谷氨酸脱羧酶与完全弗氏佐剂预防鼠胰岛炎及糖尿病的探讨
作者：杨文 周智广 杨竹林 文建新 吴杨松 冯清泉
单位：410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院内分泌研究所
关键词：
中华医学杂志/980224 本课题为国家自然科学基金资助项目
Non-obese-diabetic(NOD)小鼠是一种遗传性Ⅰ型糖尿病的啮齿动物模型。它于5周龄起自发地出现胰岛炎，14周龄后可发生Ⅰ型糖尿病。由于NOD鼠糖尿病是一种器官特异性自身免疫病，因此，采用改变免疫病理过程的措施可能预防胰岛炎和糖尿病。目前研究的主要措施有免疫抑制、免疫刺激和免疫耐受。谷氨酸脱羧酶(GAD)作为Ⅰ型糖尿病的关键自身抗原正越来越引起人们的关注。国外学者应用GAD诱导免疫耐受[1，2]和完全弗氏佐剂(CFA)免疫刺激[3]预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病显示良好效果，但国内尚未见类似报道。本研究通过给予自制猪GAD和CFA，观察其对NOD鼠胰岛炎及糖尿病发病的影响，旨在为人类Ⅰ型糖尿病的预防和病因探讨奠定基础。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.实验动物：NOD小鼠从澳大利亚WEHI医学研究中心引进，由山西医学院张志利教授提供。所有小鼠在标准饲养环境下喂养。采用NOD鼠群落在210天龄时雌鼠的糖尿病自然发病率为70%。
2.试剂：(1) GAD：由本室按文献方法[4]制备。本室制备的GAD含两种同功酶(GAD65和GAD67)，产品含蛋白质10mg/ml，含GAD酶活性单位24mU/ml，比活为2.4mU/mg。(2) CFA：由美国生命技术公司(LIFE TECHNOLOGIES， USA)提供。(3) 牛血清白蛋白(BSA)：由上海第二医科大学生产。
3.动物实验：(1) 将10只4周龄NOD雌鼠随机分为 2组，即GAD组6例和BSA组4例。给GAD组每只小鼠腹腔内注射GAD2.4mU酶活性单位(100μl)，给BSA组每只小鼠腹腔内注射BSA 1mg(100μl)。饲养至19周龄时处死，观察胰岛病理变化。(2) 将11只4周龄NOD雌鼠随机分为2组，即CFA组(5例)和生理盐水组(NS组，6例)。给CFA组小鼠后脚板注射50μl CFA，NS组小鼠后脚板注射50μl生理盐水。当发生糖尿病时或至30周龄时将小鼠处死观察胰岛病理改变。
, 百拇医药
4.糖尿病的检测：从10周龄开始，每周测NOD鼠体重一次，并观察是否有糖尿病症状出现。当小鼠出现多饮、多尿、消瘦等症状时，即测血糖，如血糖连续2天>11.1mmol/L时，即诊断为糖尿病[2]。血糖测定采用血糖仪(One Touch Ⅱ，Lifescan，USA)，用断尾法取小鼠血进行测定。无糖尿病症状的小鼠处死前均测血糖。
5.病理检查：用眼眶动静脉放血法将小鼠处死，分离胰腺，10%甲醛固定，石蜡包埋，制片，HE染色。光镜观察。胰岛淋巴细胞浸润的程度按下列标准计分：胰岛周围和胰岛内无淋巴细胞浸润记0分；胰腺导管周围有淋巴细胞浸润记1分、胰岛周围有淋巴细胞浸润记2分；胰岛内有淋巴细胞浸润记3分；胰岛内淋巴细胞浸润并有 胰岛细胞破坏记4分。上述0分表示 无胰岛炎，1分和2分表示胰岛周围炎，3分和4分表示胰岛内炎。
6.统计学处理：胰岛炎积分结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验；各组胰岛炎严重程度的构成以百分比表示，组间差异比较用卡方检验。
, http://www.100md.com
二、结果
1.GAD预防NOD鼠胰岛炎观察结果：19周龄时GAD组小鼠胰岛炎积分明显轻于对照组(1.28±0.51对2.36±0.93，P<0.05)。在GAD组6只小鼠所观察的120个胰岛中，16.9%完全没有胰岛炎，75.8%为轻度的胰岛周围炎，只有7.5%为胰岛内炎，而在对照组所观察的80个胰岛中，只有5.0%无胰岛炎，46.3%为胰岛周围炎，48.7%为胰岛内炎(P<0.005)。19周龄，对照组已有1只鼠发生了糖尿病，而GAD组小鼠血糖均正常。
2.CFA预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病观察：到30周龄时，对照组6只 小鼠中有3只发生了糖尿病，而CFA组5只小鼠中没有1只发生糖尿病。CFA组胰岛炎的严重程度明显 低于对照组(1.84±0.71对3.00±0.80，P<0.05)。在CFA组小鼠所观察的100个胰岛中，6.0%无胰岛炎，68.0%发生了胰岛周围炎，26.0%发生了胰岛内炎，而在对照组所观察的120个胰岛中，25.8%发生了胰岛周围炎，74.2%发生了胰岛内炎，未见正常胰岛(P<0.005)。
, 百拇医药
三、讨论
1.GAD对NOD鼠胰岛炎的影响：NOD鼠糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾病，其体内存在多种胰岛β细胞自身抗原的T细胞反应和自身抗体，这些自身抗原包括：GAD的两种同功酶(GAD65和GAD67)、胰岛素、羧基肽酶H、热休克蛋白(HSP)、BSA、Peripherin等[1，2]。Kaufman等[1，2]发现早期给予GAD65能够预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病，而其它自身抗原(如β-半乳糖苷酶、HSP、Peripherin、BSA等)则无此作用。因此，本研究用BSA作为对照，观察早期给予自制猪脑GAD对NOD鼠胰岛炎的影响。发现早期给予猪脑GAD能使NOD鼠胰岛炎的积分明显减少。这说明通过诱导对GAD的免疫耐受能够减轻NOD鼠胰岛炎，从而可能预防糖尿病。
2.CFA对NOD鼠胰岛炎和糖尿病发病的影响：NOD鼠糖尿病是由于免疫调节和细胞因子平衡失调引起。国外研究发现，不仅通过免疫抑制(如环孢霉素A等)可以预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病，而且通过免疫刺激或免疫调节(如卡介苗、CFA、1，25双羟维生素D等)也可以预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病。本研究显示，CFA能够明显减少NOD鼠胰岛炎的积分。更为重要的是 CFA组无一只鼠发生糖尿病，而对照组则3/6只鼠发生了糖尿病。上述结果与国外文献报道相似[3]。这说明CFA能够减轻NOD鼠胰岛炎 ，并减少糖尿病的发生。虽然CFA不能用于人类，而与CFA有类似作用的BCG已开始试用于人类Ⅰ型糖尿病的治疗。因此，应用其它免疫调节措施预防人类Ⅰ型糖尿病亦值得深入探讨。
, 百拇医药
参考文献
1Kaufman DL, Clare-Saulzer M, Tian J, et al. Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependent diabetes. Nature, 1993; 366：69-72.
2Petersen JS, Karlsen AE, Markholst H, et al. Neonatal tolerization with glutamic acid decarboxylase but not with bovine serum albumin delays the onset of diabetes in NOD mice. Diabetes, 1994; 43：1478-1484.
3Qin HY, Sudelain MWJ, Hitch C, et al. Complete Freund′s adjuvant-induced T cells prevent the development and adoptive transfer of diabetes in non-obese diabetic mice. J Immunol, 1993, 150：2072-2080.
4Nathan B, Hsu CC, Bao J, et al. Purification and characterization of a novel form of brain L-glutamate decarboxylase: a Ca2+-dependent peripheral membrane protein. J Biol chem, 1994; 269：7249-7254. (收稿：1997-01-21 修回：1997-10-17), 百拇医药
单位：410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院内分泌研究所
关键词：
中华医学杂志/980224 本课题为国家自然科学基金资助项目
Non-obese-diabetic(NOD)小鼠是一种遗传性Ⅰ型糖尿病的啮齿动物模型。它于5周龄起自发地出现胰岛炎，14周龄后可发生Ⅰ型糖尿病。由于NOD鼠糖尿病是一种器官特异性自身免疫病，因此，采用改变免疫病理过程的措施可能预防胰岛炎和糖尿病。目前研究的主要措施有免疫抑制、免疫刺激和免疫耐受。谷氨酸脱羧酶(GAD)作为Ⅰ型糖尿病的关键自身抗原正越来越引起人们的关注。国外学者应用GAD诱导免疫耐受[1，2]和完全弗氏佐剂(CFA)免疫刺激[3]预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病显示良好效果，但国内尚未见类似报道。本研究通过给予自制猪GAD和CFA，观察其对NOD鼠胰岛炎及糖尿病发病的影响，旨在为人类Ⅰ型糖尿病的预防和病因探讨奠定基础。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.实验动物：NOD小鼠从澳大利亚WEHI医学研究中心引进，由山西医学院张志利教授提供。所有小鼠在标准饲养环境下喂养。采用NOD鼠群落在210天龄时雌鼠的糖尿病自然发病率为70%。
2.试剂：(1) GAD：由本室按文献方法[4]制备。本室制备的GAD含两种同功酶(GAD65和GAD67)，产品含蛋白质10mg/ml，含GAD酶活性单位24mU/ml，比活为2.4mU/mg。(2) CFA：由美国生命技术公司(LIFE TECHNOLOGIES， USA)提供。(3) 牛血清白蛋白(BSA)：由上海第二医科大学生产。
3.动物实验：(1) 将10只4周龄NOD雌鼠随机分为 2组，即GAD组6例和BSA组4例。给GAD组每只小鼠腹腔内注射GAD2.4mU酶活性单位(100μl)，给BSA组每只小鼠腹腔内注射BSA 1mg(100μl)。饲养至19周龄时处死，观察胰岛病理变化。(2) 将11只4周龄NOD雌鼠随机分为2组，即CFA组(5例)和生理盐水组(NS组，6例)。给CFA组小鼠后脚板注射50μl CFA，NS组小鼠后脚板注射50μl生理盐水。当发生糖尿病时或至30周龄时将小鼠处死观察胰岛病理改变。
, 百拇医药
4.糖尿病的检测：从10周龄开始，每周测NOD鼠体重一次，并观察是否有糖尿病症状出现。当小鼠出现多饮、多尿、消瘦等症状时，即测血糖，如血糖连续2天>11.1mmol/L时，即诊断为糖尿病[2]。血糖测定采用血糖仪(One Touch Ⅱ，Lifescan，USA)，用断尾法取小鼠血进行测定。无糖尿病症状的小鼠处死前均测血糖。
5.病理检查：用眼眶动静脉放血法将小鼠处死，分离胰腺，10%甲醛固定，石蜡包埋，制片，HE染色。光镜观察。胰岛淋巴细胞浸润的程度按下列标准计分：胰岛周围和胰岛内无淋巴细胞浸润记0分；胰腺导管周围有淋巴细胞浸润记1分、胰岛周围有淋巴细胞浸润记2分；胰岛内有淋巴细胞浸润记3分；胰岛内淋巴细胞浸润并有 胰岛细胞破坏记4分。上述0分表示 无胰岛炎，1分和2分表示胰岛周围炎，3分和4分表示胰岛内炎。
6.统计学处理：胰岛炎积分结果以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验；各组胰岛炎严重程度的构成以百分比表示，组间差异比较用卡方检验。, http://www.100md.com
二、结果
1.GAD预防NOD鼠胰岛炎观察结果：19周龄时GAD组小鼠胰岛炎积分明显轻于对照组(1.28±0.51对2.36±0.93，P<0.05)。在GAD组6只小鼠所观察的120个胰岛中，16.9%完全没有胰岛炎，75.8%为轻度的胰岛周围炎，只有7.5%为胰岛内炎，而在对照组所观察的80个胰岛中，只有5.0%无胰岛炎，46.3%为胰岛周围炎，48.7%为胰岛内炎(P<0.005)。19周龄，对照组已有1只鼠发生了糖尿病，而GAD组小鼠血糖均正常。
2.CFA预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病观察：到30周龄时，对照组6只 小鼠中有3只发生了糖尿病，而CFA组5只小鼠中没有1只发生糖尿病。CFA组胰岛炎的严重程度明显 低于对照组(1.84±0.71对3.00±0.80，P<0.05)。在CFA组小鼠所观察的100个胰岛中，6.0%无胰岛炎，68.0%发生了胰岛周围炎，26.0%发生了胰岛内炎，而在对照组所观察的120个胰岛中，25.8%发生了胰岛周围炎，74.2%发生了胰岛内炎，未见正常胰岛(P<0.005)。
, 百拇医药
三、讨论
1.GAD对NOD鼠胰岛炎的影响：NOD鼠糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾病，其体内存在多种胰岛β细胞自身抗原的T细胞反应和自身抗体，这些自身抗原包括：GAD的两种同功酶(GAD65和GAD67)、胰岛素、羧基肽酶H、热休克蛋白(HSP)、BSA、Peripherin等[1，2]。Kaufman等[1，2]发现早期给予GAD65能够预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病，而其它自身抗原(如β-半乳糖苷酶、HSP、Peripherin、BSA等)则无此作用。因此，本研究用BSA作为对照，观察早期给予自制猪脑GAD对NOD鼠胰岛炎的影响。发现早期给予猪脑GAD能使NOD鼠胰岛炎的积分明显减少。这说明通过诱导对GAD的免疫耐受能够减轻NOD鼠胰岛炎，从而可能预防糖尿病。
2.CFA对NOD鼠胰岛炎和糖尿病发病的影响：NOD鼠糖尿病是由于免疫调节和细胞因子平衡失调引起。国外研究发现，不仅通过免疫抑制(如环孢霉素A等)可以预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病，而且通过免疫刺激或免疫调节(如卡介苗、CFA、1，25双羟维生素D等)也可以预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病。本研究显示，CFA能够明显减少NOD鼠胰岛炎的积分。更为重要的是 CFA组无一只鼠发生糖尿病，而对照组则3/6只鼠发生了糖尿病。上述结果与国外文献报道相似[3]。这说明CFA能够减轻NOD鼠胰岛炎 ，并减少糖尿病的发生。虽然CFA不能用于人类，而与CFA有类似作用的BCG已开始试用于人类Ⅰ型糖尿病的治疗。因此，应用其它免疫调节措施预防人类Ⅰ型糖尿病亦值得深入探讨。
, 百拇医药
参考文献
1Kaufman DL, Clare-Saulzer M, Tian J, et al. Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependent diabetes. Nature, 1993; 366：69-72.
2Petersen JS, Karlsen AE, Markholst H, et al. Neonatal tolerization with glutamic acid decarboxylase but not with bovine serum albumin delays the onset of diabetes in NOD mice. Diabetes, 1994; 43：1478-1484.
3Qin HY, Sudelain MWJ, Hitch C, et al. Complete Freund′s adjuvant-induced T cells prevent the development and adoptive transfer of diabetes in non-obese diabetic mice. J Immunol, 1993, 150：2072-2080.
4Nathan B, Hsu CC, Bao J, et al. Purification and characterization of a novel form of brain L-glutamate decarboxylase: a Ca2+-dependent peripheral membrane protein. J Biol chem, 1994; 269：7249-7254. (收稿：1997-01-21 修回：1997-10-17), 百拇医药