridization
a: BHRF1-CNE2 cells; b: Vector-CNE2 cells; c: CNE2 cells
表1 BHRF1表达对CNE2细胞周期分布的影响
Tab 1 The effect of BHRF1 expression on
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CNE2 cell cycle redistribution(
±s,%)Group
G1
G2
S
CNE2
46.6± 8.6
17.2±5.9
36.2
, 百拇医药
Vector-CNE2
28.5± 9.7
18.4±4.4
33.1
BHRF1-CNE2
59.2±11.3*
23.2±6.4*
17.6*
*P<0.05 vs CNE2 groups
则表现缓慢的下降。
, 百拇医药 3 讨 论
BHRF1与原癌基因Bcl-2有22%的同源序列。 通过转 基因技术将 BHRF1转染到人鳞癌细胞株
表2 BHRF1表达对CNE2细胞在缺血清条件下增殖的影响
Tab 2 The effect of BHRF1 expression on CNE2 cell proliferation under serum free condition
Group
Day (t/d)
1
2
3
, 百拇医药
4
5
6
7
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10
CNE2
0.53
0.50
0.43
0.22
0.10
, 百拇医药 0.06
0.03
0.02
0.01
0.00
Vector-CNE2
0.56
0.52
0.46
0.26
0.16
0.07
0.05
, 百拇医药
0.03
0.02
0.01
BHRF1-CNE2
0.55
0.53
0.52
0.49*
0.45**
0.37**
0.33**
0.27**
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0.25**
0.19**
The numerical values in the table are the ratio of the light density of survival cells dissolved by MTT to that of pure water at room temperature;*P<0.05, **P<0.01 vs CNE2 groups
SCC12F细胞中，发现BHRF1在肿瘤细胞中的表达可延缓细胞的终末分化，有增加抵抗DNA损伤药物的能力，促进其在无血清情况下生存，以防止细胞凋亡的发生[1]。用细胞分馏分析发现，BHRF1存在于线粒体、微粒体和核体内，类似于Bcl-2[2,3]。BHRF1和Bcl-2具有部分相同的氨基酸序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机制，即有抑制细胞凋亡、维持持续生长的能力[4,5]。
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本研究将BHRF1转入鼻咽癌细胞株CNE2中，结果发现，BHRF1的表达可以促使癌细胞周期各时相的重新分布，使G1期细胞的百分比升高，S期细胞百分比下降。由于处于静息期的细胞增多，导致其对低血清条件的耐受性增强，生存时间明显延长，提示BHRF1具有促进EB病毒感染细胞生存的能力，并可能在EB病毒诱发鼻咽癌的过程中起一定的作用。
参 考 文 献
1 Tarodi B, Subramanian T, Chinnadurai G. Epstein-Barr virus BHRF1 protein protects against cell death induced by DNA-damaging agents and heterologous viral infection. Virology, 1994, 201(2):404
2 Hickish T, Robertson D, Clarke P, et al. Ultrastructural localization of BHRF1: an Epstein-Barr virus gene product which has homology with bcl-2. Cancer Res, 1994, 54(10): 2808
, http://www.100md.com
3 Dawson CW,Eliopoulos AG,Dawson J, et al. BHRF1, a viral homologue of the Bcl-2 oncogene, disturbs epithelial cell differentiation. Oncogene,1995,9(1):69
4 陈鸿霖，Sham J，Choy D, 等. Epstein-Barr病毒基因组在鼻咽癌组织中转录的特征. 病毒学报，1995,11(1):1
5 游绍进，姚开泰，曹 亚, 等. Epstein-Barr病毒潜伏状态与鼻咽癌的关系. 中华肿瘤杂志，1996,18(1):23
(1997-08-15收稿，1997-12-03修回), 百拇医药