乳腺癌标本WAF1基因的研究及其临床意义
作者：江明 邵志敏 余黎明 韩企夏 沈镇宙
单位：200032 上海医科大学附属肿瘤医院外科分子生物学实验室(江明现在上海第二军医大学东方肝胆外科研究所)
关键词：
中华医学杂志/980227 应用分子生物学Southern blot、Northern blot杂交和免疫组化染色方法，检测乳腺癌标本WAF1基因DNA状况(status)、mRNA和蛋白质的表达水平，比较其与临床 TNM分期、肿瘤大小和病理腋下淋巴结转移等指标的关系。旨在研究乳腺癌发生和发展的过程是否涉及WAF1基因DNA抑或mRNA和蛋白质表达水平的异常，为进一步阐明乳腺癌异质性和肿瘤生物学行为的机制提供资料。
一、资料与方法
1.资料：(1)： 新鲜乳腺标本取自本科1991～1992年度乳腺组织库，为手术中常规切取即置入液氮中长期保存，28例乳腺癌和9例远离癌灶的“正常”组织、3例良性病变乳腺标本提取基因组DNA；23例乳腺癌和7例远离癌灶的“正常”组织、3例良性病变乳腺标本提取总RNA，患者年龄35～67岁，中位年龄51岁。106例乳腺癌石蜡切片取自本院病理科1988～1989年度蜡块制作，患者年龄27～79岁，中位年龄53岁。复阅存档HE染色切片和临床病史资料。参照中华人民共和国卫生部医政司编《中国常见恶性肿瘤诊治规范第八分册乳腺癌》进行临床和病理指标分类。(2) 质粒和单抗：pZL-WAF1质粒由美国马利兰大学癌症中心Dr. Fontana赠送。p21WAF1(SC-187)单抗购自美国Santa Cruz公司。
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2.方法：(1) 制备探针：pZL-WAF1质粒经EcoRI酶切、电泳，Glassmilk法回收cDNA片段，应用随机引物法标记α-32P-dCTP。(2) Southern blot方法：
Southern blot杂交法检测：1号为正常乳腺标本，2号为乳腺小叶增生标本，3～10号为乳腺癌标本，11号为MCF7细胞
附图 10例乳腺标本WAF1基因DNA状况
根据Gross-Bellard等方法改良提取乳腺标本基因组DNA，印迹转膜。(3) Northern blot方法：应用Chomcyznsky和Sacchi等一步法改良提取乳腺标本总RNA，印迹转膜。(4) 杂交和放射自显影：将印迹膜分别放入杂交袋，依次预杂交和杂交，漂洗后置入暗盒，放射自显影3～7天。(5) 对照实验：每组实验同时提取MCF7人乳腺癌细胞DNA或总RNA等量上样电泳作为阳性内对照，每一杂交膜漂洗后再次用32P-actin或32P-18S探针作为DNA或RNA上样量对照。(6) 条带吸光度检测：应用全自动医用图像分析仪(MBSI-四川大学)，扫描放射自显影X光胶片各条带吸光度(A值)，由下列公式计算每例标本WAF1基因mRNA表达相对值=(标本WAF1 mRNA/标本18sRNA)：(MCF7 WAF1 mRNA/MCF7 18s RNA)。(7) 免疫组化染色：应用免疫组化LSAB法染色，根据核内棕色颗粒的着色深浅，将染色强度分为:a无反应或微弱反应；b 棕色反应；c 深棕色反应3组，将a组病例数归入染色反应(-)组，最后确定乳腺癌组织p21WAF1染色反应半定量分级：(-)为0%～25%；(+)为26%～75%；(++)为76%～100%。实验中省略第一抗体作为阴性对照，用MCF7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。
, 百拇医药
3.统计学分析：分别应用t、F检验和χ2检验。
二、结果
1.Southern blot杂交结果：39例乳腺组织标本中，28例乳腺癌和9例正常、3例良性病变乳腺标本和MCF7细胞的放射自显影X光胶片上WAF1基因均为5.2kb和5kb两条条带，无丢失或重排(附图)。
2.Northern blot杂交结果：33例乳腺组织标本WAF1基因mRNA表达放射自显影X光胶片上均为一条2.1 kb条带，7例“正常”乳腺标本表达水平极低，条带隐约可见，吸光度值接近于0；3例良性病变标本的表达处于较低水平，mRNA表达相对值的样本均数值为0.1016±0.0476；23例乳腺癌标本mRNA表达相对值明显不一，为0.1302～1.0418，样本均数值为0.4909±0.3096。统计学分析结果(表1)。
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表1 23例乳腺癌标本WAF1基因mRNA的表达水平与临床和
病理指标的关系(
±s) 临床和病
理指标
例数
WAF mRNA
相对值
P值
TNM分期
Ⅰ期
5
0.38±0.32
, 百拇医药
Ⅱ期
13
0.55±0.30
>0.05
Ⅲ～Ⅳ期
5
0.46±0.39
肿瘤大小
<3cm
11
0.57±0.32
>0.05
≥3cm
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12
0.42±0.31
腋下淋巴结转移
阴性
8
0.56±0.36
≤3只阳性
6
0.70±0.29
<0.05
>3只阳性
9
0.29±0.17
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t检验和F检验
三、免疫组化染色结果：
106例乳腺癌组织p21WAF1蛋白定位于乳腺癌细胞核，呈异质性分布。统计学分析结果，106例乳腺癌组织p21WAF1蛋白的表达水平与病理腋下淋巴结转移有关(P<0.05)，而与临床TNM分期和肿瘤大小无关(P>0.05，表2)。
三、讨论
WAF1基因是新克隆的由wtp53激活的抑制CDKs活性的肿瘤抑制基因，已成为继p53基因后的研究热点[1～4]。根据我们的实验结果，乳腺癌发生和发展过程中WAF1基因的异常主要发生在转录和转录后水平，可能与肿瘤发生发展过程中组织细胞DNA发生不同程表2 106例乳腺癌组织p21WAF1蛋白的表达水平与临床和病理指标的关系 临床和
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病理指标
例数
p21WAF1蛋白的表达
P值*
-
(%)
+
(%)
++
(%)
TNM分期
Ⅰ期
20
, 百拇医药
1
(5)
10
(50)
9
(45)
Ⅱ期
58
19
(33)
21
(36)
18
, http://www.100md.com (31)
>0.05
Ⅲ期
28
13
(46)
9
(32)
6
(21)
肿瘤大小
<3cm
29
, 百拇医药 4
(14)
16
(55)
9
(31)
>0.05
≥3cm
77
29
(38)
24
(31)
, http://www.100md.com 24
(31)
腋下淋
巴结转移
阴性
47
4
(9)
16
(34)
27
(58)
≤3只阳性
, http://www.100md.com 29
12
(41)
12
(41)
5
(17)
<0.05
>3只阳性
30
17
(57)
12
, 百拇医药 (40)
1
(3)
合计
106
33(31)
40(38)
33(31)
*χ2检验
度的损伤和p53基因的功能状态有关。有报道发现，肿瘤发展过程中cyclins和CDKs基因的表达水平明显增加，如p21WAF1蛋白的表达水平下降，癌细胞则发生失控性地异常分裂增殖，易发生浸润和转移。因此临床实验检测乳腺癌标本WAF1基因mRNA和蛋白质的表达水平可以作为评估腋下淋巴结转移等肿瘤生物学行为的新指标。参考文献
, 百拇医药
1Hartwell L and Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science, 1994, 266：1820-1824.
2Enoch T and Norbury C. Cellular responses to DNA damage: cell cycle checkpoints, apoptosis and the roles of p53 and ATM. TIBS, 1995, 20:426-428.
3Marchetti A, Doglioni C, Barbarschi M, et al. p21 RNA and protein expression in nonsmall cell lung carcinoma: evidence of P53-independent expression and association with tumoral differentiation. Oncogene, 1996, 12：1319-1322.
4Barbars chi M, Doglioni C, Veronese S, et al. p21WAF1 and p53 immunohistochemical expression in breast carcinoma may predit therapeutic response to adjurant treatment. Eur J Cancer, 1996, 32AV：2182-2183. (收稿：1996-12-26 修回：1997-08-29), 百拇医药
单位：200032 上海医科大学附属肿瘤医院外科分子生物学实验室(江明现在上海第二军医大学东方肝胆外科研究所)
关键词：
中华医学杂志/980227 应用分子生物学Southern blot、Northern blot杂交和免疫组化染色方法，检测乳腺癌标本WAF1基因DNA状况(status)、mRNA和蛋白质的表达水平，比较其与临床 TNM分期、肿瘤大小和病理腋下淋巴结转移等指标的关系。旨在研究乳腺癌发生和发展的过程是否涉及WAF1基因DNA抑或mRNA和蛋白质表达水平的异常，为进一步阐明乳腺癌异质性和肿瘤生物学行为的机制提供资料。
一、资料与方法
1.资料：(1)： 新鲜乳腺标本取自本科1991～1992年度乳腺组织库，为手术中常规切取即置入液氮中长期保存，28例乳腺癌和9例远离癌灶的“正常”组织、3例良性病变乳腺标本提取基因组DNA；23例乳腺癌和7例远离癌灶的“正常”组织、3例良性病变乳腺标本提取总RNA，患者年龄35～67岁，中位年龄51岁。106例乳腺癌石蜡切片取自本院病理科1988～1989年度蜡块制作，患者年龄27～79岁，中位年龄53岁。复阅存档HE染色切片和临床病史资料。参照中华人民共和国卫生部医政司编《中国常见恶性肿瘤诊治规范第八分册乳腺癌》进行临床和病理指标分类。(2) 质粒和单抗：pZL-WAF1质粒由美国马利兰大学癌症中心Dr. Fontana赠送。p21WAF1(SC-187)单抗购自美国Santa Cruz公司。
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2.方法：(1) 制备探针：pZL-WAF1质粒经EcoRI酶切、电泳，Glassmilk法回收cDNA片段，应用随机引物法标记α-32P-dCTP。(2) Southern blot方法：
Southern blot杂交法检测：1号为正常乳腺标本，2号为乳腺小叶增生标本，3～10号为乳腺癌标本，11号为MCF7细胞
附图 10例乳腺标本WAF1基因DNA状况
根据Gross-Bellard等方法改良提取乳腺标本基因组DNA，印迹转膜。(3) Northern blot方法：应用Chomcyznsky和Sacchi等一步法改良提取乳腺标本总RNA，印迹转膜。(4) 杂交和放射自显影：将印迹膜分别放入杂交袋，依次预杂交和杂交，漂洗后置入暗盒，放射自显影3～7天。(5) 对照实验：每组实验同时提取MCF7人乳腺癌细胞DNA或总RNA等量上样电泳作为阳性内对照，每一杂交膜漂洗后再次用32P-actin或32P-18S探针作为DNA或RNA上样量对照。(6) 条带吸光度检测：应用全自动医用图像分析仪(MBSI-四川大学)，扫描放射自显影X光胶片各条带吸光度(A值)，由下列公式计算每例标本WAF1基因mRNA表达相对值=(标本WAF1 mRNA/标本18sRNA)：(MCF7 WAF1 mRNA/MCF7 18s RNA)。(7) 免疫组化染色：应用免疫组化LSAB法染色，根据核内棕色颗粒的着色深浅，将染色强度分为:a无反应或微弱反应；b 棕色反应；c 深棕色反应3组，将a组病例数归入染色反应(-)组，最后确定乳腺癌组织p21WAF1染色反应半定量分级：(-)为0%～25%；(+)为26%～75%；(++)为76%～100%。实验中省略第一抗体作为阴性对照，用MCF7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。
, 百拇医药
3.统计学分析：分别应用t、F检验和χ2检验。
二、结果
1.Southern blot杂交结果：39例乳腺组织标本中，28例乳腺癌和9例正常、3例良性病变乳腺标本和MCF7细胞的放射自显影X光胶片上WAF1基因均为5.2kb和5kb两条条带，无丢失或重排(附图)。
2.Northern blot杂交结果：33例乳腺组织标本WAF1基因mRNA表达放射自显影X光胶片上均为一条2.1 kb条带，7例“正常”乳腺标本表达水平极低，条带隐约可见，吸光度值接近于0；3例良性病变标本的表达处于较低水平，mRNA表达相对值的样本均数值为0.1016±0.0476；23例乳腺癌标本mRNA表达相对值明显不一，为0.1302～1.0418，样本均数值为0.4909±0.3096。统计学分析结果(表1)。
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表1 23例乳腺癌标本WAF1基因mRNA的表达水平与临床和
病理指标的关系(
±s) 临床和病理指标
例数
WAF mRNA
相对值
P值
TNM分期
Ⅰ期
5
0.38±0.32
, 百拇医药
Ⅱ期
13
0.55±0.30
>0.05
Ⅲ～Ⅳ期
5
0.46±0.39
肿瘤大小
<3cm
11
0.57±0.32
>0.05
≥3cm
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12
0.42±0.31
腋下淋巴结转移
阴性
8
0.56±0.36
≤3只阳性
6
0.70±0.29
<0.05
>3只阳性
9
0.29±0.17
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t检验和F检验
三、免疫组化染色结果：
106例乳腺癌组织p21WAF1蛋白定位于乳腺癌细胞核，呈异质性分布。统计学分析结果，106例乳腺癌组织p21WAF1蛋白的表达水平与病理腋下淋巴结转移有关(P<0.05)，而与临床TNM分期和肿瘤大小无关(P>0.05，表2)。
三、讨论
WAF1基因是新克隆的由wtp53激活的抑制CDKs活性的肿瘤抑制基因，已成为继p53基因后的研究热点[1～4]。根据我们的实验结果，乳腺癌发生和发展过程中WAF1基因的异常主要发生在转录和转录后水平，可能与肿瘤发生发展过程中组织细胞DNA发生不同程表2 106例乳腺癌组织p21WAF1蛋白的表达水平与临床和病理指标的关系 临床和
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病理指标
例数
p21WAF1蛋白的表达
P值*
-
(%)
+
(%)
++
(%)
TNM分期
Ⅰ期
20
, 百拇医药
1
(5)
10
(50)
9
(45)
Ⅱ期
58
19
(33)
21
(36)
18
, http://www.100md.com (31)
>0.05
Ⅲ期
28
13
(46)
9
(32)
6
(21)
肿瘤大小
<3cm
29
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(14)
16
(55)
9
(31)
>0.05
≥3cm
77
29
(38)
24
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(31)
腋下淋
巴结转移
阴性
47
4
(9)
16
(34)
27
(58)
≤3只阳性
, http://www.100md.com 29
12
(41)
12
(41)
5
(17)
<0.05
>3只阳性
30
17
(57)
12
, 百拇医药 (40)
1
(3)
合计
106
33(31)
40(38)
33(31)
*χ2检验
度的损伤和p53基因的功能状态有关。有报道发现，肿瘤发展过程中cyclins和CDKs基因的表达水平明显增加，如p21WAF1蛋白的表达水平下降，癌细胞则发生失控性地异常分裂增殖，易发生浸润和转移。因此临床实验检测乳腺癌标本WAF1基因mRNA和蛋白质的表达水平可以作为评估腋下淋巴结转移等肿瘤生物学行为的新指标。参考文献
, 百拇医药
1Hartwell L and Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science, 1994, 266：1820-1824.
2Enoch T and Norbury C. Cellular responses to DNA damage: cell cycle checkpoints, apoptosis and the roles of p53 and ATM. TIBS, 1995, 20:426-428.
3Marchetti A, Doglioni C, Barbarschi M, et al. p21 RNA and protein expression in nonsmall cell lung carcinoma: evidence of P53-independent expression and association with tumoral differentiation. Oncogene, 1996, 12：1319-1322.
4Barbars chi M, Doglioni C, Veronese S, et al. p21WAF1 and p53 immunohistochemical expression in breast carcinoma may predit therapeutic response to adjurant treatment. Eur J Cancer, 1996, 32AV：2182-2183. (收稿：1996-12-26 修回：1997-08-29), 百拇医药