假单孢杆菌外毒素基因的克隆及用于裸鼠大肠癌基因治疗
作者：曹广文 戚中田 粟山茂树△ 潘 欣 张晓琴 杜 平
单位：
关键词：假单孢杆菌外毒素；大肠肿瘤；基因疗法
摘要 目的摘要 目的: 建立假单孢杆菌外毒素A(PEA)基因的组织特异性抗大肠癌基因疗法。方法: 用PCR法从绿脓杆菌基因组DNA中克隆PEAⅡ+Ⅲ区基因, 引入Kozak序列、终止信号和酶切位点, 测序。构建PEA基因转录受人癌胚抗原(CEA)启动子调控的逆转录病毒载体。共转染法体外研究PEA基因表达对报告基因表达的特异抑制作用。用DNA体内直接转染法于裸鼠体内观察PEA基因的抗人类肿瘤作用。结果: 所克隆的PEA序列与已报道序列基本相同。CEA启动子调控的PEA基因可在大肠癌细胞中特异性抑制荧光素酶基因表达, 在裸鼠体内对人大肠癌模型的直接转染能特异抑制人大肠肿瘤的生长。结论: PEAⅡ+Ⅲ区基因作为治疗基因, 适合于大肠癌特异性基因治疗。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 735.34
Cloning of Pseudomonas exotoxin A gene and its application in colorectal carcinoma gene therapy
Cao Guangwen, Qi Zhongtian, Shigeki Kuriyama, Pan Xin, Zhang Xiaoqing, Du Ping (Department of Microbiology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University , Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To establish a human colorectal carcinoma specific gene therapy using Pseudomonas exotoxin A (PEA) gene. Methods: Polymerase Chain Reaction was employed to clone PEA domain Ⅱ+Ⅲ structural gene, introducing Kozak sequence, termination code and restriction sites. After sequencing, the PEA gene was inserted into a retroviral vector to create CEA/PEA, in which expression of the PEA gene was under the control of human carcinoembryonic antigen (CEA) promoter. In vitro cotransfection of the CEA/PEA construct and the luciferase vector was empolyed to assess translation inhibition effect of the PEA gene. The CEA/PEA was directly injected into some established human tumors in BALB/c nude mice. Growth of the tumors was subsequently examined. Results: Sequence of the PEA gene cloned in the study was almost identical to the reported data. The transfection of CEA/PEA specifically inhibited the expression of the luciferase gene in the CEA positive colorectal carcinoma cells. Direct injection of the CEA/PEA construct into the established tumor in the nude mice led to significant reductions in resultant tumor size relative to that in control groups. Conclusion: The PEA Ⅱ+Ⅲ structural gene, served as a therapeutic gene, is suitable for the tissue-specific gene therapy for malignant tumors.
, 百拇医药
Key words Pseudomonas exotoxin; colorectal carcinoma; gene therapy
目前肿瘤治疗基因在临床上能使肿瘤消退的并不多见[1]。选择强有力的治疗基因和进行肿瘤组织特异性基因治疗是肿瘤基因治疗的关键。假单孢杆菌外毒素A(PEA)是由假单孢杆菌分泌的一种单链毒素, 是强有力的真核核糖体毒素, 通过催化不可逆转的ADP核糖化, 进而失活肽链延长因子而抑制细胞的蛋白质合成。一个分子PEA足可以杀死一个真核细胞[2]。NIH著名学者 Ira Pastan 最近将PEA基因置于真核表达载体中，表达了有细胞毒性的PEA, 提示这一原核基因在真核细胞中的翻译后加工过程并不影响其功能表位的形成。研究PEA基因在肿瘤基因治疗中的作用有实际意义。
1 材料和方法
1.1 材料 绿脓杆菌产毒株和逆转录病毒载体, 本室自备; 来源于人大肠癌的CEA启动子由本室克隆[3]; Elongase、内切酶、PCR试剂盒为Gibco产品; 质粒pGEMEX-2, pSP72, 荧光素酶检测系统和PCR产物纯化系统等为Promega产品。CEA阳性人大肠癌细胞LoVo、小鼠成纤维细胞NIH3T3，CEA阴性人肾癌细胞RC9406和人宫颈癌HeLa的来源和培养见文献[4]。2月龄BALB/c裸鼠购于上海肿瘤研究所。
, 百拇医药
1.2 PEA基因克隆 按常规方法制备绿脓杆菌DNA。PCR引物根据Gray等[5]发表的PEA基因序列设计。上游引入HindⅢ位点和Kozak序列, 下游引入强终止信号和ClaⅠ位点。其序列为:内引物上游: 5′-GG AAG CTT GCC GCC ACC ATG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CA-3′; 下游: 5′-GG ATC GAT TTA CTT CAG GTC CTC GCG CGG C-3′。外引物上游: 5′-ACG GTC ATC AGT CAT CGC CTG CA-3′, 下游序列与内引物一致。由Promega合成, HPLC纯化。从基因组中克隆基因按本室常规方法[3], 聚合酶改为Elongase。首轮PCR循环25次，成功后稀释1 000倍作为模板进行第2轮PCR。产物经纯化后,克隆到pSP72载体的HindⅢ/ClaI位点构建pSP72-PEA。分别用SP6和T7引物进行DNA自动测序。
1.3 重组逆转录病毒载体的构建 将pGEM-CEA质粒[3]的SphⅠ位点转换成HindⅢ, 将SalⅠ/HindⅢCEA启动子插入G1Na逆转录病毒载体相应位点, 构建G1CEANa, 将pSP72-PEA中的PEA基因克隆G1CEANa逆转录病毒载体的HindⅢ/ClaⅠ中, 构建G1CEAPEANa。
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1.4 共转染及荧光素酶活性测定 含SV40启动子/增强子调控荧光素酶载体pGL2-control和G1CEAPEANa等摩尔混合, 在LipofectAMINE介导下，同时分别转染LoVo，RC9406，NIH3T3和HeLa细胞。与此同时LoVo细胞再单独转染pGL2-control为阳性对照。转染后48 h, 收集细胞, 细胞浆荧光素酶活性测定按说明书进行。
1.5 裸鼠植瘤及体内转染 将生长良好的LoVo和RC9406细胞分别以1×106皮下注射到BALB/c裸鼠左右股外侧皮下, 每组10只动物。2周后两侧均匀成瘤, 经纯化的G1CEAPEANa与带阳电荷脂质体(日本奈良医科大学赠)以适当比例混合后, 取20 μg质粒均匀浸润注射到两侧肿瘤瘤体内, 设生理盐水对照, 隔天1次, 连续5次, 7 d后测量肿瘤平均直径。
1.6 统计分析 按χ2检验判定差异显著性。
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2 结 果
2.1 PEAⅡ+Ⅲ区结构基因的克隆结果 首轮PCR从3株绿脓杆菌基因组DNA中扩增出了相应大小的序列, 套式PCR扩增出了所需长度的片段并同时进行了基因改造。克隆到pSP72中后, 测序结果如图1所示。所得PEA基因序列中第485～492, 553和612等发挥PEA毒性必需的氨基酸位点均没有突变, 与报告资料[4]基本一致。设计序列也在其中。
2.2 PEA基因在人大肠癌细胞中特异表达 以pGL2-control单独转染LoVo的荧光素酶活性为100%, 以转染pGL2-basic为0%。共转染后证明人CEA启动子调控的PEA基因在LoVo细胞中能显著抑制荧光素酶的活性(P<0.001)。在CEA阴性的RC9406和HeLa细胞以及在CEA背景不清楚的NIH3T3细胞中, 荧光素酶的活性与单独转染pGL2-control 的LoVo细胞之间也有一定的差异(图2)。提示CEA启动子能调控PEA在CEA阳性LoVo细胞中特异表达。CEA启动子调控的PEA基因在HeLa等细胞中可能有基础量的表达。
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2.3 CEA/PEA在裸鼠体内抑制人大肠癌生长 应用G1CEAPEANa治疗后第7天, 可观察到治疗组LoVo肿瘤生长率比生理盐水对照组明显降低，而RC9406肿瘤治疗组与生理盐水组相比未见明显变化。治疗后28 d, 阴性对照组和RC9406治疗组肿瘤在形态上已多极化, 有的小鼠植瘤部位皮肤表面出现菜花样溃疡、坏死, 阴性对照组动物已死亡30%。LoVo治疗组肿瘤虽有增长, 但大小显著小于对照组, 所有动物皮肤表面完整, 动物未死亡。治疗后肿瘤平均直径如图3所示。
3 讨 论
PEA作为“生物导弹”的“弹头”药物之一, 常用来对肿瘤和HIV感染进行治疗研究。PEA蛋白质可分成3个功能区段[2], Ⅰ区[氨基酸(aa) 1～252]主要负责与靶细胞受体结合, Ⅱ区(aa 253～364)主要负责跨膜转位, 能使毒素转位到内质网上, Ⅲ区(aa 400～613)主要有ADP-核糖基化和C端顺序, 使内吞的毒素进入内质网。我们选择了部分Ⅱ区基因和整个Ⅲ区基因为克隆对象, 同时引入了内质网滞留序列REDLK。从测序结果来看, aa 485～492, 553和612等发挥PEA毒性必需的氨基酸位点均没有突变, 故表达了有活性的毒素。
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目前国内外很少有人用PEA基因开展肿瘤基
图1 克隆的PEAⅡ+Ⅲ区结构基因序列与报告资料的比较
Fig 1 Comparison of DNA sequence of Pseudomonas exotoxin A Ⅱ+Ⅲ structural gene amplified to the reported
○: Reported sequence; ●: Sequence in the study; ■: Kozak sequence;□ : Termination code
, 百拇医药
图2 CEA/PEA共转染对荧光素酶基因表达的抑制作用
Fig 2 Inhibition of luciferase gene expression
by CEA/PEA cotransfection
A: Transfected with pGL2-control only;
B: Cotransfected with pGL2-control and G1CEAPEANa
■ LoVo cells; □ RC9406 cells; □ NIH3T3 cells; □HeLa cells
图3 CEA/PEA基因在裸鼠体内抑制人大肠癌生长
, 百拇医药
Fig 3 In vivo growth inhibition of human colorectal
carcinoma by CEA/PEA gene in nude mice
○ LoVo tumor treated with saline; ● LoVo tumor treated with G1CEAPEANa; △ RC9406 tumor treated with saline; ▲RC9406 tumor treated with G1CEAPEANa; *P<0.05,**P<0.01 vs the LoVo tumor treated with saline
因治疗，这可能是目前的基因表达控制系统和转染系统还不完善，PEA基因表达后对真核细胞有毒性, 而使后续试验无法进行。我们用组织特异性较强的CEA启动子控制克隆的PEAⅡ+Ⅲ区结构基因表达，病毒包装效率还很低, 得不到稳定的产病毒细胞株, 而且病毒滴度难以测定。体外转染后在未有选择条件下体外表达水平难以评估。我们应用共转染荧光素酶报告基因法, 通过PEA表达对报告基因转录的抑制作用而达到估测PEA表达水平的目的。该法基于Harrison等[6]的白喉毒素(DTA)真核细胞表达检测法。本研究体外结果证明, 人CEA启动子可以调控PEAⅡ+Ⅲ区结构基因在人大肠癌细胞中特异地表达有功能的核糖体毒性蛋白质。本实验应用重组质粒在脂质体转染制剂协助下体内直接转染肿瘤, 此法曾被用于肿瘤的前药转换基因治疗, 但该法体外转染率5%左右，体内转染率约为10%[7]。该转基因方法是体内基因治疗安全而有效的方法。本实验虽然没有完全抑制大肠肿瘤的生长，但也取得了一定的抗大肠肿瘤效果。该结果的取得是否有Ⅱ区基因跨膜转位, 而使小分子PEA毒素对未转基因肿瘤细胞造成“旁观者效应”, 目前尚无证据。我们应用细胞因子和前药转换基因进行了肝细胞癌和大肠癌的组织特异性基因治疗研究[8～10]，目的是为这两种常见肿瘤找到一种安全、有效的体内基因治疗方法。在安全性方面, 组织特异性转录调控序列可以确保治疗基因在肿瘤组织中的特异表达; 在有效性方面, 应用强有力的治疗基因, 尤其是毒性基因, 可发挥更加有效的抗肿瘤作用。应用从人大肠癌基因组中克隆的CEA启动子, 调控从细菌基因组中克隆的PEA基因, 进行体内抗大肠癌基因治疗, 可能有一定的应用前景。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 曹广文. 肿瘤基因治疗临床应用现状. 见:曹广文, 杜 平主编, 现代癌症生物治疗学. 北京: 人民军医出版社, 1995， 380～390
2 Pastan I, Chaudhary V, Fitzgerald DJ. Recombinant toxins as novel therapeutic agents. Annu Rev Biochem, 1992, 61(2): 331
3 曹广文, 杜 平, 崔 龙，等. 大肠癌组织CEA基因启动子序列的克隆及与正常组织相应序列比较. 第二军医大学学报, 1997, 18(4): 301
4 Cao GW, Gao J, Du P, et al. Construction of retroviral vectors to induce a strong expression of human class Ⅰgenes in the human hepatoma cells. Chin Natl New J Gastroenterol, 1997, 3(3):139
, 百拇医药
5 Gray GL, Smith DH, Raldridge JS, et al. Cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli of the exotoxin A structural gene of Pseudomonas aemginosa. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81(9): 2645
6 Harrison GS, Maxwell F, Long CJ, et al. Activation of a Diphtheria toxin A gene by expression of human immunodeficiency virus-1 Tat and Rev proteins in transfected cells. Hum Gene Ther, 1991, 2(1): 53
7 Konopka K, Harrison GS, Felgner PL, et al. Cationic liposome-mediated expression of HIV-regulated luciferase and diphtheria toxin A genes in HeLa cells infected with or expressing HIV. Biochem Biophys Acta, 1997, 1356(2):185
, 百拇医药
8 Cao GW, Kuriyama S, Du P, et al. Complete regression of established murine hepatocellular carcinoma by in vivo tumor necrosis factor-α gene transfer. Gastroenterology, 1997, 112(2): 501
9 Cao GW, Kuriyama S, Du P, et al. Construction of retroviral vectors to induce strong hepatoma cell-specific expression of cytokine genes. J Gastroenterol Hepatol, 1996, 11(12): 1053
10 Gao J, Cao GW, Qi ZT, et al. Construction of retroviral vector carrying HSV-tk gene under the control of human AFP enhancer core sequence and human gpk promoter. Chin Natl J New Gastroenterol, 1997, 3(1): 10
(1997-10-02收稿, 1998-02-20修回), 百拇医药
单位：
关键词：假单孢杆菌外毒素；大肠肿瘤；基因疗法
摘要 目的摘要 目的: 建立假单孢杆菌外毒素A(PEA)基因的组织特异性抗大肠癌基因疗法。方法: 用PCR法从绿脓杆菌基因组DNA中克隆PEAⅡ+Ⅲ区基因, 引入Kozak序列、终止信号和酶切位点, 测序。构建PEA基因转录受人癌胚抗原(CEA)启动子调控的逆转录病毒载体。共转染法体外研究PEA基因表达对报告基因表达的特异抑制作用。用DNA体内直接转染法于裸鼠体内观察PEA基因的抗人类肿瘤作用。结果: 所克隆的PEA序列与已报道序列基本相同。CEA启动子调控的PEA基因可在大肠癌细胞中特异性抑制荧光素酶基因表达, 在裸鼠体内对人大肠癌模型的直接转染能特异抑制人大肠肿瘤的生长。结论: PEAⅡ+Ⅲ区基因作为治疗基因, 适合于大肠癌特异性基因治疗。
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中国图书资料分类法分类号 R 735.34
Cloning of Pseudomonas exotoxin A gene and its application in colorectal carcinoma gene therapy
Cao Guangwen, Qi Zhongtian, Shigeki Kuriyama, Pan Xin, Zhang Xiaoqing, Du Ping (Department of Microbiology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University , Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To establish a human colorectal carcinoma specific gene therapy using Pseudomonas exotoxin A (PEA) gene. Methods: Polymerase Chain Reaction was employed to clone PEA domain Ⅱ+Ⅲ structural gene, introducing Kozak sequence, termination code and restriction sites. After sequencing, the PEA gene was inserted into a retroviral vector to create CEA/PEA, in which expression of the PEA gene was under the control of human carcinoembryonic antigen (CEA) promoter. In vitro cotransfection of the CEA/PEA construct and the luciferase vector was empolyed to assess translation inhibition effect of the PEA gene. The CEA/PEA was directly injected into some established human tumors in BALB/c nude mice. Growth of the tumors was subsequently examined. Results: Sequence of the PEA gene cloned in the study was almost identical to the reported data. The transfection of CEA/PEA specifically inhibited the expression of the luciferase gene in the CEA positive colorectal carcinoma cells. Direct injection of the CEA/PEA construct into the established tumor in the nude mice led to significant reductions in resultant tumor size relative to that in control groups. Conclusion: The PEA Ⅱ+Ⅲ structural gene, served as a therapeutic gene, is suitable for the tissue-specific gene therapy for malignant tumors.
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Key words Pseudomonas exotoxin; colorectal carcinoma; gene therapy
目前肿瘤治疗基因在临床上能使肿瘤消退的并不多见[1]。选择强有力的治疗基因和进行肿瘤组织特异性基因治疗是肿瘤基因治疗的关键。假单孢杆菌外毒素A(PEA)是由假单孢杆菌分泌的一种单链毒素, 是强有力的真核核糖体毒素, 通过催化不可逆转的ADP核糖化, 进而失活肽链延长因子而抑制细胞的蛋白质合成。一个分子PEA足可以杀死一个真核细胞[2]。NIH著名学者 Ira Pastan 最近将PEA基因置于真核表达载体中，表达了有细胞毒性的PEA, 提示这一原核基因在真核细胞中的翻译后加工过程并不影响其功能表位的形成。研究PEA基因在肿瘤基因治疗中的作用有实际意义。
1 材料和方法
1.1 材料 绿脓杆菌产毒株和逆转录病毒载体, 本室自备; 来源于人大肠癌的CEA启动子由本室克隆[3]; Elongase、内切酶、PCR试剂盒为Gibco产品; 质粒pGEMEX-2, pSP72, 荧光素酶检测系统和PCR产物纯化系统等为Promega产品。CEA阳性人大肠癌细胞LoVo、小鼠成纤维细胞NIH3T3，CEA阴性人肾癌细胞RC9406和人宫颈癌HeLa的来源和培养见文献[4]。2月龄BALB/c裸鼠购于上海肿瘤研究所。
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1.2 PEA基因克隆 按常规方法制备绿脓杆菌DNA。PCR引物根据Gray等[5]发表的PEA基因序列设计。上游引入HindⅢ位点和Kozak序列, 下游引入强终止信号和ClaⅠ位点。其序列为:内引物上游: 5′-GG AAG CTT GCC GCC ACC ATG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CA-3′; 下游: 5′-GG ATC GAT TTA CTT CAG GTC CTC GCG CGG C-3′。外引物上游: 5′-ACG GTC ATC AGT CAT CGC CTG CA-3′, 下游序列与内引物一致。由Promega合成, HPLC纯化。从基因组中克隆基因按本室常规方法[3], 聚合酶改为Elongase。首轮PCR循环25次，成功后稀释1 000倍作为模板进行第2轮PCR。产物经纯化后,克隆到pSP72载体的HindⅢ/ClaI位点构建pSP72-PEA。分别用SP6和T7引物进行DNA自动测序。
1.3 重组逆转录病毒载体的构建 将pGEM-CEA质粒[3]的SphⅠ位点转换成HindⅢ, 将SalⅠ/HindⅢCEA启动子插入G1Na逆转录病毒载体相应位点, 构建G1CEANa, 将pSP72-PEA中的PEA基因克隆G1CEANa逆转录病毒载体的HindⅢ/ClaⅠ中, 构建G1CEAPEANa。
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1.4 共转染及荧光素酶活性测定 含SV40启动子/增强子调控荧光素酶载体pGL2-control和G1CEAPEANa等摩尔混合, 在LipofectAMINE介导下，同时分别转染LoVo，RC9406，NIH3T3和HeLa细胞。与此同时LoVo细胞再单独转染pGL2-control为阳性对照。转染后48 h, 收集细胞, 细胞浆荧光素酶活性测定按说明书进行。
1.5 裸鼠植瘤及体内转染 将生长良好的LoVo和RC9406细胞分别以1×106皮下注射到BALB/c裸鼠左右股外侧皮下, 每组10只动物。2周后两侧均匀成瘤, 经纯化的G1CEAPEANa与带阳电荷脂质体(日本奈良医科大学赠)以适当比例混合后, 取20 μg质粒均匀浸润注射到两侧肿瘤瘤体内, 设生理盐水对照, 隔天1次, 连续5次, 7 d后测量肿瘤平均直径。
1.6 统计分析 按χ2检验判定差异显著性。
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2 结 果
2.1 PEAⅡ+Ⅲ区结构基因的克隆结果 首轮PCR从3株绿脓杆菌基因组DNA中扩增出了相应大小的序列, 套式PCR扩增出了所需长度的片段并同时进行了基因改造。克隆到pSP72中后, 测序结果如图1所示。所得PEA基因序列中第485～492, 553和612等发挥PEA毒性必需的氨基酸位点均没有突变, 与报告资料[4]基本一致。设计序列也在其中。
2.2 PEA基因在人大肠癌细胞中特异表达 以pGL2-control单独转染LoVo的荧光素酶活性为100%, 以转染pGL2-basic为0%。共转染后证明人CEA启动子调控的PEA基因在LoVo细胞中能显著抑制荧光素酶的活性(P<0.001)。在CEA阴性的RC9406和HeLa细胞以及在CEA背景不清楚的NIH3T3细胞中, 荧光素酶的活性与单独转染pGL2-control 的LoVo细胞之间也有一定的差异(图2)。提示CEA启动子能调控PEA在CEA阳性LoVo细胞中特异表达。CEA启动子调控的PEA基因在HeLa等细胞中可能有基础量的表达。
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2.3 CEA/PEA在裸鼠体内抑制人大肠癌生长 应用G1CEAPEANa治疗后第7天, 可观察到治疗组LoVo肿瘤生长率比生理盐水对照组明显降低，而RC9406肿瘤治疗组与生理盐水组相比未见明显变化。治疗后28 d, 阴性对照组和RC9406治疗组肿瘤在形态上已多极化, 有的小鼠植瘤部位皮肤表面出现菜花样溃疡、坏死, 阴性对照组动物已死亡30%。LoVo治疗组肿瘤虽有增长, 但大小显著小于对照组, 所有动物皮肤表面完整, 动物未死亡。治疗后肿瘤平均直径如图3所示。
3 讨 论
PEA作为“生物导弹”的“弹头”药物之一, 常用来对肿瘤和HIV感染进行治疗研究。PEA蛋白质可分成3个功能区段[2], Ⅰ区[氨基酸(aa) 1～252]主要负责与靶细胞受体结合, Ⅱ区(aa 253～364)主要负责跨膜转位, 能使毒素转位到内质网上, Ⅲ区(aa 400～613)主要有ADP-核糖基化和C端顺序, 使内吞的毒素进入内质网。我们选择了部分Ⅱ区基因和整个Ⅲ区基因为克隆对象, 同时引入了内质网滞留序列REDLK。从测序结果来看, aa 485～492, 553和612等发挥PEA毒性必需的氨基酸位点均没有突变, 故表达了有活性的毒素。
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目前国内外很少有人用PEA基因开展肿瘤基
图1 克隆的PEAⅡ+Ⅲ区结构基因序列与报告资料的比较
Fig 1 Comparison of DNA sequence of Pseudomonas exotoxin A Ⅱ+Ⅲ structural gene amplified to the reported
○: Reported sequence; ●: Sequence in the study; ■: Kozak sequence;□ : Termination code
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图2 CEA/PEA共转染对荧光素酶基因表达的抑制作用
Fig 2 Inhibition of luciferase gene expression
by CEA/PEA cotransfection
A: Transfected with pGL2-control only;
B: Cotransfected with pGL2-control and G1CEAPEANa
■ LoVo cells; □ RC9406 cells; □ NIH3T3 cells; □HeLa cells
图3 CEA/PEA基因在裸鼠体内抑制人大肠癌生长
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Fig 3 In vivo growth inhibition of human colorectal
carcinoma by CEA/PEA gene in nude mice
○ LoVo tumor treated with saline; ● LoVo tumor treated with G1CEAPEANa; △ RC9406 tumor treated with saline; ▲RC9406 tumor treated with G1CEAPEANa; *P<0.05,**P<0.01 vs the LoVo tumor treated with saline
因治疗，这可能是目前的基因表达控制系统和转染系统还不完善，PEA基因表达后对真核细胞有毒性, 而使后续试验无法进行。我们用组织特异性较强的CEA启动子控制克隆的PEAⅡ+Ⅲ区结构基因表达，病毒包装效率还很低, 得不到稳定的产病毒细胞株, 而且病毒滴度难以测定。体外转染后在未有选择条件下体外表达水平难以评估。我们应用共转染荧光素酶报告基因法, 通过PEA表达对报告基因转录的抑制作用而达到估测PEA表达水平的目的。该法基于Harrison等[6]的白喉毒素(DTA)真核细胞表达检测法。本研究体外结果证明, 人CEA启动子可以调控PEAⅡ+Ⅲ区结构基因在人大肠癌细胞中特异地表达有功能的核糖体毒性蛋白质。本实验应用重组质粒在脂质体转染制剂协助下体内直接转染肿瘤, 此法曾被用于肿瘤的前药转换基因治疗, 但该法体外转染率5%左右，体内转染率约为10%[7]。该转基因方法是体内基因治疗安全而有效的方法。本实验虽然没有完全抑制大肠肿瘤的生长，但也取得了一定的抗大肠肿瘤效果。该结果的取得是否有Ⅱ区基因跨膜转位, 而使小分子PEA毒素对未转基因肿瘤细胞造成“旁观者效应”, 目前尚无证据。我们应用细胞因子和前药转换基因进行了肝细胞癌和大肠癌的组织特异性基因治疗研究[8～10]，目的是为这两种常见肿瘤找到一种安全、有效的体内基因治疗方法。在安全性方面, 组织特异性转录调控序列可以确保治疗基因在肿瘤组织中的特异表达; 在有效性方面, 应用强有力的治疗基因, 尤其是毒性基因, 可发挥更加有效的抗肿瘤作用。应用从人大肠癌基因组中克隆的CEA启动子, 调控从细菌基因组中克隆的PEA基因, 进行体内抗大肠癌基因治疗, 可能有一定的应用前景。
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参 考 文 献
1 曹广文. 肿瘤基因治疗临床应用现状. 见:曹广文, 杜 平主编, 现代癌症生物治疗学. 北京: 人民军医出版社, 1995， 380～390
2 Pastan I, Chaudhary V, Fitzgerald DJ. Recombinant toxins as novel therapeutic agents. Annu Rev Biochem, 1992, 61(2): 331
3 曹广文, 杜 平, 崔 龙，等. 大肠癌组织CEA基因启动子序列的克隆及与正常组织相应序列比较. 第二军医大学学报, 1997, 18(4): 301
4 Cao GW, Gao J, Du P, et al. Construction of retroviral vectors to induce a strong expression of human class Ⅰgenes in the human hepatoma cells. Chin Natl New J Gastroenterol, 1997, 3(3):139
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5 Gray GL, Smith DH, Raldridge JS, et al. Cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli of the exotoxin A structural gene of Pseudomonas aemginosa. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81(9): 2645
6 Harrison GS, Maxwell F, Long CJ, et al. Activation of a Diphtheria toxin A gene by expression of human immunodeficiency virus-1 Tat and Rev proteins in transfected cells. Hum Gene Ther, 1991, 2(1): 53
7 Konopka K, Harrison GS, Felgner PL, et al. Cationic liposome-mediated expression of HIV-regulated luciferase and diphtheria toxin A genes in HeLa cells infected with or expressing HIV. Biochem Biophys Acta, 1997, 1356(2):185
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8 Cao GW, Kuriyama S, Du P, et al. Complete regression of established murine hepatocellular carcinoma by in vivo tumor necrosis factor-α gene transfer. Gastroenterology, 1997, 112(2): 501
9 Cao GW, Kuriyama S, Du P, et al. Construction of retroviral vectors to induce strong hepatoma cell-specific expression of cytokine genes. J Gastroenterol Hepatol, 1996, 11(12): 1053
10 Gao J, Cao GW, Qi ZT, et al. Construction of retroviral vector carrying HSV-tk gene under the control of human AFP enhancer core sequence and human gpk promoter. Chin Natl J New Gastroenterol, 1997, 3(1): 10
(1997-10-02收稿, 1998-02-20修回), 百拇医药