诱导型一氧化氮合酶在ConA诱发T细胞介导的小鼠肝损害中的表达
作者：张修礼 秦一中 韩絮琳
单位：250031 济南, 济南军区总医院(张修礼)；第二军医大学附属长海医院(秦一中，韩絮琳)
关键词：氧合酶类；一氧化氮；伴刀豆球蛋白A；肝细胞
中华传染病杂志980406 【摘要】 目的 观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在刀豆素A(ConA)诱发T细胞介导的小鼠肝损害中的表达及意义。方法 应用黄递酶染色(NADPH-d)技术观察iNOS表达。结果 ConA造成肝损害后，血浆中亚硝酸盐(NO-2)较正常对照组(PBS组)显著升高，以L-NAME抑制NO合成，肝细胞损害反而加重，且肝组织内丙二醛(MDA)增加，肝窦内血细胞聚集加重；在ConA造成肝损害时可见肝实质细胞表达iNOS，且越靠近中央静脉的肝细胞表达越多，推测这是肝细胞对缺血缺氧而产生的一种自身反映；用环孢霉素A(CSA)预先抑制T细胞活化，则未发现肝细胞表达iNOS。结论 在ConA性肝损害中，肝实质细胞通过启动自身的NO生物合成机制参与了炎症应答，并通过消除氧自由基和抑制血细胞在肝窦内聚集而起一定的保护作用，这一生物过程很可能是肝细胞参与机体免疫应答的一部分。
, http://www.100md.com
The expression of inducible nitric oxide synthase in T-cell-dependent liver injury in mice induced by concanavalin A Zhang Xiuli,Qin Yizhong,Han Xulin. Department of Gastroenterology,General Hospital of Jinan Military Region,Jinan 250031.
【Abstract】 Objective To observe the expression and effect of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in T-cell-dependent liver injury in mice initiated by concanavalin A(ConA).Methods Using NADPH diaphorase staining,we observed the expression of iNOS.Results Liver injury became more serious if NO synthesis was inhibited.The further study showed that the MDA in liver increased greatly and vascular thrombosis became more serious.We also found that the more near the hepatocytes closed to the central vein,the more iNOS was expressed,which may be due to the lack of sufficient supply of blood and oxygen.The expression of iNOS could not be observed if cyclosporine A(CSA)-an inhibitor of T lymphocyte was used before ConA challenging introvenously.Conclusions NO plays a protective role in ConA-induced liver injury by eradicating oxygen radicals and inhibite intro vascular thrombosis,the trigger of NO biologic synthesis in hepatocyte during liver inflammatory process is the outcome of the activation of T cell.It is likely that the expression of iNOS is one part of the host immune response.
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【Key words】 Oxygenases Nitricoxide Concanavalin A Hepatocellular
一氧化氮(NO)是在一氧化氮合酶作用下生成的一种具有信息传递和免疫效应功能的活性分子[1]。正常肝实质细胞无诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达，但在病毒性、内毒素性、酒精性肝损害时却均可表达iNOS继而合成NO，而发挥一系列生物学效应[2，3]；但因实验模型不同，有关肝细胞起动这一生物机制的病理生理意义还不十分清楚。刀豆素A(ConA)性肝损害是新近用于实验研究的典型的T细胞依赖性肝脏损害模型，能较近似的反映如病毒性肝炎、自身免疫性肝病等很多病理过程[4]，但iNOS是否在ConA性肝炎中表达以及起何作用，作者未见有关报道。为此，我们对该方面进行了初步观察。
材料与方法
一、实验材料
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(一) 实验动物 雄性昆明小白鼠，体重20～25克，购自第二军医大学实验动物中心。
(二) 主要试剂 刀豆素A(ConA)：分子量25 500(上海东风试剂厂)；环孢霉素A(CSA)：瑞士山德士公司；还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，L-NAME：购自Sigma公司；丙二醛(MDA)测定试剂盒：购自广州暨南大学医学院。
二、实验方法
(一) 不同剂量ConA造成肝损害时血浆中ALT、NO-2的变化情况 将昆明小鼠随机分为4组，每组6只；将不同剂量ConA溶于无菌PBS(0.01mol/L)液中，皆以0.2ml尾静脉注入，对照组只注射0.2ml PBS(0.01mol/L)；8小时后摘眼球取血测ALT、NO-2含量。
(二) 环孢霉素A(CSA)、NO抑制剂(L-NAME)、NO合成底物(L-精氨酸)对ALT、NO-2以及肝组织内MDA的影响 分5个实验组，每组6只小鼠；将CSA溶于橄榄油中，在注射ConA(40mg/kg)前15和1小时，皮下注射CSA(130mg/kg)；L-NAME和L-精氨酸分别在ConA(40mg/kg)应用前30分钟腹内注射(5mg/kg)；8小时后取血测ALT及NO-2，取肝组织作病理(HE染色)和iNOS染色，并测定MDA含量。实验方案如下：
, 百拇医药
ConA组 单独ConA(40mg/kg);
LN组 ConA(40mg/kg)+L-NAME(5mg/只)；
LA组 ConA(40mg/kg)+L-精氨酸(5mg/只)；
L-NAME组 单独L-NAME(5mg/只)；
CSA组 ConA(40mg/kg)+CSA(130mg/kg)。
(三) 血浆NO测定 按Griess原理进行。即取新鲜血4℃12 000r/min离心15分钟；取0.1ml上清加双蒸水稀释5倍后，加NaOH(55mmol/L)和ZnSO4(75mmol/L)各2.5ml和2.0ml，混匀后1 500r/min离心10分钟；取上清2.5ml加甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.2mol/L)0.5ml混匀，加铜包被镉粒2.5g，室温放置2小时，最后加对氨基苯磺酸(46mmol/L)、α-萘氨(35mmol/L)各0.1ml显色30分钟；在540nm比色，与NO-2标准曲线比较，计算出血浆中所测NO-2量。
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(四) 诱导型一氧化氮合酶组织化学染色(黄递酶染色法) 将液氮保存的肝组织迅速固定于4%中性多聚甲醛液中，4℃固定4小时；移入20%蔗糖液4℃过夜；恒温冷冻切片机内切厚10μm的切片；再移入NADPH液(含1mmol/L NADPH和7.2mmol/L NBT)，37℃温育2小时后移入0.01mol/L PBS液中止反应，核固红衬染，明胶封片，凉干。
(五) 肝组织MDA测定 按试剂盒操作说明进行。
(六) 肝脏病理 常规HE染色。
(七) 统计学处理 采用t检验，F检验。
结果
一、不同剂量ConA时血浆ALT、NO-2的变化
, http://www.100md.com 见附表。
附表 不同实验组小鼠血浆中ALT、NO-2及肝组织中MDA的变化情况 (
) 组 别
实验只数
死亡数
ALT(U/L)
NO-2(mol/L)
MDA(nmol/mg蛋白)
PBS组
6
, http://www.100md.com 0
39±20
63.0±6.0
2.18±1.46
ConA(10mg/kg)
6
0
51±9
100.8±44.1
-
ConA(20mg/kg)
6
0
, 百拇医药
84±18*
117.6±40.0*
-
ConA(40mg/kg)
6
1
292±65*
155.8±21.1*
4.78±1.60*
LN组
6
, http://www.100md.com
3
664±223**
95.0±15.4**
9.96±1.66**
LA组
6
1
300±154
162.2±31.9
5.03±1.24
L-NAME
6
, 百拇医药
0
47±17
60.8±7.3
1.89±0.71
CSA组
6
0
44±24**
67.0±7.5**
2.25±0.68
* 表示与PBS组相比P<0.05；** 表示与ConA组相比P<0.05 ConA作用8小时后，血浆中ALT随着剂量的增大而增高，血浆NO-2也随之增加。 二、L-NAME、L-精氨酸、CSA对血浆ALT、NO-2及肝组织MDA的影响
, http://www.100md.com
LN组小鼠活动力明显减弱，体表温度下降，血浆中NO-2显著下降，但ALT却急骤升高，8小时死亡率也增加(3/6)；肝组织病理示：肝窦内血细胞淤集十分明显。CSA组小鼠与PBS组相比活动力无差异、8小时内无小鼠死亡，且两组血浆ALT相比P>0.05。单独尾静脉注射L-NAME无肝细胞损害(ALT与PBS组相比P>0.05)。LA组与ConA组相比各项指标相差也不显著(附表)。病理证实所有死亡小鼠均死于T细胞介导的肝脏损害(图1)，而其他器官几乎不受影响，这与Tiegs G等[4]的报道一致。
三、肝组织内iNOS的表达
实验显示：正常小鼠除门管区内皮细胞少量着色外，正常肝实质细胞无iNOS表达(图2)；ConA(40mg/kg)作用2小时，低倍镜下可见多数肝小叶被染成紫蓝色；8小时仍可染色；高倍镜下：肝细胞内大量粗大的紫蓝色颗粒，分布于胞浆，而细胞核中未见表达，此即iNOS；肝细胞内iNOS多以肝小叶的形式集中表达，且越靠近中央静脉，肝细胞表达越多(图3)。CSA组仅见门脉区内皮细胞少量着色，而肝实质细胞几乎无iNOS表达(图4)。
, 百拇医药
图1 ConA(40mg/kg)作用8小时后肝门管区大量淋巴细胞浸润(4×3.3) 图2 对照组(PBS组)，肝实质细胞内无iNOS表达(4×3.3)
图3 ConA(40mg/kg)作用后2小时，肝实质细胞内表达iNOS(呈紫蓝色)，越靠近中央静脉的肝细胞表达越多(4×3.3) 图4 环孢霉素A(CSA)预处理后，再用ConA(40mg/kg)，除中央静脉内皮细胞外肝实质细胞几乎不着色(4×3.3)讨论
本研究在用ConA诱发了昆明小鼠T细胞依赖性肝损害的基础上，观察了iNOS的表达及意义。结果显示：NO生物机制参与正常的生理活动(PBS组小鼠血浆NO-2为63.0μmol/L)，当ConA造成肝损害后，随着剂量加大，血浆NO-2也呈升高趋势，当ConA达40mg/kg时，血浆NO-2增至155.8μmol/L，与PBS组比较P<0.01；表明在T细胞依赖性肝损害中，小鼠体内NO生物合成机制也被激活，这与其他实验模型的结果相似[5]。
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进一步研究发现：给予NO合成抑制剂——L-NAME后(LN组)，小鼠体内NO生物合成被抑制(NO-2降至60.8μmol/L)，肝细胞损害却加剧(ALT升至667U/L)，8小时死亡率增加(3/6)；而单独用L-NAME未造成肝损害，这表明NO起一定的保护作用。给予NO合成供体——L-精氨酸(LA组)，小鼠血浆NO-2及ALT与ConA40mg/kg组相比变化不明显(P>0.05)，这是因为小鼠体内自身的L-精氨酸池不会在短时间内被耗竭的缘故[6]。
目前认为NO具有对抗自由基、抑制血小板聚集的作用。我们的实验表明：ConA造成肝损害时，肝组织内MDA也增加，若抑制NO合成，肝组织内MDA增至9.96mmol/mg蛋白(与ConA40mg/kg组相比P<0.01)，表明肝组织内脂质过氧化加重；组织病理发现肝窦内血细胞聚集也加重，该实验结果支持前述结论。最近有人发现NO还可通过抑制粘附分子的表达而减轻炎症反应[6]，这可能是NO起保护作用的又一重要分子机制。但NO本身具有益与有害双向作用，NO究竟发挥怎样的作用，这可能与其在体内的浓度有关，低浓度的NO通过改善微循环而起保护作用，而高浓度的NO因与自由基结合后生成毒性更大的分子而增加对组织的损害；因此，NO在体内的作用机制还需深入研究。
, 百拇医药
iNOS组织定位示：除肝门脉内皮细胞着色外，正常小鼠肝实质细胞并无iNOS表达。ConA造成肝损害后可见iNOS大量表达于细胞浆内；由于ConA性肝炎存在严重的肝窦内皮细胞肿胀、Kupffer细胞增生[4]，会造成肝窦内微循环障碍，从而导致肝细胞缺血缺氧。而越靠近中央静脉的肝细胞，其缺血缺氧越严重。因此，肝细胞反映性表达iNOS并合成NO的量就越多(图4)，NO通过扩张血管、抑制血细胞在肝窦内淤集而减轻肝细胞缺血缺氧。所以，肝实质细胞表达iNOS很可能是对外界不良环境的一种反映，是肝细胞自身保护机制之一。
我们用环孢霉素A(CSA)预先抑制T细胞活化，结果6只小鼠皆存活，且肝细胞无损害(ALT与PBS组相比P>0.05)；黄递酶染色示：肝实质细胞几乎不表达iNOS。这一方面表明ConA性肝炎是由活化的T细胞所介导，同时也进一步说明肝细胞iNOS生物机制的激活继发于T细胞的活化，这一生物过程很可能是肝细胞参与机体免疫应答的一部分。
, 百拇医药 参考文献
1 Palmer RMJ,Ferrige AG,Moncada S,et al.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelial-derived relaxing factor.Nature,1987,327:524-528.
2 Kono T,Mito M,Saha SK,et al.Hepatocyes produce inducible nitric oxide synthase (iNOS) and NADPH diaphorase (NADPH-d) in patients with various liver disease.FASEB J,1995,9:A679.
3 Billiar TR,Curran BG,Harbrecht DJ,et al.Modulation of nitrogen oxide synthesis in vivo:NG-monomethyl-l-arginine inhibits endotoxin-inducd nitrite/nitrate biosynthesis while promoting hepatic damage.J Leukoc Biol,1990,48:565-569.
, 百拇医药
4 Tiegs G,Hentschel J,Wendel A,et al.A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A.J Clin Invest,1992,90:196-203.
5 Harbrecht BG,Billiar TR,Stadler J,et al.Inhibition of nitric oxide synthesis during endotoxemia promotes intrahepatic thrombosis and an oxygen radical-mediated hepatic injury.J Leukoc Biol,1992,52:390-394.
6 Scher SC,Chung GW,Vazquez MA,et al.Augmentation or inhibition of IFN-α-induced MHC class Ⅱ expression by lipopolysaccharides:The roles of TNF-α and nitric oxide and the importance of the sequence of signaling.J Immun,1995,155:5826-5834.
(收稿：1997-06-20 修回：1998-06-07), http://www.100md.com
单位：250031 济南, 济南军区总医院(张修礼)；第二军医大学附属长海医院(秦一中，韩絮琳)
关键词：氧合酶类；一氧化氮；伴刀豆球蛋白A；肝细胞
中华传染病杂志980406 【摘要】 目的 观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在刀豆素A(ConA)诱发T细胞介导的小鼠肝损害中的表达及意义。方法 应用黄递酶染色(NADPH-d)技术观察iNOS表达。结果 ConA造成肝损害后，血浆中亚硝酸盐(NO-2)较正常对照组(PBS组)显著升高，以L-NAME抑制NO合成，肝细胞损害反而加重，且肝组织内丙二醛(MDA)增加，肝窦内血细胞聚集加重；在ConA造成肝损害时可见肝实质细胞表达iNOS，且越靠近中央静脉的肝细胞表达越多，推测这是肝细胞对缺血缺氧而产生的一种自身反映；用环孢霉素A(CSA)预先抑制T细胞活化，则未发现肝细胞表达iNOS。结论 在ConA性肝损害中，肝实质细胞通过启动自身的NO生物合成机制参与了炎症应答，并通过消除氧自由基和抑制血细胞在肝窦内聚集而起一定的保护作用，这一生物过程很可能是肝细胞参与机体免疫应答的一部分。
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The expression of inducible nitric oxide synthase in T-cell-dependent liver injury in mice induced by concanavalin A Zhang Xiuli,Qin Yizhong,Han Xulin. Department of Gastroenterology,General Hospital of Jinan Military Region,Jinan 250031.
【Abstract】 Objective To observe the expression and effect of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in T-cell-dependent liver injury in mice initiated by concanavalin A(ConA).Methods Using NADPH diaphorase staining,we observed the expression of iNOS.Results Liver injury became more serious if NO synthesis was inhibited.The further study showed that the MDA in liver increased greatly and vascular thrombosis became more serious.We also found that the more near the hepatocytes closed to the central vein,the more iNOS was expressed,which may be due to the lack of sufficient supply of blood and oxygen.The expression of iNOS could not be observed if cyclosporine A(CSA)-an inhibitor of T lymphocyte was used before ConA challenging introvenously.Conclusions NO plays a protective role in ConA-induced liver injury by eradicating oxygen radicals and inhibite intro vascular thrombosis,the trigger of NO biologic synthesis in hepatocyte during liver inflammatory process is the outcome of the activation of T cell.It is likely that the expression of iNOS is one part of the host immune response.
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【Key words】 Oxygenases Nitricoxide Concanavalin A Hepatocellular
一氧化氮(NO)是在一氧化氮合酶作用下生成的一种具有信息传递和免疫效应功能的活性分子[1]。正常肝实质细胞无诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达，但在病毒性、内毒素性、酒精性肝损害时却均可表达iNOS继而合成NO，而发挥一系列生物学效应[2，3]；但因实验模型不同，有关肝细胞起动这一生物机制的病理生理意义还不十分清楚。刀豆素A(ConA)性肝损害是新近用于实验研究的典型的T细胞依赖性肝脏损害模型，能较近似的反映如病毒性肝炎、自身免疫性肝病等很多病理过程[4]，但iNOS是否在ConA性肝炎中表达以及起何作用，作者未见有关报道。为此，我们对该方面进行了初步观察。
材料与方法
一、实验材料
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(一) 实验动物 雄性昆明小白鼠，体重20～25克，购自第二军医大学实验动物中心。
(二) 主要试剂 刀豆素A(ConA)：分子量25 500(上海东风试剂厂)；环孢霉素A(CSA)：瑞士山德士公司；还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，L-NAME：购自Sigma公司；丙二醛(MDA)测定试剂盒：购自广州暨南大学医学院。
二、实验方法
(一) 不同剂量ConA造成肝损害时血浆中ALT、NO-2的变化情况 将昆明小鼠随机分为4组，每组6只；将不同剂量ConA溶于无菌PBS(0.01mol/L)液中，皆以0.2ml尾静脉注入，对照组只注射0.2ml PBS(0.01mol/L)；8小时后摘眼球取血测ALT、NO-2含量。
(二) 环孢霉素A(CSA)、NO抑制剂(L-NAME)、NO合成底物(L-精氨酸)对ALT、NO-2以及肝组织内MDA的影响 分5个实验组，每组6只小鼠；将CSA溶于橄榄油中，在注射ConA(40mg/kg)前15和1小时，皮下注射CSA(130mg/kg)；L-NAME和L-精氨酸分别在ConA(40mg/kg)应用前30分钟腹内注射(5mg/kg)；8小时后取血测ALT及NO-2，取肝组织作病理(HE染色)和iNOS染色，并测定MDA含量。实验方案如下：
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ConA组 单独ConA(40mg/kg);
LN组 ConA(40mg/kg)+L-NAME(5mg/只)；
LA组 ConA(40mg/kg)+L-精氨酸(5mg/只)；
L-NAME组 单独L-NAME(5mg/只)；
CSA组 ConA(40mg/kg)+CSA(130mg/kg)。
(三) 血浆NO测定 按Griess原理进行。即取新鲜血4℃12 000r/min离心15分钟；取0.1ml上清加双蒸水稀释5倍后，加NaOH(55mmol/L)和ZnSO4(75mmol/L)各2.5ml和2.0ml，混匀后1 500r/min离心10分钟；取上清2.5ml加甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.2mol/L)0.5ml混匀，加铜包被镉粒2.5g，室温放置2小时，最后加对氨基苯磺酸(46mmol/L)、α-萘氨(35mmol/L)各0.1ml显色30分钟；在540nm比色，与NO-2标准曲线比较，计算出血浆中所测NO-2量。
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(四) 诱导型一氧化氮合酶组织化学染色(黄递酶染色法) 将液氮保存的肝组织迅速固定于4%中性多聚甲醛液中，4℃固定4小时；移入20%蔗糖液4℃过夜；恒温冷冻切片机内切厚10μm的切片；再移入NADPH液(含1mmol/L NADPH和7.2mmol/L NBT)，37℃温育2小时后移入0.01mol/L PBS液中止反应，核固红衬染，明胶封片，凉干。
(五) 肝组织MDA测定 按试剂盒操作说明进行。
(六) 肝脏病理 常规HE染色。
(七) 统计学处理 采用t检验，F检验。
结果
一、不同剂量ConA时血浆ALT、NO-2的变化
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附表 不同实验组小鼠血浆中ALT、NO-2及肝组织中MDA的变化情况 (
) 组 别实验只数
死亡数
ALT(U/L)
NO-2(mol/L)
MDA(nmol/mg蛋白)
PBS组
6
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39±20
63.0±6.0
2.18±1.46
ConA(10mg/kg)
6
0
51±9
100.8±44.1
-
ConA(20mg/kg)
6
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84±18*
117.6±40.0*
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ConA(40mg/kg)
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1
292±65*
155.8±21.1*
4.78±1.60*
LN组
6
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3
664±223**
95.0±15.4**
9.96±1.66**
LA组
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300±154
162.2±31.9
5.03±1.24
L-NAME
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47±17
60.8±7.3
1.89±0.71
CSA组
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44±24**
67.0±7.5**
2.25±0.68
* 表示与PBS组相比P<0.05；** 表示与ConA组相比P<0.05 ConA作用8小时后，血浆中ALT随着剂量的增大而增高，血浆NO-2也随之增加。 二、L-NAME、L-精氨酸、CSA对血浆ALT、NO-2及肝组织MDA的影响
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LN组小鼠活动力明显减弱，体表温度下降，血浆中NO-2显著下降，但ALT却急骤升高，8小时死亡率也增加(3/6)；肝组织病理示：肝窦内血细胞淤集十分明显。CSA组小鼠与PBS组相比活动力无差异、8小时内无小鼠死亡，且两组血浆ALT相比P>0.05。单独尾静脉注射L-NAME无肝细胞损害(ALT与PBS组相比P>0.05)。LA组与ConA组相比各项指标相差也不显著(附表)。病理证实所有死亡小鼠均死于T细胞介导的肝脏损害(图1)，而其他器官几乎不受影响，这与Tiegs G等[4]的报道一致。
三、肝组织内iNOS的表达
实验显示：正常小鼠除门管区内皮细胞少量着色外，正常肝实质细胞无iNOS表达(图2)；ConA(40mg/kg)作用2小时，低倍镜下可见多数肝小叶被染成紫蓝色；8小时仍可染色；高倍镜下：肝细胞内大量粗大的紫蓝色颗粒，分布于胞浆，而细胞核中未见表达，此即iNOS；肝细胞内iNOS多以肝小叶的形式集中表达，且越靠近中央静脉，肝细胞表达越多(图3)。CSA组仅见门脉区内皮细胞少量着色，而肝实质细胞几乎无iNOS表达(图4)。
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图1 ConA(40mg/kg)作用8小时后肝门管区大量淋巴细胞浸润(4×3.3) 图2 对照组(PBS组)，肝实质细胞内无iNOS表达(4×3.3)
图3 ConA(40mg/kg)作用后2小时，肝实质细胞内表达iNOS(呈紫蓝色)，越靠近中央静脉的肝细胞表达越多(4×3.3) 图4 环孢霉素A(CSA)预处理后，再用ConA(40mg/kg)，除中央静脉内皮细胞外肝实质细胞几乎不着色(4×3.3)讨论
本研究在用ConA诱发了昆明小鼠T细胞依赖性肝损害的基础上，观察了iNOS的表达及意义。结果显示：NO生物机制参与正常的生理活动(PBS组小鼠血浆NO-2为63.0μmol/L)，当ConA造成肝损害后，随着剂量加大，血浆NO-2也呈升高趋势，当ConA达40mg/kg时，血浆NO-2增至155.8μmol/L，与PBS组比较P<0.01；表明在T细胞依赖性肝损害中，小鼠体内NO生物合成机制也被激活，这与其他实验模型的结果相似[5]。
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进一步研究发现：给予NO合成抑制剂——L-NAME后(LN组)，小鼠体内NO生物合成被抑制(NO-2降至60.8μmol/L)，肝细胞损害却加剧(ALT升至667U/L)，8小时死亡率增加(3/6)；而单独用L-NAME未造成肝损害，这表明NO起一定的保护作用。给予NO合成供体——L-精氨酸(LA组)，小鼠血浆NO-2及ALT与ConA40mg/kg组相比变化不明显(P>0.05)，这是因为小鼠体内自身的L-精氨酸池不会在短时间内被耗竭的缘故[6]。
目前认为NO具有对抗自由基、抑制血小板聚集的作用。我们的实验表明：ConA造成肝损害时，肝组织内MDA也增加，若抑制NO合成，肝组织内MDA增至9.96mmol/mg蛋白(与ConA40mg/kg组相比P<0.01)，表明肝组织内脂质过氧化加重；组织病理发现肝窦内血细胞聚集也加重，该实验结果支持前述结论。最近有人发现NO还可通过抑制粘附分子的表达而减轻炎症反应[6]，这可能是NO起保护作用的又一重要分子机制。但NO本身具有益与有害双向作用，NO究竟发挥怎样的作用，这可能与其在体内的浓度有关，低浓度的NO通过改善微循环而起保护作用，而高浓度的NO因与自由基结合后生成毒性更大的分子而增加对组织的损害；因此，NO在体内的作用机制还需深入研究。
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iNOS组织定位示：除肝门脉内皮细胞着色外，正常小鼠肝实质细胞并无iNOS表达。ConA造成肝损害后可见iNOS大量表达于细胞浆内；由于ConA性肝炎存在严重的肝窦内皮细胞肿胀、Kupffer细胞增生[4]，会造成肝窦内微循环障碍，从而导致肝细胞缺血缺氧。而越靠近中央静脉的肝细胞，其缺血缺氧越严重。因此，肝细胞反映性表达iNOS并合成NO的量就越多(图4)，NO通过扩张血管、抑制血细胞在肝窦内淤集而减轻肝细胞缺血缺氧。所以，肝实质细胞表达iNOS很可能是对外界不良环境的一种反映，是肝细胞自身保护机制之一。
我们用环孢霉素A(CSA)预先抑制T细胞活化，结果6只小鼠皆存活，且肝细胞无损害(ALT与PBS组相比P>0.05)；黄递酶染色示：肝实质细胞几乎不表达iNOS。这一方面表明ConA性肝炎是由活化的T细胞所介导，同时也进一步说明肝细胞iNOS生物机制的激活继发于T细胞的活化，这一生物过程很可能是肝细胞参与机体免疫应答的一部分。
, 百拇医药 参考文献
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(收稿：1997-06-20 修回：1998-06-07), http://www.100md.com