肿瘤的G-CSF基因治疗及肿瘤原位细胞生物学特性
作者：孙延平 曹雪涛△ 王全兴△ 王元和 施靖华 高 瀚
单位：
关键词：粒细胞集落刺激因子；基因治疗；结肠肿瘤；脂质体；MHCⅠ类分子；粘附分子
摘要 目的摘要 目的：研究瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因的抗肿瘤作用及其可能机制。方法：将脂质体包裹的G-CSF基因直接注射至小鼠结肠癌瘤体内，观察G-CSF基因治疗的抗肿瘤效果及肿瘤细胞性状的变化。结果：瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后，可明显抑制结肠癌小鼠肿瘤的生长，显著延长存活期；配合大剂量化疗后效果更显著，有30%的小鼠存活90 d以上。从瘤体内分离的肿瘤细胞，经G418(600 μg/ml)抗性筛选后，产生抗G418 的抗性克隆,并分泌人G-CSF(hG-CSF)；经Northern-blot鉴定显示，该肿瘤细胞可表达G-CSF mRNA；肿瘤细胞表面表达ICAM-1分子、MHCⅠ类抗原(H-2Kd)均明显高于对照组。结论：瘤体内注射脂质体包裹的G -CSF基因后，可在肿瘤原位将G-CSF基因转染肿瘤细胞并有效表达，提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于激活局部抗肿瘤免疫反应而发挥抗肿瘤作用。
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中国图书资料分类法分类号 R 730.5
Antitumor effect of intratumoral injection of liposome-encapsulated G-CSF gene and in situ biological characteristics of the treated tumor cells
Sun Yanping, Cao Xuetao,Wang Quanxing, Wang Yuanhe,Shi Jinghua,Gao Han (Department of General Surgery,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To investigate the antitumor effects of the in vivo G-CSF gene therapy mediated by liposome and its mechanisms. Methods: Human G-CSF gene was encapsulated into liposome and was directly injected into C-26 colon adenocarcinoma tumor mass in mice. Results: After direct intratumoral injection of G-CSF DNA-liposome, the tumor growth was dramatically inhibited and the survival time was prolonged significantly. Tumor regression could be observed in about 30% of C-26-bearing mice.By the analysis of the antitumor mechanisms, we found that anti-G418(600 μg/ml) clone could be selected from the tumor cells freshly separated from the treated C-26 tumor mass,and secretion of G-CSF in the supernatant could be detected. Northern-blot also confirmed the expression of hG-CSF by the tumor cells. Higher expressions of MHC class Ⅰ(H-2Kd) molecule and ICAM-1 on the tumor cells could be observed. Conclusion: The results demonstrate that liposome can effectively transfect G-CSF gene into tumor cells in situ, and then increase the immunogenicity of the tumor cells which may contribute to the activation of the local antitumor immune responses.
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Key words granulocyte colony-stimulating factor; gene therapy; colon neoplasms; liposome; MHC class Ⅰ molecule; adhesion molecule
近年来的研究表明,将某些细胞因子基因转入肿瘤细胞后,不但能够降低其致瘤性,还能明显改变肿瘤细胞本身的某些生物学特性,增强其免疫原性,能更有效地促进机体免疫细胞的识别及激活;并能通过肿瘤局部分泌细胞因子,激活抗肿瘤免疫反应,提高抗肿瘤作用的效果[1]。国外学者证明将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因体外转染入肿瘤细胞后，可降低肿瘤细胞的致瘤性[2]。我们也曾证明成纤维细胞介导的腹腔途径G-CSF基因治疗可以有效地拮抗结肠癌的肝转移，且与化疗合用后治疗效果更佳[3]。为了探讨脂质体介导的直接体内途径的G-CSF基因治疗的可行性， 我们将脂质体包裹的G-CSF基因直接注射至结肠癌小鼠瘤体内，研究其抗肿瘤作用的效果及其可能的机制。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 基因重组人G-CSF(rhG-CSF，商品名Filgrastim,300 μg/支)购自日本麒麟株式会社;rhG-CSF标准品购自Boehringer,比活性为1×107 U/mg; 5-氟尿嘧啶(5-Fu)、G418购自Sigma;逆转录病毒载体pLXSN由德国MDC分子医学中心Blankenstein教授惠赠; α-32P标记的ATP、硝酸纤维滤膜购于Amersham;Lipofectin、随机引物标记试剂盒、荧光标记的抗小鼠 MHC-Ⅰa 单抗及兔抗大鼠IgG购自Gibco公司。
1.2 细胞株 C-26结肠癌细胞株(H-2Kd)由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏教授惠赠；G-CSF检测细胞株NSF60,以及JM109，HB101菌株由本校免疫学教研室保存。
1.3 hG-CSF基因表达载体的构建、质粒DNA的抽提与纯化 hG-CSF基因表达载体pLGSN由本校免疫学教研室构建,详见文献[4]；碱变性裂解法大量粗提质粒DNA，然后用PEG沉淀法纯化质粒DNA。用UV分光光度法测定质粒DNA的浓度。
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1.4 G-CSF DNA探针 用随机寡核苷酸引物法标记DNA探针。采用异硫氰酸胍一步法抽提培养细胞的RNA,在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳后,将变性RNA转移至尼龙滤膜,进行Northern印迹杂交和放射自显影,最后判断结果。
1.5 G-CSF活性的检测 用NSF60作为检测细胞,MTS/PMS比色法进行检测,结果用hG-CSF标准品标化。
1.6 单抗的制备 分泌大鼠抗小鼠的粘附分子(ICAM-1，CD11α)单抗(IgG2b)及分泌小鼠抗小鼠H-2Kd单抗(IgG2a)的杂交瘤细胞株M 17/4及SF1-1.1(购自美国ATCC), 将上述杂交瘤细胞体外扩增后接种裸鼠,收集腹水,抗MHCⅠ类抗原单抗经Protein A Sepharose-4B CL (Pharmacia)亲和层析柱纯化制备；抗ICAM-1单抗腹水经饱和硫酸铵盐析, Sephadex G-25除盐后, 经DEAE-Sepharose 4B离子交换法纯化备用。
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1.7 实验动物和实验治疗 BALB/c小鼠购自上海西普尔-必凯动物有限公司。按文献[5]方法制备C-26结肠癌小鼠和进行实验治疗。动物分A～G组，分别给予PBS，5-Fu，对照质粒DNA，rhG-CSF，G-CSF DNA，5-Fu+rhG-CSF，5-Fu+ G-CSF DNA，每组20只小鼠。治疗后,每隔3 d按Winn测量法用游标卡尺测量肿瘤大小,测量结果用二垂直方向直径平均值表示。疗效判断包括瘤体大小的测量及小鼠存活期的观察。
1.8 原位肿瘤细胞hG-CSF mRNA表达的鉴定 取瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因的小鼠及对照组小鼠的瘤体,分离肿瘤细胞[6],提取RNA后作Northern印迹。
1.9 原位肿瘤细胞MHCⅠ类分子和ICAM-1表达的检测 取瘤体内新鲜分离的1×106个肿瘤细胞悬于1 ml PBS中,加10 μl抗H-2Kd单抗或10 μl抗ICAM-1单抗，4℃孵育30 min后,PBS液洗涤3次。重新悬于1 ml PBS中,加入荧光标记的兔抗鼠二抗10 μl,4℃孵育30 min,PBS液洗涤3次后重新悬于0.2ml的PBS中,流式细胞仪检测结合荧光抗体细胞数,结果用结合荧光抗体细胞数占总细胞的百分数表示。
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1.10 统计学处理 采用未配对资料的t检验。
2 结 果
2.1 对结肠癌生长的影响[5] 结果表明，瘤体内注射rhG-CSF及G-CSF基因均对肿瘤的生长有抑制作用，而瘤体内脂质体介导的G-CSF基因治疗对肿瘤的抑制效果很明显,联合化疗后,对肿瘤的抑制效果更佳。
2.2 结肠癌小鼠存活期的改变 瘤体内注射脂质体包裹PBS及脂质体包裹的对照质粒后，荷瘤小鼠的存活期分别为(29.0±3.7)，(29.6±3.4)d，无明显的差异。荷瘤小鼠瘤体内注射rhG-CSF后，存活期明显延长[(35.2±5.4)d,P<0.05]；注射脂质体包裹的G-CSF基因后，存活期延长更明显[(48.0 ±10.6)d,P<0.01]。腹腔注射5-Fu后，虽可见抑制肿瘤的生长，但小鼠的存活期未延长[(30.0±5.7)d]，部分小鼠存活期反而更短; 瘤体内注射rhG-CSF后配合大剂量化疗，可以明显延长荷瘤小鼠的存活期[(41.7 ±8.2)d,P<0.01)]，但未见荷瘤小鼠有存活90 d以上者；而瘤体内脂质体介导的G-CSF基因治疗配合大剂量化疗后，可以非常明显地延长荷瘤小鼠的存活期[(63.2±20.4)d,P<0.01)]，并可使30%的荷瘤小鼠存活90 d以上。
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2.3 实体瘤细胞hG-CSF mRNA的表达及分泌G-CSF的观察 图1为肿瘤细胞提取RNA后的Northern-blot分析结果。在瘤体内注射pLGSN质粒的肿瘤细胞可检测到一杂交信号带，而瘤体内注射脂质体包裹的对照质粒呈阴性。于瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因14 d后，从荷瘤小鼠新鲜分离肿瘤细胞，经含600 μg/ml G418的培养液培养2周后，筛选出阳性克隆,上清中含有G-CSF,其表达量1×105个细胞每24 h为(28±4)～(150±10) U/ml,而瘤体内注射rhG-CSF组小鼠,瘤体肿瘤细胞均被G418杀死。
2.4 肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子及ICAM-1的表达 瘤体内注射rhG-CSF后,肿瘤细胞表达H-2Kd分子与对照组无明显差异(注射脂质体包裹的PBS及对照质粒组分别为23.0%及27.6%,注射rhG-CSF组为31.2%)。瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后,新鲜分离的肿瘤细胞表达的H-2Kd分子明显增加，高达65.3%。瘤体内注射rhG-CSF后，肿瘤细胞表面ICAM-1分子的表达为22.2%，这明显地高于瘤体内注射脂质体包裹的PBS组的11.3%；而瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后，肿瘤细胞对ICAM-1分子表达水平为24.6%,较瘤体内注射rhG-CSF组亦有一定的提高(图2)， 表明rhG-CSF瘤体内注射后可以提高ICAM-1的表达,但是对MHCⅠ类分子无明显的影响， 而瘤体内脂质体介导的G-CSF基因治疗可以明显地提高肿瘤细胞ICAM-1及MHCⅠ类抗原的表达。
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图1 瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因
后肿瘤细胞 Northern 印迹分析
Fig 1 Northern blot analysis of tumor cells after
intratumoral injection of G-CSF DNA-liposome
lane 1 : Control DNA-liposome； lane 2 : G-CSF DNA-liposome
图2 瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后ICAM-1分子的表达
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Fig 2 Expression of ICAM-1 molecule on the tumor cells after intratumoral injection of G-CSF DNA-liposome
A：PBS； B：Control plasmid； C：5-Fu； D：rhG-CSF； E：G-CSF DNA； F：5-Fu+rhG-CSF； G：5-Fu+G-CSF DNA
3 讨 论
由于多数肿瘤细胞的抗原性较弱,机体免疫细胞较难识别肿瘤细胞，因此难以激活抗肿瘤免疫反应。人们正从不同的角度寻找有效的激活机体抗肿瘤作用的方法,途径之一是将细胞因子基因转染的载体细胞埋植于体内,通过不断分泌细胞因子,激活免疫细胞的活性,提高机体对肿瘤细胞的杀伤效果。另一途径是将细胞因子基因转染肿瘤细胞,制成分泌细胞因子的瘤苗后,肿瘤细胞的致瘤性明显降低,并可改变细胞表面的某些活性分子,从而增强免疫原性, 提高机体产生主动的、特异性抗肿瘤免疫的能力[7，8] 。本研究结果表明,瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后,可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长, 并延长小鼠的存活期；配合腹腔内大剂量化疗后效果更明显。
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瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后,肿瘤细胞经G418筛选,可产生抗G418的克隆,并在克隆上清中检测有G-CSF,表明G-CSF基因在肿瘤部位直接转染至肿瘤细胞内。Northern blot也证明了G-CSF基因可原位转染肿瘤细胞。G-CSF基因转移至C-26细胞后,其表面H-2Kd分子表达明显增多,表明MHCⅠ类抗原表达增强。由于肿瘤细胞表达抗原时需与细胞内合成的MHCⅠ类分子形成抗原-MHCⅠ类分子复合物，才能表达于肿瘤细胞的表面，而CD8+T细胞(CTL)在识别及杀伤肿瘤细胞时，也必须在识别肿瘤特异性抗原的同时识别MHCⅠ类分子，即受MHCⅠ类限制，因此，MHCⅠ类分子表达的增强可以提高肿瘤细胞被CTL细胞识别和杀伤的效果。通过FACS分析C-26细胞表面的ICAM-1, 证实了G-CSF基因治疗后的C-26细胞表面表达的ICAM -1分子明显地高于对照组。ICAM-1是表达于肿瘤细胞表面的粘附分子，为淋巴细胞相关抗原-1(LAF-1)的配体，在CTL识别肿瘤抗原中起相应的作用。肿瘤细胞表面ICAM-1分子表达的增多, 可以提高肿瘤细胞与CTL结合的效率，提高CTL对肿瘤抗原的识别和杀伤能力。其他学者也证实了G-CSF具有很强的体内外促进凝集素粘附分子-1(LELAM-1)、ICAM-1表达的作用[9,10]。我们的研究结果提示,体内G-CSF基因转染后可增强C-26细胞的免疫原性。这与国外学者发现的体外G-CSF基因转染可以明显降低C-26细胞的致瘤性,增强肿瘤细胞的免疫原性的研究结果一致[2] 。我们在实验中观察到瘤体内G-CSF基因治疗后，可以在肿瘤局部提高肿瘤浸润淋巴细胞的功能，这种活性的提高可能与肿瘤细胞免疫原性的增强对T细胞的直接刺激，以及局部微环境中所分泌的G-CSF的趋化作用, 并通过激活某些细胞分泌IL-1或TNF等细胞因子，使更多的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞在肿瘤部位的集结增多有关[10]，从而提高肿瘤局部的免疫反应。
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参 考 文 献
1 Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A，et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc Natl Acad Sci USA，1993, 90(11): 3539
2 Colombo MP, Lombardi L, Stoppacciaro A，et al. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) gene transduction in murine adenocarcinoma drives neutrophil-mediated tumor inhibition in vivo. J Immunol，1992, 149(1): 113
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3 孙延平，曹雪涛，王全兴,等. G-CSF基因治疗配合大剂量化疗抗结肠癌肝转移的效果及其机制探讨.第二军医大学学报, 1998,19(1):13
4 章卫平,曹雪涛,马施华,等.人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建.中国肿瘤生物治疗杂志, 1996,3(1):26
5 孙延平，曹雪涛，王全兴,等.瘤体内注射G-CSF基因诱导肿瘤细胞凋亡及局部病理分析.第二军医大学学报, 1997,18(5):409
6 曹雪涛,杨嗣坤,叶天星. 肿瘤浸润性淋巴细胞的分离与培养与表型分析.上海免疫学杂志，1989，9(4):262
7 Hock H,Dorzch M,Kunzendorf U,et al.Mechanisms of rejection induced by tumor cell-targeted gene transfer of IL-1,IL-4,IL-7,TNF or IFN-gamma. Proc Natl Acad Sci USA, 1993，90(9):2247
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8 Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf IGH. Cytokines and gene therapy.Immunol Today, 1995,16(7):173
9 Smith CW, Kishimoto TK, Abbass O, et al. Chemotactic factors regulate lectin adhesion molecule 1(LECAM-1) dependent neutrophil adhesion to cytokine-stimulated endothelial cells in vitro. J Clin Invest ,1991, 87(4): 609
10 Osborn L. Leukocyte adhesion to endothelium in inflammation. Cell, 1990, 62(1):3
(1997-09-20收稿，1997-12-20修回), 百拇医药
单位：
关键词：粒细胞集落刺激因子；基因治疗；结肠肿瘤；脂质体；MHCⅠ类分子；粘附分子
摘要 目的摘要 目的：研究瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因的抗肿瘤作用及其可能机制。方法：将脂质体包裹的G-CSF基因直接注射至小鼠结肠癌瘤体内，观察G-CSF基因治疗的抗肿瘤效果及肿瘤细胞性状的变化。结果：瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后，可明显抑制结肠癌小鼠肿瘤的生长，显著延长存活期；配合大剂量化疗后效果更显著，有30%的小鼠存活90 d以上。从瘤体内分离的肿瘤细胞，经G418(600 μg/ml)抗性筛选后，产生抗G418 的抗性克隆,并分泌人G-CSF(hG-CSF)；经Northern-blot鉴定显示，该肿瘤细胞可表达G-CSF mRNA；肿瘤细胞表面表达ICAM-1分子、MHCⅠ类抗原(H-2Kd)均明显高于对照组。结论：瘤体内注射脂质体包裹的G -CSF基因后，可在肿瘤原位将G-CSF基因转染肿瘤细胞并有效表达，提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于激活局部抗肿瘤免疫反应而发挥抗肿瘤作用。
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中国图书资料分类法分类号 R 730.5
Antitumor effect of intratumoral injection of liposome-encapsulated G-CSF gene and in situ biological characteristics of the treated tumor cells
Sun Yanping, Cao Xuetao,Wang Quanxing, Wang Yuanhe,Shi Jinghua,Gao Han (Department of General Surgery,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To investigate the antitumor effects of the in vivo G-CSF gene therapy mediated by liposome and its mechanisms. Methods: Human G-CSF gene was encapsulated into liposome and was directly injected into C-26 colon adenocarcinoma tumor mass in mice. Results: After direct intratumoral injection of G-CSF DNA-liposome, the tumor growth was dramatically inhibited and the survival time was prolonged significantly. Tumor regression could be observed in about 30% of C-26-bearing mice.By the analysis of the antitumor mechanisms, we found that anti-G418(600 μg/ml) clone could be selected from the tumor cells freshly separated from the treated C-26 tumor mass,and secretion of G-CSF in the supernatant could be detected. Northern-blot also confirmed the expression of hG-CSF by the tumor cells. Higher expressions of MHC class Ⅰ(H-2Kd) molecule and ICAM-1 on the tumor cells could be observed. Conclusion: The results demonstrate that liposome can effectively transfect G-CSF gene into tumor cells in situ, and then increase the immunogenicity of the tumor cells which may contribute to the activation of the local antitumor immune responses.
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Key words granulocyte colony-stimulating factor; gene therapy; colon neoplasms; liposome; MHC class Ⅰ molecule; adhesion molecule
近年来的研究表明,将某些细胞因子基因转入肿瘤细胞后,不但能够降低其致瘤性,还能明显改变肿瘤细胞本身的某些生物学特性,增强其免疫原性,能更有效地促进机体免疫细胞的识别及激活;并能通过肿瘤局部分泌细胞因子,激活抗肿瘤免疫反应,提高抗肿瘤作用的效果[1]。国外学者证明将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因体外转染入肿瘤细胞后，可降低肿瘤细胞的致瘤性[2]。我们也曾证明成纤维细胞介导的腹腔途径G-CSF基因治疗可以有效地拮抗结肠癌的肝转移，且与化疗合用后治疗效果更佳[3]。为了探讨脂质体介导的直接体内途径的G-CSF基因治疗的可行性， 我们将脂质体包裹的G-CSF基因直接注射至结肠癌小鼠瘤体内，研究其抗肿瘤作用的效果及其可能的机制。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 基因重组人G-CSF(rhG-CSF，商品名Filgrastim,300 μg/支)购自日本麒麟株式会社;rhG-CSF标准品购自Boehringer,比活性为1×107 U/mg; 5-氟尿嘧啶(5-Fu)、G418购自Sigma;逆转录病毒载体pLXSN由德国MDC分子医学中心Blankenstein教授惠赠; α-32P标记的ATP、硝酸纤维滤膜购于Amersham;Lipofectin、随机引物标记试剂盒、荧光标记的抗小鼠 MHC-Ⅰa 单抗及兔抗大鼠IgG购自Gibco公司。
1.2 细胞株 C-26结肠癌细胞株(H-2Kd)由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏教授惠赠；G-CSF检测细胞株NSF60,以及JM109，HB101菌株由本校免疫学教研室保存。
1.3 hG-CSF基因表达载体的构建、质粒DNA的抽提与纯化 hG-CSF基因表达载体pLGSN由本校免疫学教研室构建,详见文献[4]；碱变性裂解法大量粗提质粒DNA，然后用PEG沉淀法纯化质粒DNA。用UV分光光度法测定质粒DNA的浓度。
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1.4 G-CSF DNA探针 用随机寡核苷酸引物法标记DNA探针。采用异硫氰酸胍一步法抽提培养细胞的RNA,在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳后,将变性RNA转移至尼龙滤膜,进行Northern印迹杂交和放射自显影,最后判断结果。
1.5 G-CSF活性的检测 用NSF60作为检测细胞,MTS/PMS比色法进行检测,结果用hG-CSF标准品标化。
1.6 单抗的制备 分泌大鼠抗小鼠的粘附分子(ICAM-1，CD11α)单抗(IgG2b)及分泌小鼠抗小鼠H-2Kd单抗(IgG2a)的杂交瘤细胞株M 17/4及SF1-1.1(购自美国ATCC), 将上述杂交瘤细胞体外扩增后接种裸鼠,收集腹水,抗MHCⅠ类抗原单抗经Protein A Sepharose-4B CL (Pharmacia)亲和层析柱纯化制备；抗ICAM-1单抗腹水经饱和硫酸铵盐析, Sephadex G-25除盐后, 经DEAE-Sepharose 4B离子交换法纯化备用。
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1.7 实验动物和实验治疗 BALB/c小鼠购自上海西普尔-必凯动物有限公司。按文献[5]方法制备C-26结肠癌小鼠和进行实验治疗。动物分A～G组，分别给予PBS，5-Fu，对照质粒DNA，rhG-CSF，G-CSF DNA，5-Fu+rhG-CSF，5-Fu+ G-CSF DNA，每组20只小鼠。治疗后,每隔3 d按Winn测量法用游标卡尺测量肿瘤大小,测量结果用二垂直方向直径平均值表示。疗效判断包括瘤体大小的测量及小鼠存活期的观察。
1.8 原位肿瘤细胞hG-CSF mRNA表达的鉴定 取瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因的小鼠及对照组小鼠的瘤体,分离肿瘤细胞[6],提取RNA后作Northern印迹。
1.9 原位肿瘤细胞MHCⅠ类分子和ICAM-1表达的检测 取瘤体内新鲜分离的1×106个肿瘤细胞悬于1 ml PBS中,加10 μl抗H-2Kd单抗或10 μl抗ICAM-1单抗，4℃孵育30 min后,PBS液洗涤3次。重新悬于1 ml PBS中,加入荧光标记的兔抗鼠二抗10 μl,4℃孵育30 min,PBS液洗涤3次后重新悬于0.2ml的PBS中,流式细胞仪检测结合荧光抗体细胞数,结果用结合荧光抗体细胞数占总细胞的百分数表示。
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1.10 统计学处理 采用未配对资料的t检验。
2 结 果
2.1 对结肠癌生长的影响[5] 结果表明，瘤体内注射rhG-CSF及G-CSF基因均对肿瘤的生长有抑制作用，而瘤体内脂质体介导的G-CSF基因治疗对肿瘤的抑制效果很明显,联合化疗后,对肿瘤的抑制效果更佳。
2.2 结肠癌小鼠存活期的改变 瘤体内注射脂质体包裹PBS及脂质体包裹的对照质粒后，荷瘤小鼠的存活期分别为(29.0±3.7)，(29.6±3.4)d，无明显的差异。荷瘤小鼠瘤体内注射rhG-CSF后，存活期明显延长[(35.2±5.4)d,P<0.05]；注射脂质体包裹的G-CSF基因后，存活期延长更明显[(48.0 ±10.6)d,P<0.01]。腹腔注射5-Fu后，虽可见抑制肿瘤的生长，但小鼠的存活期未延长[(30.0±5.7)d]，部分小鼠存活期反而更短; 瘤体内注射rhG-CSF后配合大剂量化疗，可以明显延长荷瘤小鼠的存活期[(41.7 ±8.2)d,P<0.01)]，但未见荷瘤小鼠有存活90 d以上者；而瘤体内脂质体介导的G-CSF基因治疗配合大剂量化疗后，可以非常明显地延长荷瘤小鼠的存活期[(63.2±20.4)d,P<0.01)]，并可使30%的荷瘤小鼠存活90 d以上。
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2.3 实体瘤细胞hG-CSF mRNA的表达及分泌G-CSF的观察 图1为肿瘤细胞提取RNA后的Northern-blot分析结果。在瘤体内注射pLGSN质粒的肿瘤细胞可检测到一杂交信号带，而瘤体内注射脂质体包裹的对照质粒呈阴性。于瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因14 d后，从荷瘤小鼠新鲜分离肿瘤细胞，经含600 μg/ml G418的培养液培养2周后，筛选出阳性克隆,上清中含有G-CSF,其表达量1×105个细胞每24 h为(28±4)～(150±10) U/ml,而瘤体内注射rhG-CSF组小鼠,瘤体肿瘤细胞均被G418杀死。
2.4 肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子及ICAM-1的表达 瘤体内注射rhG-CSF后,肿瘤细胞表达H-2Kd分子与对照组无明显差异(注射脂质体包裹的PBS及对照质粒组分别为23.0%及27.6%,注射rhG-CSF组为31.2%)。瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后,新鲜分离的肿瘤细胞表达的H-2Kd分子明显增加，高达65.3%。瘤体内注射rhG-CSF后，肿瘤细胞表面ICAM-1分子的表达为22.2%，这明显地高于瘤体内注射脂质体包裹的PBS组的11.3%；而瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后，肿瘤细胞对ICAM-1分子表达水平为24.6%,较瘤体内注射rhG-CSF组亦有一定的提高(图2)， 表明rhG-CSF瘤体内注射后可以提高ICAM-1的表达,但是对MHCⅠ类分子无明显的影响， 而瘤体内脂质体介导的G-CSF基因治疗可以明显地提高肿瘤细胞ICAM-1及MHCⅠ类抗原的表达。
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图1 瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因
后肿瘤细胞 Northern 印迹分析
Fig 1 Northern blot analysis of tumor cells after
intratumoral injection of G-CSF DNA-liposome
lane 1 : Control DNA-liposome； lane 2 : G-CSF DNA-liposome
图2 瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后ICAM-1分子的表达
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Fig 2 Expression of ICAM-1 molecule on the tumor cells after intratumoral injection of G-CSF DNA-liposome
A：PBS； B：Control plasmid； C：5-Fu； D：rhG-CSF； E：G-CSF DNA； F：5-Fu+rhG-CSF； G：5-Fu+G-CSF DNA
3 讨 论
由于多数肿瘤细胞的抗原性较弱,机体免疫细胞较难识别肿瘤细胞，因此难以激活抗肿瘤免疫反应。人们正从不同的角度寻找有效的激活机体抗肿瘤作用的方法,途径之一是将细胞因子基因转染的载体细胞埋植于体内,通过不断分泌细胞因子,激活免疫细胞的活性,提高机体对肿瘤细胞的杀伤效果。另一途径是将细胞因子基因转染肿瘤细胞,制成分泌细胞因子的瘤苗后,肿瘤细胞的致瘤性明显降低,并可改变细胞表面的某些活性分子,从而增强免疫原性, 提高机体产生主动的、特异性抗肿瘤免疫的能力[7，8] 。本研究结果表明,瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后,可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长, 并延长小鼠的存活期；配合腹腔内大剂量化疗后效果更明显。
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瘤体内注射脂质体包裹的G-CSF基因后,肿瘤细胞经G418筛选,可产生抗G418的克隆,并在克隆上清中检测有G-CSF,表明G-CSF基因在肿瘤部位直接转染至肿瘤细胞内。Northern blot也证明了G-CSF基因可原位转染肿瘤细胞。G-CSF基因转移至C-26细胞后,其表面H-2Kd分子表达明显增多,表明MHCⅠ类抗原表达增强。由于肿瘤细胞表达抗原时需与细胞内合成的MHCⅠ类分子形成抗原-MHCⅠ类分子复合物，才能表达于肿瘤细胞的表面，而CD8+T细胞(CTL)在识别及杀伤肿瘤细胞时，也必须在识别肿瘤特异性抗原的同时识别MHCⅠ类分子，即受MHCⅠ类限制，因此，MHCⅠ类分子表达的增强可以提高肿瘤细胞被CTL细胞识别和杀伤的效果。通过FACS分析C-26细胞表面的ICAM-1, 证实了G-CSF基因治疗后的C-26细胞表面表达的ICAM -1分子明显地高于对照组。ICAM-1是表达于肿瘤细胞表面的粘附分子，为淋巴细胞相关抗原-1(LAF-1)的配体，在CTL识别肿瘤抗原中起相应的作用。肿瘤细胞表面ICAM-1分子表达的增多, 可以提高肿瘤细胞与CTL结合的效率，提高CTL对肿瘤抗原的识别和杀伤能力。其他学者也证实了G-CSF具有很强的体内外促进凝集素粘附分子-1(LELAM-1)、ICAM-1表达的作用[9,10]。我们的研究结果提示,体内G-CSF基因转染后可增强C-26细胞的免疫原性。这与国外学者发现的体外G-CSF基因转染可以明显降低C-26细胞的致瘤性,增强肿瘤细胞的免疫原性的研究结果一致[2] 。我们在实验中观察到瘤体内G-CSF基因治疗后，可以在肿瘤局部提高肿瘤浸润淋巴细胞的功能，这种活性的提高可能与肿瘤细胞免疫原性的增强对T细胞的直接刺激，以及局部微环境中所分泌的G-CSF的趋化作用, 并通过激活某些细胞分泌IL-1或TNF等细胞因子，使更多的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞在肿瘤部位的集结增多有关[10]，从而提高肿瘤局部的免疫反应。
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参 考 文 献
1 Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A，et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc Natl Acad Sci USA，1993, 90(11): 3539
2 Colombo MP, Lombardi L, Stoppacciaro A，et al. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) gene transduction in murine adenocarcinoma drives neutrophil-mediated tumor inhibition in vivo. J Immunol，1992, 149(1): 113
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3 孙延平，曹雪涛，王全兴,等. G-CSF基因治疗配合大剂量化疗抗结肠癌肝转移的效果及其机制探讨.第二军医大学学报, 1998,19(1):13
4 章卫平,曹雪涛,马施华,等.人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建.中国肿瘤生物治疗杂志, 1996,3(1):26
5 孙延平，曹雪涛，王全兴,等.瘤体内注射G-CSF基因诱导肿瘤细胞凋亡及局部病理分析.第二军医大学学报, 1997,18(5):409
6 曹雪涛,杨嗣坤,叶天星. 肿瘤浸润性淋巴细胞的分离与培养与表型分析.上海免疫学杂志，1989，9(4):262
7 Hock H,Dorzch M,Kunzendorf U,et al.Mechanisms of rejection induced by tumor cell-targeted gene transfer of IL-1,IL-4,IL-7,TNF or IFN-gamma. Proc Natl Acad Sci USA, 1993，90(9):2247
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8 Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf IGH. Cytokines and gene therapy.Immunol Today, 1995,16(7):173
9 Smith CW, Kishimoto TK, Abbass O, et al. Chemotactic factors regulate lectin adhesion molecule 1(LECAM-1) dependent neutrophil adhesion to cytokine-stimulated endothelial cells in vitro. J Clin Invest ,1991, 87(4): 609
10 Osborn L. Leukocyte adhesion to endothelium in inflammation. Cell, 1990, 62(1):3
(1997-09-20收稿，1997-12-20修回), 百拇医药