一氧化氮在门静脉高压症高动力循环中作用的实验研究
作者：吴志勇 周健 陈治平 周浩庚 焦哲 邝耀麟 袁济民 王青 曾民德
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院外科(吴志勇、周健、陈治平、周浩庚、焦哲、邝耀麟)，核医学室(袁济民、王青)；上海市消化疾病研究所(曾民德)
关键词：高血压，门静脉；一氧化氮；血液动力学
中华外科杂志/980319 【摘要】 目的 研究一氧化氮(NO)在门静脉高压症高血流动力学中的作用。 方法 用SD大鼠制备肝内型(IHPH)、肝前型门静脉高压(PHPH)和门腔分流(PCS)三组模型，并以正常鼠作为对照组。每一组实验动物再分成三个亚组：NO生物合成抑制剂左旋单甲基精氨酸(L-NMMA)组、L-NMMA加NO生物合成底物L-精氨酸组以及生理盐水安慰组。血流动力学研究用放射性微球注射技术。 结果 IHPH、PHPH和PCS鼠均具有心输出量和内脏血流量增加，平均动脉压、周围血管总阻力和内脏血管阻力降低等高血流动力学特征。L-NMMA能逆转门静脉高压鼠和门腔分流鼠的高血流动力学状态，使之恢复至正常鼠的基础水平，但并未达到正常鼠用L-NMMA后的水平。如先给予L-精氨酸，则使L-NMMA对门静脉高压鼠和门腔分流鼠的心血管作用消失。 结论 门静脉高压症中NO过多产生是高动力循环重要的、但并不是唯一的介质。
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The role of nitric oxide in hyperdynamic circulation in portal hypertensive rats Wu Zhiyong, Zhou Jian, Chen Zhiping, et al.Department of Surgery, Renji Hospital，Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001.
【Abstract】 Objective To evaluate the role of nitric oxide (NO) in hyperhemodynamics in portal hypertension, we investigated the effects of nitric oxide synthase inhibitor L-NMMA with or without L-arginine, the substrate for enzyme NO synthase on the systemic and splanchnic hemodynamics in portal hypertensive rats. Method Ninety-seven male Sprague-Dawley rats were divided into four groups： intrahepatic portal hypertenison (IHPH,n=23) by injection of CCl4, prehepatic portal hypertension (PHPH, n=26) by stenosis of the portal vein, end-to-side portacaval shunt (PCS, n=23),and sham-operated controls (SO,n=25).Animals of each group were divided into three subgroups：systemic administration of L-NMMA (50 mg/kg BW,1 ml), L-NMMA (50 mg/kg BW, 0.5 ml)plus L-arginine (30 mg/kg BW,0.5 ml), and normal saline solution (1 ml). The radioactive microsphere method was used for hemodynamic study. Result There was the characteristic of hyperdynamic circulatory state including increased cardiac output and splanchnic blood flow, decreased mean arterial blood pressure, total peripheral vascular resistance and splanchnic vascular resistance in IHPH,PHPH and PCS rats. The hyperdynamic circulatory state in IHPH, PHPH and PCS rats could be effectively reversed by L-NMMA to the resting values of hemodynamics in SO rats, but not the levels after administration of L-NMMA in SO rats, indicating that there is excessive production of NO in portal hypertensive and PCS rats. Administration of L-arginine counterbalanced the effects of L-NMMA on hyperdynamic circulatory state in portal hypertensive and PCS rats. Conclusion NO is an important mediator of hyperdynamic circulation in portal hypertension.
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【Key words】 Hypertension，portal Nitric oxide Hemodynamics
为了探讨一氧化氮(NO)在门静脉高压症高血流动力学中的作用，我们观察NO抑制剂左旋单甲基精氨酸(L-NMMA)在有或无NO合成底物L-精氨酸(arginine，Arg)时对肝内型、肝前型门静脉高压鼠和门腔分流鼠全身和内脏血流动力学的影响。
材料与方法
1.实验动物：雄性SD大鼠，体重200±30 g，恒温饲养(25℃左右)，12小时光照和12小时黑暗交替，自由进食标准颗粒饲料及饮水。实验动物随机分成4组：肝前型门静脉高压(PHPH)组、肝内型门静脉高压(IHPH)组、门腔端侧分流(PCS)组和手术对照(SO)组。行血流动力学研究时，将PHPH、IHPH、PCS、SO鼠随机分成3个亚组，即生理盐水(vehicle)组、NO合成酶抑制剂L-NMMA组以及NO合成底物L-arginine+L-NMMA组(表1)。
, 百拇医药
表1 实验动物分组(只) 分 组
Vehicle组
L-NMMA组
L-NMMA+L-Arg组
SO
11
7
7
IHPH
9
7
7
PHPH
, 百拇医药
9
10
7
PCS
9
7
7
2.动物模型制备：(1)PHPH的制备：在开放乙醚麻醉、清洁的条件下正中切口进腹，分离门静脉主干，7号钝头针并置于门静脉后，在胃冠状静脉上方一同结扎，然后除去钝头针，即形成门静脉缩窄程度一致的肝前型门静脉高压症[1]。(2)IHPH的制备：60%的CCl4油溶液0.3 ml/100 g体重肌肉注射(首次为0.5 ml/100 g体重)每4天1次，共注射15次，同时饮10%乙醇[2]。(3)PCS的制备：分离门静脉和下腔静脉后，门静脉在左右支分叉下切断，然后用9-0尼龙线行端侧吻合术[3]。(4)SO的制备：乙醚麻醉进腹，游离门静脉和下腔静脉，约等10分钟后关腹。
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3.血流动力学研究[4]：在动物模型制备后2周行血流动力学研究。鼠用盐酸氯胺酮麻醉(100 mg/kg，肌注)，右侧颈动脉切开插入PE-50导管至左心室，以备注入51Cr微球。左侧股动脉插入另一根PE-50导管，用于监测平均动脉压(MAP)和准备采集测血流量用的标准血样。右侧股静脉插入PE-50导管至下腔静脉，用于测下腔静脉压(IVCP)和注入药物等。然后开腹，经回盲静脉插入一导管至门静脉，用于测游离门静脉压力(FPP)。除左心室导管外，其余导管均经压力换能器后连接于多导记录仪。O点定于手术台上方1 cm处(相当于鼠腋中线水平)。在整个实验过程中，鼠的直肠温度保持在37℃左右。
上述操作结束后稳定10分钟，记录MAP、IVCP和FPP。然后经右股静脉导管在4组实验动物的3个亚组分别注入1 ml生理盐水、L-NMMA 50 mg/kg体重(1 ml)以及注入L-Arg 300 mg/kg体重(0.5 ml)，5分钟后注入L-NMMA 50 mg/kg体重(0.5 ml)。10分钟后再次记录MAP、IVCP和FPP。然后经左心室导管注入约5万个51Cr微球(直径15±0.5 μm)0.4 ml，并用0.2 ml生理盐水冲洗导管。标准血样采集是从注入微球前10秒钟开始从股动脉导管抽血，速度1 ml/min，共采血75秒钟。经门静脉导管注入约3万个57Co微球(直径15±0.5 μm) 0.3 ml，用0.2 ml盐水冲洗导管。10分钟后用氯化钾处死动物，取下肺、肝、胃、胰、脾、大小肠和系膜。各脏器分别称重后，用γ-能谱仪测定各脏器和参考血样中51Cr和57Co的1分钟脉冲数(cpm)。
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4.血流动力学指标计算方法：
(1)心输出量(CO，ml/min)=[注入的51 Cr( cpm)×参考血样(ml/min)]/[参考血样51Cr(cpm)]；
(2)心脏指数(CI，ml·min-1·100gBW)=CO(ml·min)/[体重(g)÷100]；
(3)脏器血流量(ml/min)=[脏器51Cr(cpm)×参考血样(ml/min)]/[参考血样51 Cr(cpm)]；
(4)门静脉血流量(PVI，ml/min)等于胃、脾、胰、大小肠和肠系膜血流量之和；
(5)门体分流率(PSS%)=[肺57Co(cpm)]÷[肺57Co(cpm)+肝57Co(cpm)]×100；
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(6)门静脉入肝血流(PBF，ml/min)=[PVI-PVI]×PSS%；
(7)血管阻力(每分钟kPa·ml-1·min-1)=[P-P(kPa)]/Q(ml/min)；
①周围总阻力(TPR)=[MAP-右心房压(kPa)]/CO(ml/min)；
②门静脉阻力(PVR)=[PP-下腔静脉压(kPa)]/PVI(ml/min)；
③内脏血管阻力(SVR)=[MAP-PP(kPa)]/PVI(ml/min)。
右心房压力和下腔静脉压力很小(0～0.133 kPa)，计算时被忽略。
5.资料分析： 结果均用均数±标准差表示。在同一动物模型不同组(L-NMMA组、L-NMMA+L-Arg组和生理盐水组)间以及4种动物模型(PHPH、IHPH、PCS和SO)间比较用单因素方差分析。
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结果
1.L-NMMA对全身血流动力学的影响(表2)：
在基础状态时，与SO鼠比较，PCS鼠和PHPH鼠心脏指数(CI)显著地增大(P<0.05)，IHPH鼠CI增大未达统计显著性水平，其增大的顺序是PCS鼠>PHPH鼠>IHPH鼠。平均动脉压(MAP)和周围总阻力(TPR)在PHPH、IHPH和PCS鼠均显著地降低，尤以PCS鼠为最明显。
静注L-NMMA后10分钟，各组MAP和TPR
表2 L-NMMA对全身血流动力学的影响 血流动力学项目
Vehicle组
L-NMMA组
L-NMMA+L-Arg组
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CO(ml*min-1)
SO
83.42±10.78
69.30±12.73
81.77±19.78
IHPH
104.97±33.21
65.50±22.42#
117.08±34.44
PHPH
116.22±24.84*
, 百拇医药
69.53±21.02#
128.84±33.66
PCS
100.48±18.67
57.12±18.89#
127.64±47.83
CI(ml*min-1*100gBW-1)
SO
30.47±4.06
25.04±2.77
, 百拇医药
30.25±4.47
IHPH
39.36±10.08
30.20±9.29
40.11±10.64
PHPH
51.24±13.08*
31.12±5.63#
50.14±14.29
PCS
55.92±10.37*
, 百拇医药
31.07±8.45#
54.44±14.82
MAP(kPa)
SO
16.23±1.06
18.41±0.97
15.80±1.30
IHPH
12.78±0.93*
16.59±1.57
13.90±0.80
, 百拇医药
PHPH
12.82±2.29*
17.81±2.61#
13.96±0.97
PCS
10.80±1.94*
14.63±1.40#
13.10±1.73
TPR(kPa*ml-1*100gBW-1)
SO
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0.51±0.08
0.74±0.07#
0.53±0.09
IHPH
0.35±0.11*
0.69±0.21#
0.34±0.11
PHPH
0.27±0.09*
0.59±0.13#
, http://www.100md.com 0.31±0.10
PCS
0.20±0.07*
0.50±0.15#
0.27±0.07
注：与SO(Vehicle)比较 P<0.05，L-NMMA与Vehicle比较# P<0.05 升高，同时伴CO和CI下降(P<0.05)，PHPH、IHPH和PCS鼠的全身血流动力学指标在静注L-NMMA后均恢复至SO鼠基础水平。SO鼠也有类似变化，但其变化程度远小于IHPH、PHPH和PCS鼠。L-Arg能消除L-NMMA对全身血流动力学的影响，使CO、CI、MAP、TRP接近基础水平(P>0.05)。
, 百拇医药 2.L-NMMA对内脏血流动力学的影响(表3)：
(1)基础状态时血流动力学变化：与SO鼠比较，PVI在IHPH、PHPH以及PCS鼠中均显著地增多(P<0.05)，尤以PCS鼠为明显，内脏血流量增多的次序为PCS>PHPH>IHPH鼠。进一步分析发现在各组中均以胃的血流量增加最明显。IHPH、PHPH以及PCS鼠SVR均显著地低于SO鼠。但是，PVR在IHPH鼠显著地高于SO鼠，PCS鼠显著地低于SO鼠，而PHPH鼠与SO鼠比较差异无显著性意义。IHPH、PHPH和PCS鼠PSS分别为30.34%±10.87%、76.02%±20.62%和99.70%±0.29%。IHPH和PHPH鼠FPP显著地高于SO鼠，而PCS鼠显著地低于SO鼠。
(2)L-NMMA在有或无L-Arg时对内脏血流动力学的影响：L-NMMA能显著地减少4组动物的内脏血流量，使IHPH、PHPH和PCS鼠的PVI接近SO鼠基础水平。L-NMMA虽也使SO鼠的PVI显著地减少(25%)，但其程度较其他3组鼠为小。L-NMMA使4组实验鼠的SVR和PVR均增高，使IHPH、PHPH和PCS鼠与SO鼠在基础状态时比较无显著性差异。SO鼠的SVR虽也显著地增加，但其程度不及其他3组鼠。此外，SVR的增加较PVR的增加为多，提示L-NMMA对内脏小动脉的作用较内脏小静脉的作用明显。L-NMMA对PCS鼠的PSS无明显影响，但能减少PHPH和IHPH鼠的PSS。L-NMMA对FPP无明显影响。L-Arg能逆转L-NMMA对内脏血流动力学的影响，使各组鼠的PVI、SVR、PVR以及PSS回复至基础水平。
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讨论
1.门静脉高压症大鼠的血流动力学变化：本研究中，IHPH、PHPH和PCS鼠均具有心输出量和内脏血流量增加，平均动脉压、总周围血管阻力和内脏血管阻力降低等高血流动力学特征。NO是血管内皮细胞合成的局部血管扩张物质。已有研究表明代表NO产量的NO-2/NO-3 的增多以PCS组最高，PHPH组次之，IHPH组最低，血浆内毒素浓度的增高也是如此，而且血浆内毒素与NO-2/NO-3之间呈密切正相关[5]。本研究从肠系膜静脉注射同位素微球测门体分流率结果总体分析，血流动力学变化的程度是PCS>PHPH>IHPH。鉴于上述，门静脉高压症中门体分流和肝功能减退导致血浆内毒素升高，剌激NO合成和释放增加，引发高血流动力学。
门静脉压力由门静脉系阻力和血流量两者决定。与SO鼠的门静脉阻力比较，IHPH鼠显著地增高，而PHPH鼠无显著性差异，但PHPH鼠的FPP仍
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表3 L-NMMA对内脏血流动力学的影响 血流动力学
Vehicle
L-NMMA组
L-NMMA+L-arg组
肝动脉血流量(ml*min-1*g)
SO
0.68±0.31
0.58±0.34
0.70±0.26
IHPH
0.82±0.33*
, 百拇医药
0.43±0.15#
0.74±0.28
PHPH
1.07±0.44*
0.61±0.24#
0.84±0.38
PCS
1.68±0.61*
0.88±0.37#
1.42±0.40
胃血流量(ml.min-1*g)
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SO
0.45±0.10
0.34±0.06#
0.45±0.07
IHPH
0.80±0.26*
0.46±0.10#
0.81±0.11
PHPH
0.84±0.07*
0.42±0.17#
, 百拇医药
0.98±0.24
PCS
0.99±0.16*
0.44±0.09#
0.89±0.14
脾血流量(ml*min-1*g)
SO
0.55±0.24
0.32±0.12#
0.42±0.06
IHPH
, 百拇医药
0.75±0.28
0.42±0.22＃
0.72±0.28
PHPH
0.79±0.29
0.47±0.35＃
0.46±0.11
PCS
0.74±0.27
0.40±0.24＃
, 百拇医药
0.46±0.17
胰+肠系膜血流量(ml*min-1*g)
SO
0.43±0.12
0.35±0.14
0.39±0.05
IHPH
0.56±0.18
0.33±0.13#
0.49±0.21
PHPH
, 百拇医药
0.86±0.23
0.53±0.22＃
1.27±0.23
PCS
1.05±0.37
0.77±0.13＃
1.31±0.34
肠血流量(ml*min-1*g)
SO
0.71±0.06
, 百拇医药 0.58±0.05#
0.74±0.07
IHPH
1.01±0.27
0.72±0.23＃
1.06±0.26
PHPH
1.21±0.22
0.80±0.16＃
1.27±0.28
PCS
, 百拇医药
1.27±0.30
0.77±0.33＃
1.31±0.24
PVI(ml*min-1*g)
SO
2.14±0.36
1.59±0.22＃
2.02±0.11
IHPH
3.13±0.58
, 百拇医药 1.92±0.24＃
3.09±0.45
PHPH
3.70±0.68
2.27±0.92＃
3.35±0.74
PCS
4.10±0.77
2.22±0.75＃
3.25±0.73
SVR(kPa*ml-1*min-1*g)
, 百拇医药
SO
6.95±1.30
11.23±1.90＃
7.38±0.79
IHPH
3.70±1.37
7.90±1.70＃
3.27±0.81
PHPH
3.21±0.92
8.13±2.92＃
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3.86±0.97
PCS
2.61±0.71
7.01±2.16＃
4.31±0.81
PVR(kPa*ml-1*min-1*g)
SO
0.44±0.12
0.59±0.11＃
0.45±0.03
, 百拇医药
IHPH
0.59±0.15
0.91±0.15＃
0.55±0.08
PHPH
0.47±0.10
0.79±0.32＃
0.52±0.14
PCS
0.09±0.02
0.13±0.06＃
, 百拇医药
0.15±0.04
PSS(%)
SO
0.48±0.29
0.38±0.22
0.29±0.14
IHPH
30.34±10.86
19.85±15.38
26.72±15.49
PHPH
76.02±20.62
, 百拇医药
50.07±12.73＃
68.33±12.47
PCS
99.70±0.28
99.60±0.22
99.92±0.04
FPP(kPa)
SO
0.91±0.09
0.92±0.08
0.91±0.08
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IHPH
1.75±0.14
1.73±0.24
1.66±0.11
PHPH
1.61±0.20
1.55±0.19
1.66±0.19
PCS
0.40±0.11
0.41±0.12
, 百拇医药
0.46±0.07＃
注：与SO(Vehicle)比较*P<0.05， L-NMMA与Vehicle比较#P<0.05 显著地高于SO鼠。这可能与PHPH的PVI(3.70±0.68 ml·min-1·g)较SO鼠(2.14±0.36 ml·min-1·g)显著增加有关。此外，PHPH鼠存在广泛的门体侧支血管，约76%的门静脉系统血液经侧支流入体循环，提示侧支血管的阻力低于门静脉阻力。但已有研究证实，在肝前型门静脉高压动物模型中，侧支血管的阻力仍高于正常动物[6]，可以解释虽然PHPH鼠的门体分流率大于70%，但门静脉阻力却无明显变化。
本研究中，PCS鼠的血流动力学变化较IHPH和PHPH鼠为明显，其可能原因是：(1)PCS的门静脉血完全转离肝脏，而IHPH和PHPH的门体分流率为30%～76%，因此前者血中的血管扩张物质(如NO、胰高糖素等)较后两者为高[6]；(2)已有研究证实，各组对血管收缩剂敏感性的降低是PCS>PHPH或IHPH[7]；(3)在IHPH和PHPH鼠中，升高的门静脉压力本身对血管平滑肌是一种肌源性剌激[8]，其结果是使血管扩张的程度较PCS鼠为轻。
, 百拇医药
2.NO生物合成抑制剂对门静脉高压大鼠血流动力学的影响：在本实验中静脉注射L-NMMA使IHPH、PHPH及PCS鼠的MAP升高，同时使心输出量和内脏血流量下降，而外周和内脏血管阻力上升至与SO鼠基础水平无显著性差异。虽L-NMMA在SO鼠中也能引起类似变化，但变化的程度远无前3组明显(仅为前3组变化平均值的50%左右)。这说明NO可调节正常鼠全身和内脏的基础血流动力学[9]，同时在引起IHPH、PHPH及PCS鼠的高血流动力学中也起重要作用。Pizcueta等[10]发现，L-NMMA可增加SO鼠胃、胰和脾的血管阻力，不增加大肠和小肠的血管阻力，但可增加PHPH鼠所有血管床的阻力，说明正常鼠的内脏血管床对NO生物合成抑制剂的敏感性与PHPH鼠存在差异。在本实验中也发现L-NMMA对IHPH、PHPH及PCS鼠中各脏器的作用有程度的差异。对原先高血流动力学状态严重的门静脉系脏器的作用较其它脏器明显，提示L-NMMA对各脏器作用的程度差异与此脏器血管基础状态下合成和释放NO的多少有关。L-NMMA虽能使3组高血流动力学动物的各项指标恢复至SO鼠基础水平，但由于这3组鼠的基础血流动力学存在程度的差异，所以NO合成酶抑制剂的作用为PCS鼠>PHPH鼠>IHPH鼠，这可能与NO的产量是PCS>PHPH>IHPH有关。但是，L-NMMA并不能使IHPH、PHPH和PCS鼠的血流动力学状态达到L-NMMA作用下的SO鼠的水平，提示NO并非是门静脉高压高血液动力学的唯一介质，可能还有其它介质起作用。
, 百拇医药
本实验发现L-NMMA在显著减少门静脉系血流量的同时，也能减少肝动脉血流(HAF)，从而使肝总血流量下降，说明在IHPH、PHPH和PCS鼠中增高的HAF也和其它脏器血流一样受NO的调节。与其它静脉血管不同，门体侧支血管也受NO的调节。本实验发现，L-NMMA能收缩侧支血管，减少PHPH和IHPH鼠的门体分流量，同时升高PVR。因此，L-NMMA在降低PHPH和IHPH鼠门静脉血流量的同时，并不引起门静脉压力下降。
先给予L-Arg能在4组模型中逆转L-NMMA的心血管作用。因单独使用这一剂量的L-Arg5分钟后对基础MAP无显著影响，提示L-NMMA的作用非其直接收缩血管而是通过竞争性抑制L-Arg合成NO的结果，这进一步说明NO在调节基础血流动力学和门静脉高压高血流动力学中起作用。但本研究中不能明确NO合成增加是由于细菌内毒素剌激一氧化氮诱导合成酶(INOS)活性增加抑或其它因素引起的一氧化氮原生酶(CNOS)活性增加的结果[11，12]，而这两种因素可同时存在于本实验模型中。因此，有待于直接检测CNOS和INOS以及CNOS mRNA和INOS mRNA来回答此问题。
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参考文献
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12Bomzon A, Blendis LM.The nitric oxide synthesis and the hyperdynamic circulation in cirrhosis. Hepatology, 1994,5:1343-1350., http://www.100md.com
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院外科(吴志勇、周健、陈治平、周浩庚、焦哲、邝耀麟)，核医学室(袁济民、王青)；上海市消化疾病研究所(曾民德)
关键词：高血压，门静脉；一氧化氮；血液动力学
中华外科杂志/980319 【摘要】 目的 研究一氧化氮(NO)在门静脉高压症高血流动力学中的作用。 方法 用SD大鼠制备肝内型(IHPH)、肝前型门静脉高压(PHPH)和门腔分流(PCS)三组模型，并以正常鼠作为对照组。每一组实验动物再分成三个亚组：NO生物合成抑制剂左旋单甲基精氨酸(L-NMMA)组、L-NMMA加NO生物合成底物L-精氨酸组以及生理盐水安慰组。血流动力学研究用放射性微球注射技术。 结果 IHPH、PHPH和PCS鼠均具有心输出量和内脏血流量增加，平均动脉压、周围血管总阻力和内脏血管阻力降低等高血流动力学特征。L-NMMA能逆转门静脉高压鼠和门腔分流鼠的高血流动力学状态，使之恢复至正常鼠的基础水平，但并未达到正常鼠用L-NMMA后的水平。如先给予L-精氨酸，则使L-NMMA对门静脉高压鼠和门腔分流鼠的心血管作用消失。 结论 门静脉高压症中NO过多产生是高动力循环重要的、但并不是唯一的介质。
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The role of nitric oxide in hyperdynamic circulation in portal hypertensive rats Wu Zhiyong, Zhou Jian, Chen Zhiping, et al.Department of Surgery, Renji Hospital，Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001.
【Abstract】 Objective To evaluate the role of nitric oxide (NO) in hyperhemodynamics in portal hypertension, we investigated the effects of nitric oxide synthase inhibitor L-NMMA with or without L-arginine, the substrate for enzyme NO synthase on the systemic and splanchnic hemodynamics in portal hypertensive rats. Method Ninety-seven male Sprague-Dawley rats were divided into four groups： intrahepatic portal hypertenison (IHPH,n=23) by injection of CCl4, prehepatic portal hypertension (PHPH, n=26) by stenosis of the portal vein, end-to-side portacaval shunt (PCS, n=23),and sham-operated controls (SO,n=25).Animals of each group were divided into three subgroups：systemic administration of L-NMMA (50 mg/kg BW,1 ml), L-NMMA (50 mg/kg BW, 0.5 ml)plus L-arginine (30 mg/kg BW,0.5 ml), and normal saline solution (1 ml). The radioactive microsphere method was used for hemodynamic study. Result There was the characteristic of hyperdynamic circulatory state including increased cardiac output and splanchnic blood flow, decreased mean arterial blood pressure, total peripheral vascular resistance and splanchnic vascular resistance in IHPH,PHPH and PCS rats. The hyperdynamic circulatory state in IHPH, PHPH and PCS rats could be effectively reversed by L-NMMA to the resting values of hemodynamics in SO rats, but not the levels after administration of L-NMMA in SO rats, indicating that there is excessive production of NO in portal hypertensive and PCS rats. Administration of L-arginine counterbalanced the effects of L-NMMA on hyperdynamic circulatory state in portal hypertensive and PCS rats. Conclusion NO is an important mediator of hyperdynamic circulation in portal hypertension.
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【Key words】 Hypertension，portal Nitric oxide Hemodynamics
为了探讨一氧化氮(NO)在门静脉高压症高血流动力学中的作用，我们观察NO抑制剂左旋单甲基精氨酸(L-NMMA)在有或无NO合成底物L-精氨酸(arginine，Arg)时对肝内型、肝前型门静脉高压鼠和门腔分流鼠全身和内脏血流动力学的影响。
材料与方法
1.实验动物：雄性SD大鼠，体重200±30 g，恒温饲养(25℃左右)，12小时光照和12小时黑暗交替，自由进食标准颗粒饲料及饮水。实验动物随机分成4组：肝前型门静脉高压(PHPH)组、肝内型门静脉高压(IHPH)组、门腔端侧分流(PCS)组和手术对照(SO)组。行血流动力学研究时，将PHPH、IHPH、PCS、SO鼠随机分成3个亚组，即生理盐水(vehicle)组、NO合成酶抑制剂L-NMMA组以及NO合成底物L-arginine+L-NMMA组(表1)。
, 百拇医药
表1 实验动物分组(只) 分 组
Vehicle组
L-NMMA组
L-NMMA+L-Arg组
SO
11
7
7
IHPH
9
7
7
PHPH
, 百拇医药
9
10
7
PCS
9
7
7
2.动物模型制备：(1)PHPH的制备：在开放乙醚麻醉、清洁的条件下正中切口进腹，分离门静脉主干，7号钝头针并置于门静脉后，在胃冠状静脉上方一同结扎，然后除去钝头针，即形成门静脉缩窄程度一致的肝前型门静脉高压症[1]。(2)IHPH的制备：60%的CCl4油溶液0.3 ml/100 g体重肌肉注射(首次为0.5 ml/100 g体重)每4天1次，共注射15次，同时饮10%乙醇[2]。(3)PCS的制备：分离门静脉和下腔静脉后，门静脉在左右支分叉下切断，然后用9-0尼龙线行端侧吻合术[3]。(4)SO的制备：乙醚麻醉进腹，游离门静脉和下腔静脉，约等10分钟后关腹。
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3.血流动力学研究[4]：在动物模型制备后2周行血流动力学研究。鼠用盐酸氯胺酮麻醉(100 mg/kg，肌注)，右侧颈动脉切开插入PE-50导管至左心室，以备注入51Cr微球。左侧股动脉插入另一根PE-50导管，用于监测平均动脉压(MAP)和准备采集测血流量用的标准血样。右侧股静脉插入PE-50导管至下腔静脉，用于测下腔静脉压(IVCP)和注入药物等。然后开腹，经回盲静脉插入一导管至门静脉，用于测游离门静脉压力(FPP)。除左心室导管外，其余导管均经压力换能器后连接于多导记录仪。O点定于手术台上方1 cm处(相当于鼠腋中线水平)。在整个实验过程中，鼠的直肠温度保持在37℃左右。
上述操作结束后稳定10分钟，记录MAP、IVCP和FPP。然后经右股静脉导管在4组实验动物的3个亚组分别注入1 ml生理盐水、L-NMMA 50 mg/kg体重(1 ml)以及注入L-Arg 300 mg/kg体重(0.5 ml)，5分钟后注入L-NMMA 50 mg/kg体重(0.5 ml)。10分钟后再次记录MAP、IVCP和FPP。然后经左心室导管注入约5万个51Cr微球(直径15±0.5 μm)0.4 ml，并用0.2 ml生理盐水冲洗导管。标准血样采集是从注入微球前10秒钟开始从股动脉导管抽血，速度1 ml/min，共采血75秒钟。经门静脉导管注入约3万个57Co微球(直径15±0.5 μm) 0.3 ml，用0.2 ml盐水冲洗导管。10分钟后用氯化钾处死动物，取下肺、肝、胃、胰、脾、大小肠和系膜。各脏器分别称重后，用γ-能谱仪测定各脏器和参考血样中51Cr和57Co的1分钟脉冲数(cpm)。
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4.血流动力学指标计算方法：
(1)心输出量(CO，ml/min)=[注入的51 Cr( cpm)×参考血样(ml/min)]/[参考血样51Cr(cpm)]；
(2)心脏指数(CI，ml·min-1·100gBW)=CO(ml·min)/[体重(g)÷100]；
(3)脏器血流量(ml/min)=[脏器51Cr(cpm)×参考血样(ml/min)]/[参考血样51 Cr(cpm)]；
(4)门静脉血流量(PVI，ml/min)等于胃、脾、胰、大小肠和肠系膜血流量之和；
(5)门体分流率(PSS%)=[肺57Co(cpm)]÷[肺57Co(cpm)+肝57Co(cpm)]×100；
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(6)门静脉入肝血流(PBF，ml/min)=[PVI-PVI]×PSS%；
(7)血管阻力(每分钟kPa·ml-1·min-1)=[P-P(kPa)]/Q(ml/min)；
①周围总阻力(TPR)=[MAP-右心房压(kPa)]/CO(ml/min)；
②门静脉阻力(PVR)=[PP-下腔静脉压(kPa)]/PVI(ml/min)；
③内脏血管阻力(SVR)=[MAP-PP(kPa)]/PVI(ml/min)。
右心房压力和下腔静脉压力很小(0～0.133 kPa)，计算时被忽略。
5.资料分析： 结果均用均数±标准差表示。在同一动物模型不同组(L-NMMA组、L-NMMA+L-Arg组和生理盐水组)间以及4种动物模型(PHPH、IHPH、PCS和SO)间比较用单因素方差分析。
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结果
1.L-NMMA对全身血流动力学的影响(表2)：
在基础状态时，与SO鼠比较，PCS鼠和PHPH鼠心脏指数(CI)显著地增大(P<0.05)，IHPH鼠CI增大未达统计显著性水平，其增大的顺序是PCS鼠>PHPH鼠>IHPH鼠。平均动脉压(MAP)和周围总阻力(TPR)在PHPH、IHPH和PCS鼠均显著地降低，尤以PCS鼠为最明显。
静注L-NMMA后10分钟，各组MAP和TPR
表2 L-NMMA对全身血流动力学的影响 血流动力学项目
Vehicle组
L-NMMA组
L-NMMA+L-Arg组
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CO(ml*min-1)
SO
83.42±10.78
69.30±12.73
81.77±19.78
IHPH
104.97±33.21
65.50±22.42#
117.08±34.44
PHPH
116.22±24.84*
, 百拇医药
69.53±21.02#
128.84±33.66
PCS
100.48±18.67
57.12±18.89#
127.64±47.83
CI(ml*min-1*100gBW-1)
SO
30.47±4.06
25.04±2.77
, 百拇医药
30.25±4.47
IHPH
39.36±10.08
30.20±9.29
40.11±10.64
PHPH
51.24±13.08*
31.12±5.63#
50.14±14.29
PCS
55.92±10.37*
, 百拇医药
31.07±8.45#
54.44±14.82
MAP(kPa)
SO
16.23±1.06
18.41±0.97
15.80±1.30
IHPH
12.78±0.93*
16.59±1.57
13.90±0.80
, 百拇医药
PHPH
12.82±2.29*
17.81±2.61#
13.96±0.97
PCS
10.80±1.94*
14.63±1.40#
13.10±1.73
TPR(kPa*ml-1*100gBW-1)
SO
, http://www.100md.com
0.51±0.08
0.74±0.07#
0.53±0.09
IHPH
0.35±0.11*
0.69±0.21#
0.34±0.11
PHPH
0.27±0.09*
0.59±0.13#
, http://www.100md.com 0.31±0.10
PCS
0.20±0.07*
0.50±0.15#
0.27±0.07
注：与SO(Vehicle)比较 P<0.05，L-NMMA与Vehicle比较# P<0.05 升高，同时伴CO和CI下降(P<0.05)，PHPH、IHPH和PCS鼠的全身血流动力学指标在静注L-NMMA后均恢复至SO鼠基础水平。SO鼠也有类似变化，但其变化程度远小于IHPH、PHPH和PCS鼠。L-Arg能消除L-NMMA对全身血流动力学的影响，使CO、CI、MAP、TRP接近基础水平(P>0.05)。
, 百拇医药 2.L-NMMA对内脏血流动力学的影响(表3)：
(1)基础状态时血流动力学变化：与SO鼠比较，PVI在IHPH、PHPH以及PCS鼠中均显著地增多(P<0.05)，尤以PCS鼠为明显，内脏血流量增多的次序为PCS>PHPH>IHPH鼠。进一步分析发现在各组中均以胃的血流量增加最明显。IHPH、PHPH以及PCS鼠SVR均显著地低于SO鼠。但是，PVR在IHPH鼠显著地高于SO鼠，PCS鼠显著地低于SO鼠，而PHPH鼠与SO鼠比较差异无显著性意义。IHPH、PHPH和PCS鼠PSS分别为30.34%±10.87%、76.02%±20.62%和99.70%±0.29%。IHPH和PHPH鼠FPP显著地高于SO鼠，而PCS鼠显著地低于SO鼠。
(2)L-NMMA在有或无L-Arg时对内脏血流动力学的影响：L-NMMA能显著地减少4组动物的内脏血流量，使IHPH、PHPH和PCS鼠的PVI接近SO鼠基础水平。L-NMMA虽也使SO鼠的PVI显著地减少(25%)，但其程度较其他3组鼠为小。L-NMMA使4组实验鼠的SVR和PVR均增高，使IHPH、PHPH和PCS鼠与SO鼠在基础状态时比较无显著性差异。SO鼠的SVR虽也显著地增加，但其程度不及其他3组鼠。此外，SVR的增加较PVR的增加为多，提示L-NMMA对内脏小动脉的作用较内脏小静脉的作用明显。L-NMMA对PCS鼠的PSS无明显影响，但能减少PHPH和IHPH鼠的PSS。L-NMMA对FPP无明显影响。L-Arg能逆转L-NMMA对内脏血流动力学的影响，使各组鼠的PVI、SVR、PVR以及PSS回复至基础水平。
, 百拇医药
讨论
1.门静脉高压症大鼠的血流动力学变化：本研究中，IHPH、PHPH和PCS鼠均具有心输出量和内脏血流量增加，平均动脉压、总周围血管阻力和内脏血管阻力降低等高血流动力学特征。NO是血管内皮细胞合成的局部血管扩张物质。已有研究表明代表NO产量的NO-2/NO-3 的增多以PCS组最高，PHPH组次之，IHPH组最低，血浆内毒素浓度的增高也是如此，而且血浆内毒素与NO-2/NO-3之间呈密切正相关[5]。本研究从肠系膜静脉注射同位素微球测门体分流率结果总体分析，血流动力学变化的程度是PCS>PHPH>IHPH。鉴于上述，门静脉高压症中门体分流和肝功能减退导致血浆内毒素升高，剌激NO合成和释放增加，引发高血流动力学。
门静脉压力由门静脉系阻力和血流量两者决定。与SO鼠的门静脉阻力比较，IHPH鼠显著地增高，而PHPH鼠无显著性差异，但PHPH鼠的FPP仍
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表3 L-NMMA对内脏血流动力学的影响 血流动力学
Vehicle
L-NMMA组
L-NMMA+L-arg组
肝动脉血流量(ml*min-1*g)
SO
0.68±0.31
0.58±0.34
0.70±0.26
IHPH
0.82±0.33*
, 百拇医药
0.43±0.15#
0.74±0.28
PHPH
1.07±0.44*
0.61±0.24#
0.84±0.38
PCS
1.68±0.61*
0.88±0.37#
1.42±0.40
胃血流量(ml.min-1*g)
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SO
0.45±0.10
0.34±0.06#
0.45±0.07
IHPH
0.80±0.26*
0.46±0.10#
0.81±0.11
PHPH
0.84±0.07*
0.42±0.17#
, 百拇医药
0.98±0.24
PCS
0.99±0.16*
0.44±0.09#
0.89±0.14
脾血流量(ml*min-1*g)
SO
0.55±0.24
0.32±0.12#
0.42±0.06
IHPH
, 百拇医药
0.75±0.28
0.42±0.22＃
0.72±0.28
PHPH
0.79±0.29
0.47±0.35＃
0.46±0.11
PCS
0.74±0.27
0.40±0.24＃
, 百拇医药
0.46±0.17
胰+肠系膜血流量(ml*min-1*g)
SO
0.43±0.12
0.35±0.14
0.39±0.05
IHPH
0.56±0.18
0.33±0.13#
0.49±0.21
PHPH
, 百拇医药
0.86±0.23
0.53±0.22＃
1.27±0.23
PCS
1.05±0.37
0.77±0.13＃
1.31±0.34
肠血流量(ml*min-1*g)
SO
0.71±0.06
, 百拇医药 0.58±0.05#
0.74±0.07
IHPH
1.01±0.27
0.72±0.23＃
1.06±0.26
PHPH
1.21±0.22
0.80±0.16＃
1.27±0.28
PCS
, 百拇医药
1.27±0.30
0.77±0.33＃
1.31±0.24
PVI(ml*min-1*g)
SO
2.14±0.36
1.59±0.22＃
2.02±0.11
IHPH
3.13±0.58
, 百拇医药 1.92±0.24＃
3.09±0.45
PHPH
3.70±0.68
2.27±0.92＃
3.35±0.74
PCS
4.10±0.77
2.22±0.75＃
3.25±0.73
SVR(kPa*ml-1*min-1*g)
, 百拇医药
SO
6.95±1.30
11.23±1.90＃
7.38±0.79
IHPH
3.70±1.37
7.90±1.70＃
3.27±0.81
PHPH
3.21±0.92
8.13±2.92＃
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3.86±0.97
PCS
2.61±0.71
7.01±2.16＃
4.31±0.81
PVR(kPa*ml-1*min-1*g)
SO
0.44±0.12
0.59±0.11＃
0.45±0.03
, 百拇医药
IHPH
0.59±0.15
0.91±0.15＃
0.55±0.08
PHPH
0.47±0.10
0.79±0.32＃
0.52±0.14
PCS
0.09±0.02
0.13±0.06＃
, 百拇医药
0.15±0.04
PSS(%)
SO
0.48±0.29
0.38±0.22
0.29±0.14
IHPH
30.34±10.86
19.85±15.38
26.72±15.49
PHPH
76.02±20.62
, 百拇医药
50.07±12.73＃
68.33±12.47
PCS
99.70±0.28
99.60±0.22
99.92±0.04
FPP(kPa)
SO
0.91±0.09
0.92±0.08
0.91±0.08
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IHPH
1.75±0.14
1.73±0.24
1.66±0.11
PHPH
1.61±0.20
1.55±0.19
1.66±0.19
PCS
0.40±0.11
0.41±0.12
, 百拇医药
0.46±0.07＃
注：与SO(Vehicle)比较*P<0.05， L-NMMA与Vehicle比较#P<0.05 显著地高于SO鼠。这可能与PHPH的PVI(3.70±0.68 ml·min-1·g)较SO鼠(2.14±0.36 ml·min-1·g)显著增加有关。此外，PHPH鼠存在广泛的门体侧支血管，约76%的门静脉系统血液经侧支流入体循环，提示侧支血管的阻力低于门静脉阻力。但已有研究证实，在肝前型门静脉高压动物模型中，侧支血管的阻力仍高于正常动物[6]，可以解释虽然PHPH鼠的门体分流率大于70%，但门静脉阻力却无明显变化。
本研究中，PCS鼠的血流动力学变化较IHPH和PHPH鼠为明显，其可能原因是：(1)PCS的门静脉血完全转离肝脏，而IHPH和PHPH的门体分流率为30%～76%，因此前者血中的血管扩张物质(如NO、胰高糖素等)较后两者为高[6]；(2)已有研究证实，各组对血管收缩剂敏感性的降低是PCS>PHPH或IHPH[7]；(3)在IHPH和PHPH鼠中，升高的门静脉压力本身对血管平滑肌是一种肌源性剌激[8]，其结果是使血管扩张的程度较PCS鼠为轻。
, 百拇医药
2.NO生物合成抑制剂对门静脉高压大鼠血流动力学的影响：在本实验中静脉注射L-NMMA使IHPH、PHPH及PCS鼠的MAP升高，同时使心输出量和内脏血流量下降，而外周和内脏血管阻力上升至与SO鼠基础水平无显著性差异。虽L-NMMA在SO鼠中也能引起类似变化，但变化的程度远无前3组明显(仅为前3组变化平均值的50%左右)。这说明NO可调节正常鼠全身和内脏的基础血流动力学[9]，同时在引起IHPH、PHPH及PCS鼠的高血流动力学中也起重要作用。Pizcueta等[10]发现，L-NMMA可增加SO鼠胃、胰和脾的血管阻力，不增加大肠和小肠的血管阻力，但可增加PHPH鼠所有血管床的阻力，说明正常鼠的内脏血管床对NO生物合成抑制剂的敏感性与PHPH鼠存在差异。在本实验中也发现L-NMMA对IHPH、PHPH及PCS鼠中各脏器的作用有程度的差异。对原先高血流动力学状态严重的门静脉系脏器的作用较其它脏器明显，提示L-NMMA对各脏器作用的程度差异与此脏器血管基础状态下合成和释放NO的多少有关。L-NMMA虽能使3组高血流动力学动物的各项指标恢复至SO鼠基础水平，但由于这3组鼠的基础血流动力学存在程度的差异，所以NO合成酶抑制剂的作用为PCS鼠>PHPH鼠>IHPH鼠，这可能与NO的产量是PCS>PHPH>IHPH有关。但是，L-NMMA并不能使IHPH、PHPH和PCS鼠的血流动力学状态达到L-NMMA作用下的SO鼠的水平，提示NO并非是门静脉高压高血液动力学的唯一介质，可能还有其它介质起作用。
, 百拇医药
本实验发现L-NMMA在显著减少门静脉系血流量的同时，也能减少肝动脉血流(HAF)，从而使肝总血流量下降，说明在IHPH、PHPH和PCS鼠中增高的HAF也和其它脏器血流一样受NO的调节。与其它静脉血管不同，门体侧支血管也受NO的调节。本实验发现，L-NMMA能收缩侧支血管，减少PHPH和IHPH鼠的门体分流量，同时升高PVR。因此，L-NMMA在降低PHPH和IHPH鼠门静脉血流量的同时，并不引起门静脉压力下降。
先给予L-Arg能在4组模型中逆转L-NMMA的心血管作用。因单独使用这一剂量的L-Arg5分钟后对基础MAP无显著影响，提示L-NMMA的作用非其直接收缩血管而是通过竞争性抑制L-Arg合成NO的结果，这进一步说明NO在调节基础血流动力学和门静脉高压高血流动力学中起作用。但本研究中不能明确NO合成增加是由于细菌内毒素剌激一氧化氮诱导合成酶(INOS)活性增加抑或其它因素引起的一氧化氮原生酶(CNOS)活性增加的结果[11，12]，而这两种因素可同时存在于本实验模型中。因此，有待于直接检测CNOS和INOS以及CNOS mRNA和INOS mRNA来回答此问题。
, http://www.100md.com
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, 百拇医药
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