急性坏死性胰腺炎并发感染的机理研究
作者：吴承堂 黎沾良
单位：100036 北京，解放军第三四医院(吴承堂现在第一军医大学南方医院普外科)
关键词：胰腺炎；感染；细菌；质粒
中华外科杂志/980412 【摘要】 目的 观察急性坏死性胰腺炎时肠屏障损伤与细菌移位情况，探讨急性胰腺炎继发感染的机理。 方法 15只犬于肠道内定植PUC18质粒菌JM109后,分对照组(n=7)和急性坏死性胰腺炎组(ANP,n=8)。ANP组经主胰管注入牛磺胆酸钠和胰蛋白酶制作ANP模型。 结果 ANP组较对照组血胰淀粉酶显著升高(P<0.01);尿中乳果糖/甘露醇比值高出对照组2～12倍;空、回、盲肠粘膜及肠内容物中大肠杆菌明显增加(P<0.01),双歧杆菌、乳酸杆菌明显减少(P<0.01、P<0.05)。对照组犬血培养阴性,除2只犬肠系膜淋巴结培养出细菌外,其余脏器培养均阴性。ANP组犬血和脏器细菌培养阳性率均为100%,且每只犬都能检出术前定植于肠道的质粒菌JM109;胰腺腺泡出血、坏死;肠粘膜绒毛破坏;血浆、回肠组织二胺氧化酶活性下降。 结论 ANP时肠粘膜屏障功能严重受损,发生肠道细菌移位,成为继发性胰腺感染的潜在根源。
, http://www.100md.com
The pathogenesis of infection complicated by acute necrotizing pancreatitis:an experimental study Wu Chengtang, Li Zhanliang.Department of General Surgery, 304 th Hospital of People′s Liberation Army, Beijing 100037.
【Abstract】 Objective To observe the injury of gut barrier function and intestinal bacterial translocation following acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate the pathogenesis of infection complicated by ANP. Method Fifteen dogs were colonized with a strain of E.coli JM109 bearing ampicillin-resistant plasmid PUC18, then divided into two groups: control group (n=7) and ANP group (n=8). Acute necrotizing pancreatitis was induced by injection of sodium taurocholate and trypsin into the pancreatic duct. Result In the ANP group, as compared with the control group,serum amylase level increased significantly, the lactulose/mannitol ratio was 2～12 times higher, blood and ileum diamine oxidase activity decreased significantly. E.coli population in intestinal mucosal flora increased, while bifidobacterium and lactobacillus reduced significantly. Bifidobacterium/E.coli ratio was reversed. Morphological study revealed areas of hemorrhage and necrosis in the pancreas and shedding of ileal villi. In the control group, blood cultures were negative, and no organism was found in organs except for mesenteric lymph nodes in two dogs. In the ANP group, blood and organ cultures were positive in all dogs and JM109 could be found uniformly too. Conclusion ANP impaired the gut barrier function, which led to bacterial translocation from the gut to the pancreas and other organs, serving as a primary source of infection secondary to ANP.
, 百拇医药
【Key words】 Pancreatitis Infection Bacteria Plasmids
近年来国外有人将质粒标记技术用于胰腺感染的研究,提示肠道细菌移位是胰腺感染的潜在根源[1]。本研究采用质粒DNA标记等多种方法,观察ANP犬肠屏障功能改变及其与肠道细菌移位的关系,探索胰腺感染的发生机理。
材料与方法
1.示踪菌:携带耐氨苄青霉素PUC18质粒的大
2.示踪菌定植及动物分组:杂种犬15只,体重15±2 kg。采集粪便标本,在含氨苄青霉素培养基上无耐药菌生长者入选。喂服浓度为每毫升109的PUC18质粒菌JM109 2天(每天20 ml/kg)后,连续3天粪便培养,有耐药菌生长为质粒菌已定植肠道。将犬随机分为对照组(n=7)和ANP组(n=8)。
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3.模型制作:硫苯妥钠静脉麻醉下剖开动物腹腔,找到主胰管。对照组仅用手触摸胰腺。ANP组解剖主胰管,将其近肠端结扎,胰腺端置管,以7.8 kPa恒压注入5 %牛磺胆酸钠(0.5 ml/kg)和胰蛋白酶(3000 U/kg)。拔管后关腹。术后第7天处死动物。
4.检测指标:(1)血清胰淀粉酶:碘-淀粉法测定。(2)肠壁通透性检测:术后第1、2、4、7天各给犬灌服5%甘露醇和10%乳果糖混合液100 ml,气相色谱法测定尿乳果糖(L)、甘露醇(M)含量。以L/M比值表示肠壁通透性[2]。(3)肠道内微生态分析:无菌操作剪取回肠、空肠和盲肠组织,漂洗3次后匀浆,接种至E.coli、肠球菌、双歧杆菌、类杆菌和乳酸杆菌5种选择性平板。同时留取盲肠内粪便作需氧及厌氧菌培养。分别于24小时和48小时后进行活菌计数、鉴定。(4)细菌培养:每天抽血2 ml进行细菌培养。并于术后7天处死动物后,剪取肝、胰、脾、肾、肠系膜淋巴结(MLN),匀浆后接种于普通平板及含氨苄青霉素培养基上,24小时后计数。(5)质粒DNA的鉴定:挑取耐氨苄青霉素菌菌落,在LB培养基中剧烈振荡下培养过夜,采用碱裂解法提取细菌质粒DNA[3],经限制性内切酶作琼脂糖凝胶电泳,观察并摄像。(6)病理学检查:取胰腺及回肠组织,作光镜、电镜观察。(7)回肠粘膜绒毛形态学测量:采用CIAS图像分析系统测量绒毛高度、宽度和面积。(8)血浆和回肠组织二胺氧化酶(DAO)活性:分光光度法测定。
, 百拇医药
5.统计学处理:数据采用t检验,结果以
±s表示。
结 果
1.肠壁通透性：结果见表1。
2.血清胰淀粉酶:结果见表2。
3.肠道内微生态:ANP组犬空、回、盲肠粘膜及肠内容物中大肠杆菌较对照组明显增加(P<0.01),双歧杆菌、乳酸杆菌明显减少(P<0.01、P<0.05)。厌氧菌与需氧菌比值(以双歧杆菌/肠杆菌比值表示,B/E)严重倒置(表3)。
4.细菌移位:血及脏器细菌培养发现,对照组只有两只犬在MLN培养出细菌,其他脏器和血培养均阴性。ANP组犬血和脏器细菌培养阳性率均为100%,其中MLN8/8,肝、胰(7/8),肾、肺(6/8),脾4/8,血培养于术后第1、2天为最高(7/8、5/8)。且每只犬都能检出术前定植于肠道的质粒菌JM109,脏器JM109检出率以胰腺为最高(6/8)。移位菌株以需氧菌中的大肠杆菌为主，偶见少量厌氧菌(类杆菌)。
, 百拇医药
5.质粒DNA:证实脏器分离到的耐氨苄青霉素菌与术前定植于肠道的JM109含相同的质粒DNA。
表1 手术后不同时间两组犬尿中乳果糖、甘露醇含量(mg)及L/M比率变化 组别
乳果糖
甘露醇
L/M比值
对照组1d
7.22±1.83
239.57±23.39
0.029±0.006
2d
7.80±1.93
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227.10±32.12
0.035±0.009
4d
6.83±1.11
222.19±26.45
0.031±0.007
7d
8.19±1.79
234.71±16.91
0.033±0.007
ANP组1d
51.14±14.34△
, 百拇医药
172.50±26.92*
0.231±0.073△
2d
81.71±20.95△
209.55±29.34
0.472±0.118△
4d
49.68±19.44△
219.25±39.58
0.251±0.062△
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7d
27.94±8.87△
222.37±34.19
0.105±0.024*
注：与对照组比较* P<0.05，△P<0.01 表2 手术前后不同时间两组血清淀粉酶含量比较(U/L) 时间(d)
血清淀粉酶
P值
对照组
ANP组
术前
, 百拇医药
796.61±82.41
825.50±82.94
<0.01
术后1
816.56±57.82
7363.25±1383.26
<0.01
2
787.26±78.66
7060.75±1135.65
<0.01
4
, 百拇医药
807.68±89.56
4590.25±1312.44
<0.01
7
778.59±80.95
2783.75±893.42
<0.01
6.病理学检查结果:对照组胰腺和肠粘膜大体所见、光镜及电镜观察均未见异常。ANP组胰腺明显肿大,质地变硬,可见黑色坏死灶;肠粘膜可见散在出血点。光镜下胰腺结构模糊不清,腺泡有大片坏死、出血,大量中性白细胞浸润;肠粘膜绒毛顶端上皮脱落,大量炎性细胞浸润,粘膜上皮内有细菌侵入。电镜下胰腺腺泡上皮核膜周围空隙增大,次级溶酶体形成,酶原颗粒减少,粗面内质网扩张,线粒体肿胀、退变,结构模糊;肠上皮微绒毛长短不一,排列不整齐,部分脱落。
, 百拇医药
表3 两组犬肠粘膜及内容物菌落计数(CFUlogn/g)及B/E比值 标本
组别
大肠杆菌
肠球菌
类杆菌
双歧杆菌
乳酸杆菌
B/E
空肠粘膜
对照组
1.91±0.49
1.69±0.79
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2.23±0.92
2.35±0.79
1.83±0.64
1.23±0.53
ANP组
3.42±0.93△
0△
3.75±0.77*
1.75±0.95*
1.13±0.80
0.51±0.46*
, 百拇医药
回肠粘膜
对照组
3.51±0.84
2.05±0.44
3.61±1.06
3.87±1.05
3.79±1.11
1.16±0.82
ANP组
5.80±1.27△
1.17±0.95*
, 百拇医药 4.35±0.98*
2.89±0.86*
1.78±0.79△
0.62±0.68*
盲肠粘膜
对照组
4.74±0.93
2.61±0.77
3.54±0.99
4.89±0.87
3.24±0.84
, 百拇医药
1.03±0.64
ANP组
5.88±1.18*
1.27±1.04*
4.01±1.10
2.70±0.88△
2.81±0.73*
0.46±0.44*
盲肠内容物
对照组
4.86±0.64
, 百拇医药
3.50±0.85
4.81±0.95
5.15±1.44
4.25±0.81
1.16±0.57
ANP组
7.43±1.19△
2.27±1.49*
4.72±1.13
3.06±0.89△
2.67±0.61△
, 百拇医药
0.43±0.32*
注：与对照组比较*P<0.05,△P<0.01 7.回肠粘膜绒毛测量:结果见表4。
8.DAO活性:两组犬血浆DAO活性见表5。ANP组犬回肠组织DAO活性(2.48±0.77 U/ml)明显低于对照组(7.26±1.25 U/ml)。
表4 两组犬肠粘膜绒毛高度、宽度和面积 组别
高度(μm)
宽度(μm)
面积(μm2)
对照组
, 百拇医药 436±21
122±14
49874±1631
ANP组
318±34
96±23
30472±2164
注：与对照组比较,* P<0.05；△P<0.01 表5 术后不同时间犬血浆DAO活性测定结果(U/ml) 时间(d)
血浆DAO(U/ml)
P值
对照组
, 百拇医药
ANP组
1
0.66±0.11
1.55±0.35
<0.01
2
0.74±0.18
1.16±0.27
<0.01
4
0.81±0.13
0.38±0.04
, 百拇医药 <0.01
7
0.77±0.14
0.17±0.08
<0.01
讨论
一、ANP时肠屏障功能严重受损的表现
1.肠壁组织形态学变化:实验证实,ANP后肠壁粘膜萎缩,微绒毛坏死脱落,使细菌易进入肠道。
2.肠壁通透性增加:尿中L/M的比率可准确地反映肠壁通透性的改变。我们的研究发现,ANP组的L/M比率高出对照组2～12倍,发病后第2天最为显著,而血培养阳性结果亦以发病后第1、2天为最高,提示ANP发病后48小时内肠粘膜屏障即遭到严重破坏,肠通透性增高,肠道细菌迁移入血的概率大增。
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3.DAO活性下降:肠粘膜和外周血中DAO活性能可靠地反映肠上皮细胞成熟度和完整性,其变化可反映肠粘膜屏障的功能状态。实验发现,ANP组犬术后第1、2天血浆DAO活性增加,而第4、7天以后则显著低于对照组。提示ANP早期由于肠粘膜上皮破坏,致DAO大量释放入血,可引起血中DAO活性短暂增高,随后下降则是DAO耗竭的结果,反映了肠屏障功能处于低下状态。
4.生物屏障受损:通常情况下，肠道中的常驻菌与肠粘膜上皮细胞上的特异性受体结合,形成组分相当固定的正常菌膜结构,可抵御有害细菌对机体的侵袭。ANP时血液动力学改变及炎症反应全面削弱了肠屏障功能,肠动力下降。我们的研究发现,ANP犬的肠道菌群出现明显紊乱,表现为粘膜菌群和肠内容物中的大肠杆菌及其它条件致病菌-类杆菌计数比对照组明显增加,而双歧杆菌及乳酸杆菌计数则明显下降,即需氧菌增加而厌氧菌减少,导致定植抗力下降。由于肠蠕动净化作用削弱,优势繁殖的革蓝氏阴性菌接近肠上皮细胞表面的时间延长,细菌穿越粘膜屏障进入组织、淋巴液和血流移位到其它脏器的机会也随之增加。大肠杆菌的优势生长,还将产生大量内毒素,成为ANP时内毒素血症的主要原因。
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二、ANP时肠屏障功能受损导致肠道细菌移位
正常肠粘膜屏障可阻止肠道细菌穿透粘膜而发生移位。ANP时,由于继发的肠道缺血、缺氧改变及缺血-再灌注损伤和炎性因子等一系列因素,造成肠粘膜屏障损害,肠通透性异常升高，DAO活性下降,肠蠕动减弱甚至停止,肠道微生态紊乱,加上ANP时全身和肠道的免疫功能下降,使得肠道细菌容易突破受损的粘膜上皮,并越过MLN移位到其它远处器官。本研究发现,对照组血、肝、脾、肾等脏器(除MLN)细菌培养均为阴性,而ANP组犬的相应脏器均能培养出细菌。ANP组逐日血培养全部动物都有阳性结果,以发病后48小时内阳性率最高。移位细菌以需氧菌中的大肠杆菌为主。值得注意的是,在ANP组每只犬均在受检的1～多个器官内检出质粒菌JM109,经质粒DNA提取和限制性内切酶指纹图谱分析,证实这些移位的菌株与事先人工定植于肠道的质粒菌同出一源。从分子水平上表明,ANP时移位细菌确实来自肠道。在一般情况下，少量细菌移位进入脏器和血，并不一定引起胰腺感染，但它们是危险的潜在感染源。ANP时发生细菌移位,受炎症严重困扰和打击的胰腺本身,自然成为细菌居留和繁殖的理想场所,从而发展成胰腺感染。因此我们认为，肠道细菌的移位是ANP后并发感染的主要原因,采取有效措施维护肠粘膜屏障功能,应是预防和治疗ANP后继发感染的重要原则。
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志谢 感谢军事医学科学院沈倍奋院士，解放军三四医院创伤研究室熊德鑫、祝小枫、陆连荣、焦华波、王亚平
参考文献
1Kazantsev GB, Hechi DW, Rao R, et al. Plasmid labeling confirms bacterial translocation in pancreatitis. Am J Surg, 1994, 67:201-207.
2吴承堂,黎沾良,祝小枫，等. 两种糖分子探针用于测定重症胰腺炎时肠通透性的改变.中华实验外科杂志, 1997, 14:195-197.
3Birnboim HC,Doli J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res, 1979,7:1513-1516., 百拇医药
单位：100036 北京，解放军第三四医院(吴承堂现在第一军医大学南方医院普外科)
关键词：胰腺炎；感染；细菌；质粒
中华外科杂志/980412 【摘要】 目的 观察急性坏死性胰腺炎时肠屏障损伤与细菌移位情况，探讨急性胰腺炎继发感染的机理。 方法 15只犬于肠道内定植PUC18质粒菌JM109后,分对照组(n=7)和急性坏死性胰腺炎组(ANP,n=8)。ANP组经主胰管注入牛磺胆酸钠和胰蛋白酶制作ANP模型。 结果 ANP组较对照组血胰淀粉酶显著升高(P<0.01);尿中乳果糖/甘露醇比值高出对照组2～12倍;空、回、盲肠粘膜及肠内容物中大肠杆菌明显增加(P<0.01),双歧杆菌、乳酸杆菌明显减少(P<0.01、P<0.05)。对照组犬血培养阴性,除2只犬肠系膜淋巴结培养出细菌外,其余脏器培养均阴性。ANP组犬血和脏器细菌培养阳性率均为100%,且每只犬都能检出术前定植于肠道的质粒菌JM109;胰腺腺泡出血、坏死;肠粘膜绒毛破坏;血浆、回肠组织二胺氧化酶活性下降。 结论 ANP时肠粘膜屏障功能严重受损,发生肠道细菌移位,成为继发性胰腺感染的潜在根源。
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The pathogenesis of infection complicated by acute necrotizing pancreatitis:an experimental study Wu Chengtang, Li Zhanliang.Department of General Surgery, 304 th Hospital of People′s Liberation Army, Beijing 100037.
【Abstract】 Objective To observe the injury of gut barrier function and intestinal bacterial translocation following acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate the pathogenesis of infection complicated by ANP. Method Fifteen dogs were colonized with a strain of E.coli JM109 bearing ampicillin-resistant plasmid PUC18, then divided into two groups: control group (n=7) and ANP group (n=8). Acute necrotizing pancreatitis was induced by injection of sodium taurocholate and trypsin into the pancreatic duct. Result In the ANP group, as compared with the control group,serum amylase level increased significantly, the lactulose/mannitol ratio was 2～12 times higher, blood and ileum diamine oxidase activity decreased significantly. E.coli population in intestinal mucosal flora increased, while bifidobacterium and lactobacillus reduced significantly. Bifidobacterium/E.coli ratio was reversed. Morphological study revealed areas of hemorrhage and necrosis in the pancreas and shedding of ileal villi. In the control group, blood cultures were negative, and no organism was found in organs except for mesenteric lymph nodes in two dogs. In the ANP group, blood and organ cultures were positive in all dogs and JM109 could be found uniformly too. Conclusion ANP impaired the gut barrier function, which led to bacterial translocation from the gut to the pancreas and other organs, serving as a primary source of infection secondary to ANP.
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【Key words】 Pancreatitis Infection Bacteria Plasmids
近年来国外有人将质粒标记技术用于胰腺感染的研究,提示肠道细菌移位是胰腺感染的潜在根源[1]。本研究采用质粒DNA标记等多种方法,观察ANP犬肠屏障功能改变及其与肠道细菌移位的关系,探索胰腺感染的发生机理。
材料与方法
1.示踪菌:携带耐氨苄青霉素PUC18质粒的大
2.示踪菌定植及动物分组:杂种犬15只,体重15±2 kg。采集粪便标本,在含氨苄青霉素培养基上无耐药菌生长者入选。喂服浓度为每毫升109的PUC18质粒菌JM109 2天(每天20 ml/kg)后,连续3天粪便培养,有耐药菌生长为质粒菌已定植肠道。将犬随机分为对照组(n=7)和ANP组(n=8)。
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3.模型制作:硫苯妥钠静脉麻醉下剖开动物腹腔,找到主胰管。对照组仅用手触摸胰腺。ANP组解剖主胰管,将其近肠端结扎,胰腺端置管,以7.8 kPa恒压注入5 %牛磺胆酸钠(0.5 ml/kg)和胰蛋白酶(3000 U/kg)。拔管后关腹。术后第7天处死动物。
4.检测指标:(1)血清胰淀粉酶:碘-淀粉法测定。(2)肠壁通透性检测:术后第1、2、4、7天各给犬灌服5%甘露醇和10%乳果糖混合液100 ml,气相色谱法测定尿乳果糖(L)、甘露醇(M)含量。以L/M比值表示肠壁通透性[2]。(3)肠道内微生态分析:无菌操作剪取回肠、空肠和盲肠组织,漂洗3次后匀浆,接种至E.coli、肠球菌、双歧杆菌、类杆菌和乳酸杆菌5种选择性平板。同时留取盲肠内粪便作需氧及厌氧菌培养。分别于24小时和48小时后进行活菌计数、鉴定。(4)细菌培养:每天抽血2 ml进行细菌培养。并于术后7天处死动物后,剪取肝、胰、脾、肾、肠系膜淋巴结(MLN),匀浆后接种于普通平板及含氨苄青霉素培养基上,24小时后计数。(5)质粒DNA的鉴定:挑取耐氨苄青霉素菌菌落,在LB培养基中剧烈振荡下培养过夜,采用碱裂解法提取细菌质粒DNA[3],经限制性内切酶作琼脂糖凝胶电泳,观察并摄像。(6)病理学检查:取胰腺及回肠组织,作光镜、电镜观察。(7)回肠粘膜绒毛形态学测量:采用CIAS图像分析系统测量绒毛高度、宽度和面积。(8)血浆和回肠组织二胺氧化酶(DAO)活性:分光光度法测定。
, 百拇医药
5.统计学处理:数据采用t检验,结果以
±s表示。结 果
1.肠壁通透性：结果见表1。
2.血清胰淀粉酶:结果见表2。
3.肠道内微生态:ANP组犬空、回、盲肠粘膜及肠内容物中大肠杆菌较对照组明显增加(P<0.01),双歧杆菌、乳酸杆菌明显减少(P<0.01、P<0.05)。厌氧菌与需氧菌比值(以双歧杆菌/肠杆菌比值表示,B/E)严重倒置(表3)。
4.细菌移位:血及脏器细菌培养发现,对照组只有两只犬在MLN培养出细菌,其他脏器和血培养均阴性。ANP组犬血和脏器细菌培养阳性率均为100%,其中MLN8/8,肝、胰(7/8),肾、肺(6/8),脾4/8,血培养于术后第1、2天为最高(7/8、5/8)。且每只犬都能检出术前定植于肠道的质粒菌JM109,脏器JM109检出率以胰腺为最高(6/8)。移位菌株以需氧菌中的大肠杆菌为主，偶见少量厌氧菌(类杆菌)。
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5.质粒DNA:证实脏器分离到的耐氨苄青霉素菌与术前定植于肠道的JM109含相同的质粒DNA。
表1 手术后不同时间两组犬尿中乳果糖、甘露醇含量(mg)及L/M比率变化 组别
乳果糖
甘露醇
L/M比值
对照组1d
7.22±1.83
239.57±23.39
0.029±0.006
2d
7.80±1.93
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227.10±32.12
0.035±0.009
4d
6.83±1.11
222.19±26.45
0.031±0.007
7d
8.19±1.79
234.71±16.91
0.033±0.007
ANP组1d
51.14±14.34△
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172.50±26.92*
0.231±0.073△
2d
81.71±20.95△
209.55±29.34
0.472±0.118△
4d
49.68±19.44△
219.25±39.58
0.251±0.062△
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7d
27.94±8.87△
222.37±34.19
0.105±0.024*
注：与对照组比较* P<0.05，△P<0.01 表2 手术前后不同时间两组血清淀粉酶含量比较(U/L) 时间(d)
血清淀粉酶
P值
对照组
ANP组
术前
, 百拇医药
796.61±82.41
825.50±82.94
<0.01
术后1
816.56±57.82
7363.25±1383.26
<0.01
2
787.26±78.66
7060.75±1135.65
<0.01
4
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807.68±89.56
4590.25±1312.44
<0.01
7
778.59±80.95
2783.75±893.42
<0.01
6.病理学检查结果:对照组胰腺和肠粘膜大体所见、光镜及电镜观察均未见异常。ANP组胰腺明显肿大,质地变硬,可见黑色坏死灶;肠粘膜可见散在出血点。光镜下胰腺结构模糊不清,腺泡有大片坏死、出血,大量中性白细胞浸润;肠粘膜绒毛顶端上皮脱落,大量炎性细胞浸润,粘膜上皮内有细菌侵入。电镜下胰腺腺泡上皮核膜周围空隙增大,次级溶酶体形成,酶原颗粒减少,粗面内质网扩张,线粒体肿胀、退变,结构模糊;肠上皮微绒毛长短不一,排列不整齐,部分脱落。
, 百拇医药
表3 两组犬肠粘膜及内容物菌落计数(CFUlogn/g)及B/E比值 标本
组别
大肠杆菌
肠球菌
类杆菌
双歧杆菌
乳酸杆菌
B/E
空肠粘膜
对照组
1.91±0.49
1.69±0.79
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2.23±0.92
2.35±0.79
1.83±0.64
1.23±0.53
ANP组
3.42±0.93△
0△
3.75±0.77*
1.75±0.95*
1.13±0.80
0.51±0.46*
, 百拇医药
回肠粘膜
对照组
3.51±0.84
2.05±0.44
3.61±1.06
3.87±1.05
3.79±1.11
1.16±0.82
ANP组
5.80±1.27△
1.17±0.95*
, 百拇医药 4.35±0.98*
2.89±0.86*
1.78±0.79△
0.62±0.68*
盲肠粘膜
对照组
4.74±0.93
2.61±0.77
3.54±0.99
4.89±0.87
3.24±0.84
, 百拇医药
1.03±0.64
ANP组
5.88±1.18*
1.27±1.04*
4.01±1.10
2.70±0.88△
2.81±0.73*
0.46±0.44*
盲肠内容物
对照组
4.86±0.64
, 百拇医药
3.50±0.85
4.81±0.95
5.15±1.44
4.25±0.81
1.16±0.57
ANP组
7.43±1.19△
2.27±1.49*
4.72±1.13
3.06±0.89△
2.67±0.61△
, 百拇医药
0.43±0.32*
注：与对照组比较*P<0.05,△P<0.01 7.回肠粘膜绒毛测量:结果见表4。
8.DAO活性:两组犬血浆DAO活性见表5。ANP组犬回肠组织DAO活性(2.48±0.77 U/ml)明显低于对照组(7.26±1.25 U/ml)。
表4 两组犬肠粘膜绒毛高度、宽度和面积 组别
高度(μm)
宽度(μm)
面积(μm2)
对照组
, 百拇医药 436±21
122±14
49874±1631
ANP组
318±34
96±23
30472±2164
注：与对照组比较,* P<0.05；△P<0.01 表5 术后不同时间犬血浆DAO活性测定结果(U/ml) 时间(d)
血浆DAO(U/ml)
P值
对照组
, 百拇医药
ANP组
1
0.66±0.11
1.55±0.35
<0.01
2
0.74±0.18
1.16±0.27
<0.01
4
0.81±0.13
0.38±0.04
, 百拇医药 <0.01
7
0.77±0.14
0.17±0.08
<0.01
讨论
一、ANP时肠屏障功能严重受损的表现
1.肠壁组织形态学变化:实验证实,ANP后肠壁粘膜萎缩,微绒毛坏死脱落,使细菌易进入肠道。
2.肠壁通透性增加:尿中L/M的比率可准确地反映肠壁通透性的改变。我们的研究发现,ANP组的L/M比率高出对照组2～12倍,发病后第2天最为显著,而血培养阳性结果亦以发病后第1、2天为最高,提示ANP发病后48小时内肠粘膜屏障即遭到严重破坏,肠通透性增高,肠道细菌迁移入血的概率大增。
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3.DAO活性下降:肠粘膜和外周血中DAO活性能可靠地反映肠上皮细胞成熟度和完整性,其变化可反映肠粘膜屏障的功能状态。实验发现,ANP组犬术后第1、2天血浆DAO活性增加,而第4、7天以后则显著低于对照组。提示ANP早期由于肠粘膜上皮破坏,致DAO大量释放入血,可引起血中DAO活性短暂增高,随后下降则是DAO耗竭的结果,反映了肠屏障功能处于低下状态。
4.生物屏障受损:通常情况下，肠道中的常驻菌与肠粘膜上皮细胞上的特异性受体结合,形成组分相当固定的正常菌膜结构,可抵御有害细菌对机体的侵袭。ANP时血液动力学改变及炎症反应全面削弱了肠屏障功能,肠动力下降。我们的研究发现,ANP犬的肠道菌群出现明显紊乱,表现为粘膜菌群和肠内容物中的大肠杆菌及其它条件致病菌-类杆菌计数比对照组明显增加,而双歧杆菌及乳酸杆菌计数则明显下降,即需氧菌增加而厌氧菌减少,导致定植抗力下降。由于肠蠕动净化作用削弱,优势繁殖的革蓝氏阴性菌接近肠上皮细胞表面的时间延长,细菌穿越粘膜屏障进入组织、淋巴液和血流移位到其它脏器的机会也随之增加。大肠杆菌的优势生长,还将产生大量内毒素,成为ANP时内毒素血症的主要原因。
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二、ANP时肠屏障功能受损导致肠道细菌移位
正常肠粘膜屏障可阻止肠道细菌穿透粘膜而发生移位。ANP时,由于继发的肠道缺血、缺氧改变及缺血-再灌注损伤和炎性因子等一系列因素,造成肠粘膜屏障损害,肠通透性异常升高，DAO活性下降,肠蠕动减弱甚至停止,肠道微生态紊乱,加上ANP时全身和肠道的免疫功能下降,使得肠道细菌容易突破受损的粘膜上皮,并越过MLN移位到其它远处器官。本研究发现,对照组血、肝、脾、肾等脏器(除MLN)细菌培养均为阴性,而ANP组犬的相应脏器均能培养出细菌。ANP组逐日血培养全部动物都有阳性结果,以发病后48小时内阳性率最高。移位细菌以需氧菌中的大肠杆菌为主。值得注意的是,在ANP组每只犬均在受检的1～多个器官内检出质粒菌JM109,经质粒DNA提取和限制性内切酶指纹图谱分析,证实这些移位的菌株与事先人工定植于肠道的质粒菌同出一源。从分子水平上表明,ANP时移位细菌确实来自肠道。在一般情况下，少量细菌移位进入脏器和血，并不一定引起胰腺感染，但它们是危险的潜在感染源。ANP时发生细菌移位,受炎症严重困扰和打击的胰腺本身,自然成为细菌居留和繁殖的理想场所,从而发展成胰腺感染。因此我们认为，肠道细菌的移位是ANP后并发感染的主要原因,采取有效措施维护肠粘膜屏障功能,应是预防和治疗ANP后继发感染的重要原则。
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志谢 感谢军事医学科学院沈倍奋院士，解放军三四医院创伤研究室熊德鑫、祝小枫、陆连荣、焦华波、王亚平
参考文献
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2吴承堂,黎沾良,祝小枫，等. 两种糖分子探针用于测定重症胰腺炎时肠通透性的改变.中华实验外科杂志, 1997, 14:195-197.
3Birnboim HC,Doli J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res, 1979,7:1513-1516., 百拇医药