移植pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞对脊髓损伤后细胞凋亡的影响
作者：陈礼刚 高立达 曾凡俊 胡威夷 毛伯镛 陈俊杰 赖立辉 李开慧 卢敏
单位：陈礼刚 曾凡俊 胡威夷 李开慧 卢敏 610083 成都,成都军区总医院神经外科;高立达 毛伯镛 华西医科大学附属第一医院神经外科;陈俊杰 赖立辉 华西医科大学基础医学重组DNA研究室
关键词：细胞凋亡；脊髓损伤；基因修饰；雪旺氏细胞；移植
中华创伤杂志980310 【摘要】 目的 探讨pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞(SC)移植对脊髓损伤(SCI)后细胞凋亡的作用。方法 将实验动物分为pSVPoMcat微基因修饰SC组(A组),SC移植组(B组),损伤对照组(C组)。移植后12周,对SCI区的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测(甲基绿-派诺宁染色法和荧光原位标记法)以及Bc1～2和Fas蛋白表达的测定(免疫组化法)。结果 在A、B、C组中,均发现凋亡细胞及Bc1～2和Fas蛋白阳性表达。体视学计量发现,细胞凋亡率为C>B>A;Bc1～2蛋白阳性表达顺序为A>B>C;Fas蛋白阳性表达顺序为C>B>A。结论 pSVPoMcat微基因修饰SC移植能抑制SCI后的细胞凋亡,而创伤则可诱发细胞凋亡。
, http://www.100md.com
Effect of Microgene pSVPoMcat Implanted to Modify Genetically Schwann Cells on Apoptosis After Spinal Cord Injury CHEN Li-gang, GAO Li-da, ZENG Fan-jun, et al. Dept. of Neurosurgery, General Hospital of Chengdu Military Command, Chengdu 610083
【Abstract】 Aim To study the effect of microgene pSVPoMcat implanted to genetically modify Schwann cells (SC) on apoptosis after spinal cord injury (SCI). Methods Experimental animals were divided into three groups: the group of microgene pSVPoMcat implanted to genetically modify SC (group A), SC implanted group (group B) and the control group (group C). The apoptosis of spinal slice from the injured spinal cord were examined by the methods of methye green, terminal deoxynucleotidyl and the dUTP nick end labelling technique, and the expression of Bc1-2 and Fas protein were measured immunohistochemically 12 weeks post-operation. Result The rate of apoptosis sequence, the strong expression sequence of Bc1-2 and Fas protein expression were found in all three groups, but C>B>A (P<0.05), A>B>C (P<0.05), and C>B>A (P<0.05), respectively. Conclusion It indicates that the pSVPoMcat implanted to genetically modify SC can inhibit the apoptosis, and trauma can induce apoptosis after SCI.
, 百拇医药
【Key words】 Apoptosis Spinal cord injury Genetically modify Schwann cell Implantation
近年来,随着分子生物学研究发展,人们已认识到细胞凋亡(apoptosis)是基因表达的结果,受细胞内外因素的调节,如果这一调控失调,就会引起细胞增殖及死亡间的平衡障碍,进而导致许多神经疾病的发生。
Crowe等[1]研究表明,CNS受损后,细胞凋亡与坏死并存,共同加重CNS的损害。大量的实验研究证明,在鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后6小时～3周内,特别在白质内可以发现大量凋亡的少突胶质细胞;细胞凋亡是SCI继发损害的关键;SCI后继发性溃变及慢性脱髓鞘性变,均与细胞凋亡有关[1～3]。目前已证实,雪旺氏细胞(schwann cell, SC)可作为在脊髓内表达外源基因的有效运载体,Po-5'-flanking能够指导外源基因在SC中特异性表达[4]。最近,我们在首次构建Po-5'-flanking介导21.5KDhMBP(髓鞘碱性蛋白)微基因(暂命名为pSVPoMcat)的基础上,进行了该微基因在SC中的表达研究。结果表明pSVPoMcat表达产物对SC的生长和增殖有明显的促进作用。因此,我们将该微基因修饰的SC移植入损伤的脊髓内,以进一步探讨其对SCI后细胞凋亡的作用,为临床应用转基因的自体SC移植治疗SCI提供实验依据。
, 百拇医药
材料与方法
一、SCI模型的建立及基因修饰SC的脊髓内移植
受体健康SD大鼠60只,体重180～250g,雌雄不拘(由华西医科大学动物中心提供),随机分为三组:含pSVPoMcat微基因的SC组为A组(pSVPoMcat微基因在华西医科大学基础医学院重组DNA研究室构建;pSVPoMcat微基因转染至SC中,在华西医科大学医学分子实验室进行,参照Lipofectamine试剂盒操作说明书进行);高纯度SC移植组为B组;SCI对照组为C组,每组20只。受体鼠用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉后,按Tuszynski等[5]方法将左半侧的脊髓横向切断,再用微玻璃管吸除约2mm脊髓组织,使其形成一个间隙,用棉球明胶海绵轻压止血,待移植。姫参照Wang等的方法[11],将含pSVPoMcat微基因的SC悬液重悬于一定体积的盐溶液,使之成为2.5×104cells/μl悬液,然后将上述悬液3ml浸透在与宿主脊髓间隙大小一致的可吸收性明胶海绵上,并将其植入A组动物模型中。确认植入后用8-0无创缝线逐层缝合(间断)硬脊膜、肌层及皮肤。用同样方法,B组动物植入含3μl(2.5×104cells/μl)高纯化SC的明胶海绵。C组动物仅植入明胶海绵,为假移植组。
, 百拇医药
二、细胞凋亡的检测
术后12周,实验动物经麻醉后,用等渗盐水、4%多聚甲醛及1%戊二醛做心脏灌注固定。取脊髓全长,对SCI区上、下端3～4mm的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测。另取正常成鼠脊髓组织(T8)切片作为正常对照。
1.甲基绿-派诺宁染色参照Moffitt[7]方法进行;荧光原位末端标记法,参照Boringer公司Insitu cell death detection kit, Fluorescein说明书操作。
2.Bc1～2及Fas检测:鼠抗人Bc1～2单抗(100)和兔抗Fas(C-20)多抗;ABC试剂盒,采用Vector实验生产的卵白素-生物素过氧化物酶复合试剂盒,将上述4ml石蜡切片涂于凝胶的玻片上,常规处理后,参照文献[8]及ABC试剂盒说明书进行。
三、统计学处理
, 百拇医药
采用单因素方差分析、SNK方法两两比较。
结 果
甲基绿-派诺宁法及荧光原位标记法的检测
在正常脊髓组织切片,上述两种方法均显示有凋亡神经细胞。在A、B、C三组SCI区切片,这种凋亡细胞(按体视学原则计数[9])逐渐增多,见表1。
表1 甲基绿-派诺宁法及荧光原位标记法示
各组神经元凋亡率(
±s)
组别
甲基绿-派诺宁
, 百拇医药 荧光原位标记
正常组
1.91±0.21*
5.22±1.13**
A组
2.55±0.37*
13.34±3.11**
B组
2.86±0.26*
18.41±5.57**
C组
, 百拇医药
4.61±0.38*
38.78±5.57**
注:视场面积17077888μm,平均视场神经元225.38±17.6
各组之间比较 *P<0.05 **P<0.05
Bc1～2和Fas阳性:细胞浆或胞核呈棕黄色的颗粒。按体视学原则和方法:计数各区域阳性染色的细胞数和细胞总数,计算出阳性表达细胞百分率pi(i=1.2.3);由HS=(i+1)pi计算免疫组化评分(imunohistochemical score, HS)其分值范围为0～400, HS<100为阴性。表2反映了A、B、C组Bc1～2和Fas蛋白表达情况。
表2 A、B、C三组Bc1～2、Fas蛋白表达评分(±s) 组别
, 百拇医药
Bc1～2
Fas
正常组
106.2±118.1*
193.3±91.3**
A组
270.0±88.1*
190.4±108.0**
B组
244.3±87.9*
198.2±81.3**
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C组
183.1±100.3*
254.1±80.1**
各组之间比较 *P<0.05 **P<0.05
讨 论
本研究通过两种细胞凋亡检测方法(两种方法虽然凋亡率不一致,但结果趋势相一致,究其原因,可能是荧光原位标记法灵敏度高和/或该法能够显示非神经元凋亡,还有待于进一步探索)证实了在SCI后的脊髓内存在神经元凋亡,而且正常组与A、B、C三组之间凋亡率存在显著性差异(正常B>C)。Pabizaheh等研究表明,P75NGFR能诱导神经元凋亡,而且在NGF浓度较低时,因NGF只能与高亲和力的受体结合,抑制细胞凋亡很弱,但当NGF浓度增高,能够同时和低亲和力受体结合时,细胞凋亡将受到明显抑制。我们在SCI后3个月仍发现神经元凋亡,推测与此时仍有NGFR再表达有关。Wang等
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[11]研究证实,SCI后4天起前角运动神经元逐渐减少,但直到28个月仍有NGFR表达。SCI后运动神经元再表达NGFR反映了损伤后神经细胞对NGF需求增加,以维持伤后NGF依赖性神经元生存。
细胞凋亡是多基因参与的细胞生命过程,是由基因编程序控制的主动死亡过程,故又称为程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。根据凋亡调控基因作用的不同将其分为二类:一类是抑制细胞凋亡的基因如突变型p53、Bc1～2、ced～9等基因;另一类是诱导凋亡的基因如野生型p53、Fas、ced～4Myc等基因[12]。为此,我们选择目前最受关注的与细胞凋亡关系密切的基因Bc1～2及Fas基因进行研究。结果发现:Bc1～2和Fas蛋白表达的顺序分别为A>B>C及C>B>A。目前的研究已证实,Bc1～2产物不是加速细胞分裂,而是抑制细胞凋亡,延长细胞寿命,促进细胞生存,且这种作用与细胞的增殖周期无关[13，14]。Fas基因作为一种跨膜糖蛋白分子,当与抗Fas抗体或Fas配体结合时,可使表达Fas阳性的细胞发生凋亡[15]。因此,Bc1～2及Fas的表达结果,进一步证实了转pSVPoMcat微基因的SC移植对SCI后细胞凋亡有抑制作用,而创伤则诱发细胞凋亡。这为临床运用转基因的SC移植治疗SCI提供了实验依据。
, 百拇医药
有关SCI后发生细胞凋亡的机制仍有待于较深入的研究,SCI后早期,神经元C-fos、IEGS等基因表达可促进细胞凋亡或因细胞内Ca2+浓度增高,激发细胞凋亡;或因代谢增强,细胞内蛋白酶激活,细胞质内mRNA表达增强而致凋亡;或因NGF的缺乏而激活细胞内死亡基因表达,促进死亡蛋白合成,继之细胞凋亡等[16～18]。因此,本研究所揭示的pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI后细胞凋亡的抑制作用和创伤诱发细胞凋亡的机制还需要进一步研究。
参考文献
[1]Crowe MJ, Breshahan JC, Shumam SL. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat-Med, 1997, 3∶73-76.
[2]Li GL, Brodin G, Farooque M, et al. Apoptosis and expression of Bc1～2 after compression trauma to rat spinal cord. J Neuropahal Exp Neurol, 1996, 55∶280-289.
, 百拇医药
[3]Marcia Barinaga. New view of spinal cord injury. Science, 1996, 274∶1466.
[4]Tuszynski MH, Megers Nakahara. Fibroblast and Schwann cells genetically modified to produce neurotrophic factor induce robust neuritic growth after transplantation to the spinal cord. Soc Neurosci Abstr, 1994, 20∶10.
[5]Tuszynski MH, Gabried K, Gage FH, et al. Nerve growth factor delivery by gene transfer induces differential outgrowth of sensory, motor, and noradrenergic neurites after adult spinal cord injury. Exp Neurd, 1996, 137∶157-173.
, 百拇医药
[6]Nonag JJ, Chuah MI, Yew DT, et al. Effects of astrocyte implantation into the hemisected adult rat spinal cord. Neurosci, 1995, 65∶913.
[7]Moffitt P. A Methyl green-pironin technique for demostrating cell death in the murine tumours 180. Cell Biol, 1994, 18∶677.
[8]石善溶主编.免疫组织化学技术.成都:四川科学技术出版社,1980, 12-14.
[9]Rocker RR. Bone histomorphometer: Technique and interpretation. Florida: CRC Press, Inc, Boca Raton, 1990,90-93.
, http://www.100md.com
[10]王山荣.低亲和力神经生长因子受体诱导细胞凋亡.国外医学.分子生物学分册, 1994, 16∶236.
[11]Wang zihui, Han zhihai, Walter GF, et al. The expression of nerve growth factor receptor on Schwann cell and the efffect of these cells on regeneration of axons in traumatic injury human spinal cord. Chinese Journal of Histochemistery and Cytochemistry, 1996, 5∶365-370.
[12]Martin SJ, Colbert RA, Young DA, et al. Dicing with death: Disseting the components of the apoptosis machinery. TIBS, 1994, 19∶26-30.
, 百拇医药
[13]Hockenbery D, Nuner G, Milliman C. Bc1～2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmes cell death. Nature, 1990, 348∶334.
[14]Mcdonnel JJ, Nunez G, Peatt FM. Deregulated Bc1～2-Ig transgene expands a resting but responsive immunoglobulin M and D-expressing B-cell population. Molc Cell Biol, 1990, 10∶1901-1907.
[15]Vallbo C, Williams GT, Smith CA, et al. DNA fragmentation induced by the animitotic drug estramusting in malighant rat gliom but not in normal brain-suggesting an apoptosis cell death. J Bri Cancer, 1995, 71∶717-825.
, 百拇医药
[16]White E. Death defying acts: Metting review on apoptosis. Genes and Development, 1993, 7∶2277-2284.
[17]Reed JC. Bc1～2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biology , 1994, 324∶1-6.
[18]Binderr C, Hinddemann W. Programmed cell death many questions still to be answered. Ann Hematol, 1994, 69∶45-55.
(收稿:1997-10-27 修回:1998-02-23), 百拇医药
单位：陈礼刚 曾凡俊 胡威夷 李开慧 卢敏 610083 成都,成都军区总医院神经外科;高立达 毛伯镛 华西医科大学附属第一医院神经外科;陈俊杰 赖立辉 华西医科大学基础医学重组DNA研究室
关键词：细胞凋亡；脊髓损伤；基因修饰；雪旺氏细胞；移植
中华创伤杂志980310 【摘要】 目的 探讨pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞(SC)移植对脊髓损伤(SCI)后细胞凋亡的作用。方法 将实验动物分为pSVPoMcat微基因修饰SC组(A组),SC移植组(B组),损伤对照组(C组)。移植后12周,对SCI区的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测(甲基绿-派诺宁染色法和荧光原位标记法)以及Bc1～2和Fas蛋白表达的测定(免疫组化法)。结果 在A、B、C组中,均发现凋亡细胞及Bc1～2和Fas蛋白阳性表达。体视学计量发现,细胞凋亡率为C>B>A;Bc1～2蛋白阳性表达顺序为A>B>C;Fas蛋白阳性表达顺序为C>B>A。结论 pSVPoMcat微基因修饰SC移植能抑制SCI后的细胞凋亡,而创伤则可诱发细胞凋亡。
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Effect of Microgene pSVPoMcat Implanted to Modify Genetically Schwann Cells on Apoptosis After Spinal Cord Injury CHEN Li-gang, GAO Li-da, ZENG Fan-jun, et al. Dept. of Neurosurgery, General Hospital of Chengdu Military Command, Chengdu 610083
【Abstract】 Aim To study the effect of microgene pSVPoMcat implanted to genetically modify Schwann cells (SC) on apoptosis after spinal cord injury (SCI). Methods Experimental animals were divided into three groups: the group of microgene pSVPoMcat implanted to genetically modify SC (group A), SC implanted group (group B) and the control group (group C). The apoptosis of spinal slice from the injured spinal cord were examined by the methods of methye green, terminal deoxynucleotidyl and the dUTP nick end labelling technique, and the expression of Bc1-2 and Fas protein were measured immunohistochemically 12 weeks post-operation. Result The rate of apoptosis sequence, the strong expression sequence of Bc1-2 and Fas protein expression were found in all three groups, but C>B>A (P<0.05), A>B>C (P<0.05), and C>B>A (P<0.05), respectively. Conclusion It indicates that the pSVPoMcat implanted to genetically modify SC can inhibit the apoptosis, and trauma can induce apoptosis after SCI.
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【Key words】 Apoptosis Spinal cord injury Genetically modify Schwann cell Implantation
近年来,随着分子生物学研究发展,人们已认识到细胞凋亡(apoptosis)是基因表达的结果,受细胞内外因素的调节,如果这一调控失调,就会引起细胞增殖及死亡间的平衡障碍,进而导致许多神经疾病的发生。
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, 百拇医药
材料与方法
一、SCI模型的建立及基因修饰SC的脊髓内移植
受体健康SD大鼠60只,体重180～250g,雌雄不拘(由华西医科大学动物中心提供),随机分为三组:含pSVPoMcat微基因的SC组为A组(pSVPoMcat微基因在华西医科大学基础医学院重组DNA研究室构建;pSVPoMcat微基因转染至SC中,在华西医科大学医学分子实验室进行,参照Lipofectamine试剂盒操作说明书进行);高纯度SC移植组为B组;SCI对照组为C组,每组20只。受体鼠用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉后,按Tuszynski等[5]方法将左半侧的脊髓横向切断,再用微玻璃管吸除约2mm脊髓组织,使其形成一个间隙,用棉球明胶海绵轻压止血,待移植。姫参照Wang等的方法[11],将含pSVPoMcat微基因的SC悬液重悬于一定体积的盐溶液,使之成为2.5×104cells/μl悬液,然后将上述悬液3ml浸透在与宿主脊髓间隙大小一致的可吸收性明胶海绵上,并将其植入A组动物模型中。确认植入后用8-0无创缝线逐层缝合(间断)硬脊膜、肌层及皮肤。用同样方法,B组动物植入含3μl(2.5×104cells/μl)高纯化SC的明胶海绵。C组动物仅植入明胶海绵,为假移植组。
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二、细胞凋亡的检测
术后12周,实验动物经麻醉后,用等渗盐水、4%多聚甲醛及1%戊二醛做心脏灌注固定。取脊髓全长,对SCI区上、下端3～4mm的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测。另取正常成鼠脊髓组织(T8)切片作为正常对照。
1.甲基绿-派诺宁染色参照Moffitt[7]方法进行;荧光原位末端标记法,参照Boringer公司Insitu cell death detection kit, Fluorescein说明书操作。
2.Bc1～2及Fas检测:鼠抗人Bc1～2单抗(100)和兔抗Fas(C-20)多抗;ABC试剂盒,采用Vector实验生产的卵白素-生物素过氧化物酶复合试剂盒,将上述4ml石蜡切片涂于凝胶的玻片上,常规处理后,参照文献[8]及ABC试剂盒说明书进行。
三、统计学处理
, 百拇医药
采用单因素方差分析、SNK方法两两比较。
结 果
甲基绿-派诺宁法及荧光原位标记法的检测
在正常脊髓组织切片,上述两种方法均显示有凋亡神经细胞。在A、B、C三组SCI区切片,这种凋亡细胞(按体视学原则计数[9])逐渐增多,见表1。
表1 甲基绿-派诺宁法及荧光原位标记法示
各组神经元凋亡率(
±s)组别
甲基绿-派诺宁
, 百拇医药 荧光原位标记
正常组
1.91±0.21*
5.22±1.13**
A组
2.55±0.37*
13.34±3.11**
B组
2.86±0.26*
18.41±5.57**
C组
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4.61±0.38*
38.78±5.57**
注:视场面积17077888μm,平均视场神经元225.38±17.6
各组之间比较 *P<0.05 **P<0.05
Bc1～2和Fas阳性:细胞浆或胞核呈棕黄色的颗粒。按体视学原则和方法:计数各区域阳性染色的细胞数和细胞总数,计算出阳性表达细胞百分率pi(i=1.2.3);由HS=(i+1)pi计算免疫组化评分(imunohistochemical score, HS)其分值范围为0～400, HS<100为阴性。表2反映了A、B、C组Bc1～2和Fas蛋白表达情况。
表2 A、B、C三组Bc1～2、Fas蛋白表达评分(
±s) 组别, 百拇医药
Bc1～2
Fas
正常组
106.2±118.1*
193.3±91.3**
A组
270.0±88.1*
190.4±108.0**
B组
244.3±87.9*
198.2±81.3**
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C组
183.1±100.3*
254.1±80.1**
各组之间比较 *P<0.05 **P<0.05
讨 论
本研究通过两种细胞凋亡检测方法(两种方法虽然凋亡率不一致,但结果趋势相一致,究其原因,可能是荧光原位标记法灵敏度高和/或该法能够显示非神经元凋亡,还有待于进一步探索)证实了在SCI后的脊髓内存在神经元凋亡,而且正常组与A、B、C三组之间凋亡率存在显著性差异(正常
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[11]研究证实,SCI后4天起前角运动神经元逐渐减少,但直到28个月仍有NGFR表达。SCI后运动神经元再表达NGFR反映了损伤后神经细胞对NGF需求增加,以维持伤后NGF依赖性神经元生存。
细胞凋亡是多基因参与的细胞生命过程,是由基因编程序控制的主动死亡过程,故又称为程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。根据凋亡调控基因作用的不同将其分为二类:一类是抑制细胞凋亡的基因如突变型p53、Bc1～2、ced～9等基因;另一类是诱导凋亡的基因如野生型p53、Fas、ced～4Myc等基因[12]。为此,我们选择目前最受关注的与细胞凋亡关系密切的基因Bc1～2及Fas基因进行研究。结果发现:Bc1～2和Fas蛋白表达的顺序分别为A>B>C及C>B>A。目前的研究已证实,Bc1～2产物不是加速细胞分裂,而是抑制细胞凋亡,延长细胞寿命,促进细胞生存,且这种作用与细胞的增殖周期无关[13，14]。Fas基因作为一种跨膜糖蛋白分子,当与抗Fas抗体或Fas配体结合时,可使表达Fas阳性的细胞发生凋亡[15]。因此,Bc1～2及Fas的表达结果,进一步证实了转pSVPoMcat微基因的SC移植对SCI后细胞凋亡有抑制作用,而创伤则诱发细胞凋亡。这为临床运用转基因的SC移植治疗SCI提供了实验依据。
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有关SCI后发生细胞凋亡的机制仍有待于较深入的研究,SCI后早期,神经元C-fos、IEGS等基因表达可促进细胞凋亡或因细胞内Ca2+浓度增高,激发细胞凋亡;或因代谢增强,细胞内蛋白酶激活,细胞质内mRNA表达增强而致凋亡;或因NGF的缺乏而激活细胞内死亡基因表达,促进死亡蛋白合成,继之细胞凋亡等[16～18]。因此,本研究所揭示的pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI后细胞凋亡的抑制作用和创伤诱发细胞凋亡的机制还需要进一步研究。
参考文献
[1]Crowe MJ, Breshahan JC, Shumam SL. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat-Med, 1997, 3∶73-76.
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(收稿:1997-10-27 修回:1998-02-23), 百拇医药