原发性肝癌患者红细胞CR1数量基因型及活性的检测
作者：赵书平△ 郭 峰 张乐之 叶芳耘 张俊洁
单位：
关键词：补体；受体；红细胞；聚合酶链反应；酶联免疫吸附实验；肝肿瘤
第二军医大学学报980409 摘要 目的: 了解在体外培养的瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞整合素表达情况。方法: 应用β1及α1～α4整合素单克隆抗体对成纤维细胞进行整合素原位ELISA检测,观察不同培养时期瘢痕成纤维细胞的β1及α1～α4整合素表达水平, 辅以正常皮肤成纤维细胞做对照。结果: 培养的瘢痕成纤维细胞整合素各亚型表达均明显高于同期培养的正常皮肤成纤维细胞表达水平(P<0.01);细胞经较长时间培养后,整合素的表达均有所下降,但就下降幅度而言,瘢痕成纤维细胞为5.94%～18.26%,平均为9.75%;而正常成纤维细胞为26.19%～46.84%,平均为32.46%;两者有显著性差异(P<0.01)。结论: 瘢痕成纤维细胞具有比正常皮肤成纤维细胞更强的整合素表达功能,从而对瘢痕组织增生挛缩的发生、发展有着重要意义。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R619.602
Expression of integrins in hypertrophic scar-derived fibroblasts
Zhao Yede, He Qinglian, Ji Xuhuai, Xu Guoming (Department of Plastic Surgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To realize expression levels of integrins in hypertrophic scar-derived and normal skin-derived fibroblasts. Methods: Using anti-β1, α1, α2, α3 and α4 integrin McAbs, the expression of integrins was detected in hypertrophic scar-derived and normal skin-derived fibroblasts of passage 5 and 15 by ELISA technique. Results: The hypertrophic scar-derived fibroblasts possessed higher expression level of integrin subunits than normal skin-derived fibroblasts. After cells were cultured for long time, the decreased range of integrin expression in hypertrophic scar-derived fibrolasts was 5.94%～18.26%, and that in normal skin-derived fibroblasts was 26.19%～46.84%. There was a statistical difference between them (P<0.01). Conclusion: Overexpression of integrins in the hypertrophic scar fibroblasts may play an important role in the hypertrophic scar forming and be contemporaneous with tissue contracture.
, 百拇医药
Key words hypertrophic scar; fibroblast; integrin
增生性瘢痕作为伤口上皮化愈合后组织继续增生的病理改变,其发生、发展与瘢痕成纤维细胞生物学功能异常有着密切的内在联系。越来越多的研究表明,整合素作为细胞膜上细胞外间质的结合受体,它在调节细胞贴壁、迁移、增殖及收缩等功能方面具有十分重要的作用[1,2],但有关瘢痕成纤维细胞整合素的表达情况尚无文献报道。为此,我们利用β1,α1,α2,α3及α4整合素的单克隆抗体(McAbs),通过原位ELISA技术检测在体外不同培养时期的瘢痕成纤维细胞整合素表达水平,以进一步探讨瘢痕成纤维细胞的异常生物学功能。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 鼠抗人β1,α1,α2,α3及α4整合素McAbs分别由美国Old博士、Woods博士和Hemler博士惠赠;辣根酶标记的羊抗鼠IgG(Zymed公司产品)购于北京中山生物技术有限公司; DMEM培养基(Gibco公司产品)及小牛血清购于上海华美生物技术有限公司。
, 百拇医药
1.2 组织标本 增生性瘢痕组织及正常皮肤组织(各6例)均取自第二军医大学长海医院整形外科住院治疗病人,年龄17～40岁。病人在取标本前没有长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史,不伴肿瘤及其他严重疾患。
1.3 成纤维细胞培养 将手术切取的增生性瘢痕及正常皮肤组织去皮下脂肪,用0.01%苯扎溴铵(新洁尔灭)浸洗10 min, PBS洗3次。把增生性瘢痕及正常皮肤组织剪成细小碎块,接种于培养瓶内,加少量10%小牛血清的DMEM培养基, 37℃ 5% CO2静止培养3 d后补充少量培养剂。隔2 d换液,见有细胞从组织块爬出生长后每天换液,传代。
1.4 整合素原位ELISA检测[3] 选择第5, 15代培养细胞为实验对象, 用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞, 调整细胞浓度至106个/ml, 每孔100 μl接种于96孔培养板内。24 h后细胞融合,去培养剂, PBS洗; 用2%多聚甲醛固定10 min, 与0.3%过氧化氢溶液反应5 min, PBS洗; 与0.1% Triton X-100/PBS 4℃作用3 min后, 进一步分别与5%小牛血清/PBS(37℃, 20 min)、 整合素McAb(37℃, 1 h), 5%小牛血清PBS稀释的HRP-羊抗鼠IgG (37℃, 1 h)反应; PBS清洗后加入邻苯二胺(OPD)底物液100 μl, 作用25 min后,用50 μl 1mol/L硫酸中止反应。 ELISA reader上读取492 nm的D值。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 初代成纤维细胞培养结果 在体外相同培养条件下, 将剪碎的瘢痕及正常皮肤细小组织块放置培养瓶内, 培养1周时均可见少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出, 2周后细胞在组织块周围呈晕状分布, 此后细胞开始向外旺盛扩散、 增殖。 显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态, 发现细胞均呈细小梭形状, 两者未见明显差异。
2.2 整合素表达情况 为了客观反映不同组织来源、不同培养代数之间成纤维细胞整合素的表达水平,我们采用一致培养条件,包括血清和培养剂。另外,早期培养的第5代细胞固定后于-20℃低温保存,待第15代细胞准备完毕时同时进行原位ELISA检测。实验结果表明: (1)培养的第5代和第15代瘢痕成纤维细胞整合素各亚型表达,均明显高于同期的正常皮肤成纤维细胞表达水平(表1); (2)细胞从第5代培养至第15代时,瘢痕或正常皮肤的成纤维细胞,其整合素的表达均有所下降,但就下降幅度而言,瘢痕成纤维细胞为5.94%～18.26%,而正常成纤维细胞则为26.19%～46.84%,两者有显著性差异,如表2所示。
, 百拇医药
表 1 瘢痕及正常皮肤成纤维细胞整合素表达水平
Tab 1 Expression of integrins in NSFb and HSFb(n=6,
) Integrins
NSFb
HSFb
Passage 5
Passage 15
Passage 5
Passage 15
β1
, 百拇医药
1.86±0.06
1.34±0.03
2.19±0.03**
2.06±0.02**
α1
1.26±0.07
0.93±0.06
1.90±0.08**
1.78±0.05**
α2
, 百拇医药
1.64±0.03
1.19±0.04
2.01±0.04**
1.87±0.04**
α3
1.30±0.06
0.86±0.03
1.95±0.01**
1.73±0.02**
α4
, 百拇医药
0.79±0.03
0.42±0.01
1.15±0.01**
0.94±0.02**
NSFb: normal skin-derived fibroblasts; HSFb: hypertrophic scar-derived fibroblasts;**P<0.01 vs NSFb of same passage
表 2 第5至第15代成纤维细胞整合素表达降低幅度
Tab 2 The decreased range of integrin expression in
, http://www.100md.com
fibroblasts from passage 5 to 15(n=6, %) Integrin
NSFb
HSFb
β1
27.96
5.94**
α1
26.19
6.32**
α2
, 百拇医药 27.44
6.97**
α3
33.85
11.28**
α4
46.84
18.26**
NSFb: normal skin-derived fibroblasts; HSFb: hypertrophic scar-derived fibroblasts; **P<0.01 vs NSFb
, 百拇医药
3 讨 论
整合素粘附分子是细胞膜上的跨膜蛋白。它由α和β两条肽链组成,每条肽链都有10多种亚型,不同亚型的β和α链组成不同的整合素粘附分子;但每一种都具有结合一种或多种细胞外间质的能力,其中β1α1,β1α2及β1α3整合素粘附分子能与胶原蛋白、层粘连蛋白(Laminins,LN)结合,β1α3和β1α4整合素粘附分子则能与纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)结合;而整合素分子的膜内区常常与细胞骨架成分接触。在功能上,整合素既是细胞与细胞外间质之间的主要联系桥梁,亦是细胞沟通内外信息的重要渠道;细胞膜上整合素的表达水平一方面影响着细胞形态、增殖、分化、迁移及某些大分子成分合成,另一方面对组织保持结构完整及结缔组织收缩有着重要意义[1,2,4]。
, 百拇医药
增生性瘢痕作为伤口上皮化以后组织内以成纤维细胞继续旺盛增殖、细胞外间质(胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等)过度沉积为主要特征的病理学疾患,瘢痕成纤维细胞的许多异常生物学活性已为以往的实验所证实。研究发现,瘢痕成纤维细胞在体外合成纤维粘连蛋白量是正常成纤维细胞的4倍,合成胶原量是正常细胞的3倍[5,6],蛋白多糖合成及α平滑肌肌动蛋白表达也明显增加[7,8]。我们通过对不同培养时期的瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞β1,α1,α2,α3及α4整合素表达检测,进一步证实瘢痕成纤维细胞与同期培养的正常皮肤成纤维细胞相比,不但具有更强的整合素表达功能,而且长时间培养后各亚型整合素表达下降幅度亦明显低于正常成纤维细胞。
鉴于整合素粘附分子在结缔组织构建中的特殊作用,我们认为瘢痕成纤维细胞的这种高表达整合素特性对瘢痕组织的增生、挛缩有着重要意义。其作用可能有以下几方面:(1)促进细胞外间质对成纤维细胞活性功能调节;(2)使成纤维细胞与胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白之间的联系更为紧密,导致瘢痕组织结构致密、质地变硬及组织挛缩;(3)协同瘢痕组织中某些细胞因子作用[9,10]。因此,设法抑制或降低瘢痕成纤维细胞膜上整合素的过度表达,可能是临床上控制瘢痕增生挛缩、促进瘢痕软化的有效途径。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 傅诚强. 粘附分子作为疾病的决定性因子. 国外医学外科学分册,1997,24(1):31
2 冯信忠, 徐文严. 细胞粘附分子与皮肤病理. 国外医学皮肤病学分册, 1997,23(2):109
3 Swerlick RA, Lee KH, Li LJ, et al. Regulation of vascular cell adhesion molecule 1 on human dermal microvascular endothelial cell. J Immunol, 1992,149(2):698
4 Juliano RL, Haskill S. Signal transduction from the extracellular matrix. J Cell Biol, 1993,120(3):577
, 百拇医药
5 Kischer CW, Wagner HNJr, Pindur J, et al. Increased fibronec- tin production by cell lines from hypertrophic scar and keloid. Connect Tissue Res, 1989,23(4):279
6 Younai S, Nichter LS, Wellisz T, et al. Modulation of collagen synthesis by transforming growth factor-beta in keloid and hypertrophic scar fibroblasts. Ann Plast Surg, 1994,33(2):148
7 Scott PG, Dodd CM, Tredget EE, et al. Chemical characterization and quantification of proteoglycans in human post-burn hypertrophic and mature scars. Clin Sci Colch, 1996,90(5):417
, http://www.100md.com
8 Schmitt-Graff A, Desmouliere A, Gabbiani G. Heterogeneity of myofibroblast phenotypic features: an example of fibroblastic cell plasticity. Virchows Arch, 1994,425(1):3
9 Stephens P, Genever PG, Wood EJ, et al. Integrin receptor involvement in actin cable formation in an in vitro model of events associated with wound contraction. Int J Biochem Cell Biol, 1997,29(1):121
10 Miyamoto S, Teramoto H, Gutkind JS, et al. Integrins can collaborate with growth factors for phosphorylation of receptor tyrosine kinases and MAP kinase activation: roles of integrin aggregation and occupancy of receptors. J Cell Biol, 1996,135(6 Pt 1):1633
(1997-11-20收稿, 1998-06-17修回)
李艳红，女，1952年2月生，副主任技师, http://www.100md.com
单位：
关键词：补体；受体；红细胞；聚合酶链反应；酶联免疫吸附实验；肝肿瘤
第二军医大学学报980409 摘要 目的: 了解在体外培养的瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞整合素表达情况。方法: 应用β1及α1～α4整合素单克隆抗体对成纤维细胞进行整合素原位ELISA检测,观察不同培养时期瘢痕成纤维细胞的β1及α1～α4整合素表达水平, 辅以正常皮肤成纤维细胞做对照。结果: 培养的瘢痕成纤维细胞整合素各亚型表达均明显高于同期培养的正常皮肤成纤维细胞表达水平(P<0.01);细胞经较长时间培养后,整合素的表达均有所下降,但就下降幅度而言,瘢痕成纤维细胞为5.94%～18.26%,平均为9.75%;而正常成纤维细胞为26.19%～46.84%,平均为32.46%;两者有显著性差异(P<0.01)。结论: 瘢痕成纤维细胞具有比正常皮肤成纤维细胞更强的整合素表达功能,从而对瘢痕组织增生挛缩的发生、发展有着重要意义。
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中国图书资料分类法分类号 R619.602
Expression of integrins in hypertrophic scar-derived fibroblasts
Zhao Yede, He Qinglian, Ji Xuhuai, Xu Guoming (Department of Plastic Surgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To realize expression levels of integrins in hypertrophic scar-derived and normal skin-derived fibroblasts. Methods: Using anti-β1, α1, α2, α3 and α4 integrin McAbs, the expression of integrins was detected in hypertrophic scar-derived and normal skin-derived fibroblasts of passage 5 and 15 by ELISA technique. Results: The hypertrophic scar-derived fibroblasts possessed higher expression level of integrin subunits than normal skin-derived fibroblasts. After cells were cultured for long time, the decreased range of integrin expression in hypertrophic scar-derived fibrolasts was 5.94%～18.26%, and that in normal skin-derived fibroblasts was 26.19%～46.84%. There was a statistical difference between them (P<0.01). Conclusion: Overexpression of integrins in the hypertrophic scar fibroblasts may play an important role in the hypertrophic scar forming and be contemporaneous with tissue contracture.
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Key words hypertrophic scar; fibroblast; integrin
增生性瘢痕作为伤口上皮化愈合后组织继续增生的病理改变,其发生、发展与瘢痕成纤维细胞生物学功能异常有着密切的内在联系。越来越多的研究表明,整合素作为细胞膜上细胞外间质的结合受体,它在调节细胞贴壁、迁移、增殖及收缩等功能方面具有十分重要的作用[1,2],但有关瘢痕成纤维细胞整合素的表达情况尚无文献报道。为此,我们利用β1,α1,α2,α3及α4整合素的单克隆抗体(McAbs),通过原位ELISA技术检测在体外不同培养时期的瘢痕成纤维细胞整合素表达水平,以进一步探讨瘢痕成纤维细胞的异常生物学功能。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 鼠抗人β1,α1,α2,α3及α4整合素McAbs分别由美国Old博士、Woods博士和Hemler博士惠赠;辣根酶标记的羊抗鼠IgG(Zymed公司产品)购于北京中山生物技术有限公司; DMEM培养基(Gibco公司产品)及小牛血清购于上海华美生物技术有限公司。
, 百拇医药
1.2 组织标本 增生性瘢痕组织及正常皮肤组织(各6例)均取自第二军医大学长海医院整形外科住院治疗病人,年龄17～40岁。病人在取标本前没有长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史,不伴肿瘤及其他严重疾患。
1.3 成纤维细胞培养 将手术切取的增生性瘢痕及正常皮肤组织去皮下脂肪,用0.01%苯扎溴铵(新洁尔灭)浸洗10 min, PBS洗3次。把增生性瘢痕及正常皮肤组织剪成细小碎块,接种于培养瓶内,加少量10%小牛血清的DMEM培养基, 37℃ 5% CO2静止培养3 d后补充少量培养剂。隔2 d换液,见有细胞从组织块爬出生长后每天换液,传代。
1.4 整合素原位ELISA检测[3] 选择第5, 15代培养细胞为实验对象, 用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞, 调整细胞浓度至106个/ml, 每孔100 μl接种于96孔培养板内。24 h后细胞融合,去培养剂, PBS洗; 用2%多聚甲醛固定10 min, 与0.3%过氧化氢溶液反应5 min, PBS洗; 与0.1% Triton X-100/PBS 4℃作用3 min后, 进一步分别与5%小牛血清/PBS(37℃, 20 min)、 整合素McAb(37℃, 1 h), 5%小牛血清PBS稀释的HRP-羊抗鼠IgG (37℃, 1 h)反应; PBS清洗后加入邻苯二胺(OPD)底物液100 μl, 作用25 min后,用50 μl 1mol/L硫酸中止反应。 ELISA reader上读取492 nm的D值。
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2 结 果
2.1 初代成纤维细胞培养结果 在体外相同培养条件下, 将剪碎的瘢痕及正常皮肤细小组织块放置培养瓶内, 培养1周时均可见少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出, 2周后细胞在组织块周围呈晕状分布, 此后细胞开始向外旺盛扩散、 增殖。 显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态, 发现细胞均呈细小梭形状, 两者未见明显差异。
2.2 整合素表达情况 为了客观反映不同组织来源、不同培养代数之间成纤维细胞整合素的表达水平,我们采用一致培养条件,包括血清和培养剂。另外,早期培养的第5代细胞固定后于-20℃低温保存,待第15代细胞准备完毕时同时进行原位ELISA检测。实验结果表明: (1)培养的第5代和第15代瘢痕成纤维细胞整合素各亚型表达,均明显高于同期的正常皮肤成纤维细胞表达水平(表1); (2)细胞从第5代培养至第15代时,瘢痕或正常皮肤的成纤维细胞,其整合素的表达均有所下降,但就下降幅度而言,瘢痕成纤维细胞为5.94%～18.26%,而正常成纤维细胞则为26.19%～46.84%,两者有显著性差异,如表2所示。
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表 1 瘢痕及正常皮肤成纤维细胞整合素表达水平
Tab 1 Expression of integrins in NSFb and HSFb(n=6,
) IntegrinsNSFb
HSFb
Passage 5
Passage 15
Passage 5
Passage 15
β1
, 百拇医药
1.86±0.06
1.34±0.03
2.19±0.03**
2.06±0.02**
α1
1.26±0.07
0.93±0.06
1.90±0.08**
1.78±0.05**
α2
, 百拇医药
1.64±0.03
1.19±0.04
2.01±0.04**
1.87±0.04**
α3
1.30±0.06
0.86±0.03
1.95±0.01**
1.73±0.02**
α4
, 百拇医药
0.79±0.03
0.42±0.01
1.15±0.01**
0.94±0.02**
NSFb: normal skin-derived fibroblasts; HSFb: hypertrophic scar-derived fibroblasts;**P<0.01 vs NSFb of same passage
表 2 第5至第15代成纤维细胞整合素表达降低幅度
Tab 2 The decreased range of integrin expression in
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fibroblasts from passage 5 to 15(n=6, %) Integrin
NSFb
HSFb
β1
27.96
5.94**
α1
26.19
6.32**
α2
, 百拇医药 27.44
6.97**
α3
33.85
11.28**
α4
46.84
18.26**
NSFb: normal skin-derived fibroblasts; HSFb: hypertrophic scar-derived fibroblasts; **P<0.01 vs NSFb
, 百拇医药
3 讨 论
整合素粘附分子是细胞膜上的跨膜蛋白。它由α和β两条肽链组成,每条肽链都有10多种亚型,不同亚型的β和α链组成不同的整合素粘附分子;但每一种都具有结合一种或多种细胞外间质的能力,其中β1α1,β1α2及β1α3整合素粘附分子能与胶原蛋白、层粘连蛋白(Laminins,LN)结合,β1α3和β1α4整合素粘附分子则能与纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)结合;而整合素分子的膜内区常常与细胞骨架成分接触。在功能上,整合素既是细胞与细胞外间质之间的主要联系桥梁,亦是细胞沟通内外信息的重要渠道;细胞膜上整合素的表达水平一方面影响着细胞形态、增殖、分化、迁移及某些大分子成分合成,另一方面对组织保持结构完整及结缔组织收缩有着重要意义[1,2,4]。
, 百拇医药
增生性瘢痕作为伤口上皮化以后组织内以成纤维细胞继续旺盛增殖、细胞外间质(胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等)过度沉积为主要特征的病理学疾患,瘢痕成纤维细胞的许多异常生物学活性已为以往的实验所证实。研究发现,瘢痕成纤维细胞在体外合成纤维粘连蛋白量是正常成纤维细胞的4倍,合成胶原量是正常细胞的3倍[5,6],蛋白多糖合成及α平滑肌肌动蛋白表达也明显增加[7,8]。我们通过对不同培养时期的瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞β1,α1,α2,α3及α4整合素表达检测,进一步证实瘢痕成纤维细胞与同期培养的正常皮肤成纤维细胞相比,不但具有更强的整合素表达功能,而且长时间培养后各亚型整合素表达下降幅度亦明显低于正常成纤维细胞。
鉴于整合素粘附分子在结缔组织构建中的特殊作用,我们认为瘢痕成纤维细胞的这种高表达整合素特性对瘢痕组织的增生、挛缩有着重要意义。其作用可能有以下几方面:(1)促进细胞外间质对成纤维细胞活性功能调节;(2)使成纤维细胞与胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白之间的联系更为紧密,导致瘢痕组织结构致密、质地变硬及组织挛缩;(3)协同瘢痕组织中某些细胞因子作用[9,10]。因此,设法抑制或降低瘢痕成纤维细胞膜上整合素的过度表达,可能是临床上控制瘢痕增生挛缩、促进瘢痕软化的有效途径。
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参 考 文 献
1 傅诚强. 粘附分子作为疾病的决定性因子. 国外医学外科学分册,1997,24(1):31
2 冯信忠, 徐文严. 细胞粘附分子与皮肤病理. 国外医学皮肤病学分册, 1997,23(2):109
3 Swerlick RA, Lee KH, Li LJ, et al. Regulation of vascular cell adhesion molecule 1 on human dermal microvascular endothelial cell. J Immunol, 1992,149(2):698
4 Juliano RL, Haskill S. Signal transduction from the extracellular matrix. J Cell Biol, 1993,120(3):577
, 百拇医药
5 Kischer CW, Wagner HNJr, Pindur J, et al. Increased fibronec- tin production by cell lines from hypertrophic scar and keloid. Connect Tissue Res, 1989,23(4):279
6 Younai S, Nichter LS, Wellisz T, et al. Modulation of collagen synthesis by transforming growth factor-beta in keloid and hypertrophic scar fibroblasts. Ann Plast Surg, 1994,33(2):148
7 Scott PG, Dodd CM, Tredget EE, et al. Chemical characterization and quantification of proteoglycans in human post-burn hypertrophic and mature scars. Clin Sci Colch, 1996,90(5):417
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8 Schmitt-Graff A, Desmouliere A, Gabbiani G. Heterogeneity of myofibroblast phenotypic features: an example of fibroblastic cell plasticity. Virchows Arch, 1994,425(1):3
9 Stephens P, Genever PG, Wood EJ, et al. Integrin receptor involvement in actin cable formation in an in vitro model of events associated with wound contraction. Int J Biochem Cell Biol, 1997,29(1):121
10 Miyamoto S, Teramoto H, Gutkind JS, et al. Integrins can collaborate with growth factors for phosphorylation of receptor tyrosine kinases and MAP kinase activation: roles of integrin aggregation and occupancy of receptors. J Cell Biol, 1996,135(6 Pt 1):1633
(1997-11-20收稿, 1998-06-17修回)
李艳红，女，1952年2月生，副主任技师, http://www.100md.com