血清铜蓝蛋白ELISA 法测定及在瘢痕疙瘩诊治中的应用
作者：康尔恂 吴延芳
单位：266021 青岛医学院皮肤病所究所
关键词：瘢痕疙瘩；铜蓝蛋白；酶联免疫吸附试验
980205
【摘要】 目的 为了研究瘢痕疙瘩是否与血清铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,CP)浓度有关。方法 利用间接ELISA(酶联免疫吸附试验)的方法，初步探讨了血清CP的ELISA测定方法及在瘢痕疙瘩治疗中的应用。结果 瘢痕疙瘩组CP含量明显增高，与正常对照组比较差别有显著意义(P<0.01)。祛炎舒松A治疗后血清CP含量较瘢痕疙瘩组低(P<0.05)。结论 瘢痕疙瘩病人血清CP含量增高，祛炎松A治疗后血清CP下降，血清CP测定可用于瘢痕疙瘩体质的判定和疗效的评价。
, http://www.100md.com
The measurement of CP level and the clinical application on the keloid patients Kang Erxun, Wu Yanfang. Institute of Dermatology, Qingdao Medical College ,Qingdao 266021
【Abstract】 Objective In order to study the keloid is related with the level of serum concentration of CP (Ceruloplasmin). Fibrotic disease such as silicosis sclerederma are related with the level of serum concentration of CP.Method This preliminary research was carried out by the method of indirect ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). We investigated the method of measuring CP in serum by ELISA and estimated the value in keloid treating.Result The level of CP is significantly higher than that of the control group (P<0.01). The CP level of the group treated with triamicinolone is lower than that of the keloid group (P<0.05).Conclusion The results show that the serum CP level is higher in keloid patients. After treated with triamcinolone, the CP concentration becomes lower, so the serum concentration of CP is an important factor can not be ignored in the keloid treating. It can be used as one of criteria to judge if a person with keloid tendency as well as to evaluate the effect of treatment.
, 百拇医药
【Key Words】 Keloid CP ELISA
瘢痕疙瘩是一种以皮肤真皮层胶原过度沉积为病理特征的皮肤病。我们利用间接ELISA法对20例瘢痕疙瘩病人和20例正常成人的血清铜蓝蛋白进行测定，报告如下：
实验分组与方法[1，2]
正常对照组为健康成人。瘢痕疙瘩组，皮损50 cm2以上，无其它疾患，未经药物治疗。祛炎舒松-A治疗组，瘢痕疙瘩，皮损50 cm2以上，采用青岛医学院皮肤病研究所研制的高压注射助推器皮损内祛炎舒松-A加2%利多卡因混(1∶1)，注射量以皮损表面苍白为度，半合液个月1。以皮损近于平复，痒痛感基本消失为治愈。每组观察20例，于治疗后观察血清CP值。
, http://www.100md.com
1.抗原包被：将待测血清用包被液稀释10倍，每孔100 ul包被于聚苯乙烯酶标样品孔中，置于湿盒，4℃过夜。
2.封闭：样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入100ul封闭液，置4℃过夜。
3.加一抗：酶标样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入100ul稀释一定倍数的兔抗人CP血清，室温放置2小时。
4.加二抗：样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入100 ul稀释一定倍数的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，室温置2小时。
5.显色反应：样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入一定量的酶底物(新鲜配制)，室温反应30分钟。
6.终止反应：加入100 ul终止液终止反应。
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7.测A值：于MB-Ⅲ型ELISA测定仪490nm处进行比色，测定A值。
结 果 血清间接ELISA法测定结果见表1～2。
表1 各实验组血清间接ELIAS测定的A值(±S，n=20)
实验组别
治疗前
治疗后
正常对照组(A)
0.40±0.05
0.40±0.04
瘢痕疙瘩组(B)
, 百拇医药
0.53±0.03
0.52±0.04
祛炎舒松A治疗组(C)
0.44±0.04
0.37±0.04
表2 各实验组血清CP含量比较(t检验结果)
组间比较
治疗后(P值)
A与B
<0.01
B与C
, 百拇医药
<0.05
A与C
>0.05
讨 论 铜蓝蛋白是由肝脏合成的一钟含铜糖蛋白，血清中96 %的铜存在于其粘末端的粘液酸部份，在机体的铜代谢起着重要作用。CP能够氧化苯二胺，具有二胺氧化酶的作用，被称为铜氧化酶[3，4]。研究表明：CP能促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成，参与胶原蛋白交联反应聚
合成纤维的过程。不少试验皆显示，纤维化疾病如矽肺、硬皮病等与血清CP含量有关[3，4]。
酶联免疫吸附试验，是应用固体吸附技术和免疫酶联技术将抗体或抗原吸附于固体支持物(聚苯乙烯微孔板)上，加入相应的抗原(或抗体)，产生免疫反应，形成酶标记的抗原抗体复合物，借酶底物与结合在抗体上的酶进行反应而显示其活性。通过测定酶与底物反应所产生的有色产物的光吸收值，以达到抗体或抗原定量的目的[1]。
, http://www.100md.com
50年代初，Holmberg等人利用CP氧化对苯二胺盐酸盐(P-Phenylene diamine dihydrochloride)产生紫色氧化物在520～530 nm处比色的原理，建立了CP的酶学测定方法，并对组织及血清CP活性单位进行测定。60年代初，Sunderman等人对此方法进行了改进并被推广使用[5]。70年代中期，Mancini等人建立了CP放免测定方法，90年代发展为酶免方法[6]。我们在总结已有的血清CP间接测定方法的基础上，初步探讨了瘢痕疙瘩血清CP间接ELISA测定方法，并用此方法测定了正常对照组，瘢瘢疙瘩组，祛炎舒松-A治疗组血清CP的含量。结果表明：瘢痕疙瘩组血清CP含量明显升高，与正常对照组比较差别有显著意义(P<0.01)。祛炎舒松-A治疗组血清CP含量较瘢痕疙瘩组低(P<0.05)。祛炎舒松-A治疗组与正常对照组相比无差别(P<0.05)。以上结果表明瘢痕疙瘩血清CP增高，祛炎舒松-A治疗后血清CP下降。因此，血清CP含量与瘢痕疙瘩胶原代谢有关。测定血清CP含量对于在术前预测瘢痕疙瘩的发生，减少不必要的麻烦，以及在瘢痕疙瘩的治疗评价中有重要意义。至于CP影响胶原代谢的机理尚有待进一步探讨。 参考文献1 钟惠仙,等.微量法测定130例健康人血清铜蓝蛋白正常值.浙江省医学科学院学报，1993，14：3739.
, http://www.100md.com
2 Liu BC. The effect of telrandrine (TT) and polyving lpyzidine-N-oxide(PVNO) on gene expression of type I and type Ⅰ and type Ⅲ Collagens during experimental silicosis. Biomand Enrion Sci,1994,7:199-201.
3 范雪云,等.纤维化疾病人的补锌后血清锌、铜、铜蓝蛋白和尿羟脯氨酸变化的观察.中国工业医学杂志,1997,10:155-156.
4 卢涛.矽宁治疗矽肺血清铜蓝蛋白及IgG的变化观察.现代诊断与治疗,1997,8：39-40.
5刘秉慈,等.血清铜蓝蛋白ELISA法及微量法在矽肺临床中的应用.卫生研究,1996,1∶41-61.
6刘秉慈,等.微量法及ELISA法测定矽肺大鼠血清铜蓝蛋白.卫生研究,1996,1∶4-6.
(收稿：1997-11-12 修回：1998-04-06), 百拇医药
单位：266021 青岛医学院皮肤病所究所
关键词：瘢痕疙瘩；铜蓝蛋白；酶联免疫吸附试验
980205
【摘要】 目的 为了研究瘢痕疙瘩是否与血清铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,CP)浓度有关。方法 利用间接ELISA(酶联免疫吸附试验)的方法，初步探讨了血清CP的ELISA测定方法及在瘢痕疙瘩治疗中的应用。结果 瘢痕疙瘩组CP含量明显增高，与正常对照组比较差别有显著意义(P<0.01)。祛炎舒松A治疗后血清CP含量较瘢痕疙瘩组低(P<0.05)。结论 瘢痕疙瘩病人血清CP含量增高，祛炎松A治疗后血清CP下降，血清CP测定可用于瘢痕疙瘩体质的判定和疗效的评价。
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The measurement of CP level and the clinical application on the keloid patients Kang Erxun, Wu Yanfang. Institute of Dermatology, Qingdao Medical College ,Qingdao 266021
【Abstract】 Objective In order to study the keloid is related with the level of serum concentration of CP (Ceruloplasmin). Fibrotic disease such as silicosis sclerederma are related with the level of serum concentration of CP.Method This preliminary research was carried out by the method of indirect ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). We investigated the method of measuring CP in serum by ELISA and estimated the value in keloid treating.Result The level of CP is significantly higher than that of the control group (P<0.01). The CP level of the group treated with triamicinolone is lower than that of the keloid group (P<0.05).Conclusion The results show that the serum CP level is higher in keloid patients. After treated with triamcinolone, the CP concentration becomes lower, so the serum concentration of CP is an important factor can not be ignored in the keloid treating. It can be used as one of criteria to judge if a person with keloid tendency as well as to evaluate the effect of treatment.
, 百拇医药
【Key Words】 Keloid CP ELISA
瘢痕疙瘩是一种以皮肤真皮层胶原过度沉积为病理特征的皮肤病。我们利用间接ELISA法对20例瘢痕疙瘩病人和20例正常成人的血清铜蓝蛋白进行测定，报告如下：
实验分组与方法[1，2]
正常对照组为健康成人。瘢痕疙瘩组，皮损50 cm2以上，无其它疾患，未经药物治疗。祛炎舒松-A治疗组，瘢痕疙瘩，皮损50 cm2以上，采用青岛医学院皮肤病研究所研制的高压注射助推器皮损内祛炎舒松-A加2%利多卡因混(1∶1)，注射量以皮损表面苍白为度，半合液个月1。以皮损近于平复，痒痛感基本消失为治愈。每组观察20例，于治疗后观察血清CP值。
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1.抗原包被：将待测血清用包被液稀释10倍，每孔100 ul包被于聚苯乙烯酶标样品孔中，置于湿盒，4℃过夜。
2.封闭：样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入100ul封闭液，置4℃过夜。
3.加一抗：酶标样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入100ul稀释一定倍数的兔抗人CP血清，室温放置2小时。
4.加二抗：样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入100 ul稀释一定倍数的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG，室温置2小时。
5.显色反应：样品孔用PBS-T洗3次，每次3分钟，然后每孔加入一定量的酶底物(新鲜配制)，室温反应30分钟。
6.终止反应：加入100 ul终止液终止反应。
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7.测A值：于MB-Ⅲ型ELISA测定仪490nm处进行比色，测定A值。
结 果 血清间接ELISA法测定结果见表1～2。
表1 各实验组血清间接ELIAS测定的A值(±S，n=20)
实验组别
治疗前
治疗后
正常对照组(A)
0.40±0.05
0.40±0.04
瘢痕疙瘩组(B)
, 百拇医药
0.53±0.03
0.52±0.04
祛炎舒松A治疗组(C)
0.44±0.04
0.37±0.04
表2 各实验组血清CP含量比较(t检验结果)
组间比较
治疗后(P值)
A与B
<0.01
B与C
, 百拇医药
<0.05
A与C
>0.05
讨 论 铜蓝蛋白是由肝脏合成的一钟含铜糖蛋白，血清中96 %的铜存在于其粘末端的粘液酸部份，在机体的铜代谢起着重要作用。CP能够氧化苯二胺，具有二胺氧化酶的作用，被称为铜氧化酶[3，4]。研究表明：CP能促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成，参与胶原蛋白交联反应聚
合成纤维的过程。不少试验皆显示，纤维化疾病如矽肺、硬皮病等与血清CP含量有关[3，4]。
酶联免疫吸附试验，是应用固体吸附技术和免疫酶联技术将抗体或抗原吸附于固体支持物(聚苯乙烯微孔板)上，加入相应的抗原(或抗体)，产生免疫反应，形成酶标记的抗原抗体复合物，借酶底物与结合在抗体上的酶进行反应而显示其活性。通过测定酶与底物反应所产生的有色产物的光吸收值，以达到抗体或抗原定量的目的[1]。
, http://www.100md.com
50年代初，Holmberg等人利用CP氧化对苯二胺盐酸盐(P-Phenylene diamine dihydrochloride)产生紫色氧化物在520～530 nm处比色的原理，建立了CP的酶学测定方法，并对组织及血清CP活性单位进行测定。60年代初，Sunderman等人对此方法进行了改进并被推广使用[5]。70年代中期，Mancini等人建立了CP放免测定方法，90年代发展为酶免方法[6]。我们在总结已有的血清CP间接测定方法的基础上，初步探讨了瘢痕疙瘩血清CP间接ELISA测定方法，并用此方法测定了正常对照组，瘢瘢疙瘩组，祛炎舒松-A治疗组血清CP的含量。结果表明：瘢痕疙瘩组血清CP含量明显升高，与正常对照组比较差别有显著意义(P<0.01)。祛炎舒松-A治疗组血清CP含量较瘢痕疙瘩组低(P<0.05)。祛炎舒松-A治疗组与正常对照组相比无差别(P<0.05)。以上结果表明瘢痕疙瘩血清CP增高，祛炎舒松-A治疗后血清CP下降。因此，血清CP含量与瘢痕疙瘩胶原代谢有关。测定血清CP含量对于在术前预测瘢痕疙瘩的发生，减少不必要的麻烦，以及在瘢痕疙瘩的治疗评价中有重要意义。至于CP影响胶原代谢的机理尚有待进一步探讨。 参考文献1 钟惠仙,等.微量法测定130例健康人血清铜蓝蛋白正常值.浙江省医学科学院学报，1993，14：3739.
, http://www.100md.com
2 Liu BC. The effect of telrandrine (TT) and polyving lpyzidine-N-oxide(PVNO) on gene expression of type I and type Ⅰ and type Ⅲ Collagens during experimental silicosis. Biomand Enrion Sci,1994,7:199-201.
3 范雪云,等.纤维化疾病人的补锌后血清锌、铜、铜蓝蛋白和尿羟脯氨酸变化的观察.中国工业医学杂志,1997,10:155-156.
4 卢涛.矽宁治疗矽肺血清铜蓝蛋白及IgG的变化观察.现代诊断与治疗,1997,8：39-40.
5刘秉慈,等.血清铜蓝蛋白ELISA法及微量法在矽肺临床中的应用.卫生研究,1996,1∶41-61.
6刘秉慈,等.微量法及ELISA法测定矽肺大鼠血清铜蓝蛋白.卫生研究,1996,1∶4-6.
(收稿：1997-11-12 修回：1998-04-06), 百拇医药