中空纤维型生物人工肝用于支持治疗重型肝炎的体外初探
作者：王英杰 李梦东 王宇明 聂青和
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院
关键词：
中华传染病杂志980418 本实验采用混合多细胞聚集培养的人肝细胞、肝非实质细胞为生物材料，中空纤维管为生物反应器，组成人工肝装置。取重型肝炎患者血清进行体外循环，通过观察血清胆红素、白蛋白等部分生化指标和实验装置内肝细胞活力的变化，探讨生物人工肝用于支持治疗重型肝炎的可能性。
材料与方法
一、肝细胞的消化分离与混合培养
生物材料为人肝细胞，以简易体外两步灌流法分离肝细胞，差速离心法反复三次离心，获取肝细胞和肝非实质细胞。分离的两种细胞经台盼蓝染色、计数后，按2∶1混合接种于被覆聚羟乙基异丁烯酸的培养瓶内，置37℃、5%CO2、湿度100%条件进行球形聚集培养[1]。
, 百拇医药
二、中空纤维型生物人工肝装置的构成
以中空纤维管为生物反应器，反应器外腔放置肝细胞及培养上清，内腔经硅胶管与蠕动泵、循环液贮池相连接，整个装置为一闭合循环系统。实验取培养2～3天的混合聚集球形体肝细胞(量约2×108)移入反应器，置37℃、5%CO2条件下，反复旋转反应器使肝细胞均匀分布。
三、实验方法与观察指标
取5例死亡重型肝炎患者血清，置人工肝循环液贮池进行体外循环实验。患者诊断符合1995年《病毒性肝炎防治方案》标准，并有病理检查依据，均死于肝功能衰竭，死后1小时内抽心血离心取血清。采用生化分析方法检测体外循环前后5份血清中总蛋白、白蛋白、甲胎蛋白、胆红素的变化，并观察聚集肝细胞形态与贴壁能力的改变。
结 果
, 百拇医药
一、循环血清胆红素的变化
经过6小时的体外循环，5例患者血清中的胆红素显著降低，平均降低幅度超过350μmol/L，实验前后血清胆红素水平之间差异有显著性(P<0.01)。为了解胆红素的粘附情况，3例患者血清同时以无细胞空白循环为对照，结果见胆红素亦降低，降低幅度平均约140μmol/L。
二、循环血清蛋白含量分析
动态分析循环血清中白蛋白含量变化发现，体外循环2小时后，血清白蛋白较循环前明显降低，以后逐渐回升。总蛋白的变化过程与之大致相似，实验结束时血清中总蛋白含量接近实验前水平。而5份循环血清中甲胎蛋白(AFP)的含量均明显增加，由实验前<31～150μg/L增至120～500μg/L。
三、实验前后肝细胞形态与贴壁能力观察
相差显微镜观察见，实验所用混合培养人肝细胞呈典型多细胞球形聚集体，其在被覆胶原的培养板上贴壁率为88%±7.3%。体外循环实验6小时后，肝细胞仍保持聚集特征和贴壁能力，贴壁率为81%±12.9%，与实验前相比下降不显著(P>0.05)。
, http://www.100md.com
讨论
近年来，新型生物人工肝的研究取得较大进展，在有关基础研究与动物实验继续深入进行的同时，成功救治暴发性肝衰竭患者的临床报道也在不断增多[2]。生物人工肝是否也可用于重型肝炎的支持治疗，成为我们关心的重要课题。为此，用我们以往建立的高密度肝细胞球形聚集培养系统与中空纤维生物反应器、辅助循环装置共同组成生物人工肝装置。采集重型肝炎患者血清进行体外模拟支持治疗实验。结果显示，5份循环血清均有胆红素含量显著降低，蛋白质含量逐渐增加两大主要改变，这一方面表明，实验所用中空纤维型生物人工肝实现了培养肝细胞与循环血清之间物质的双向交流与交换，具备参与蛋白质代谢，完成中间代谢转换等功能，符合生物人工肝的基本要求[3]。另一方面提示该人工肝对重型肝炎可能有降低黄疸、补充蛋白等支持治疗作用。
实验所用肝细胞在综合限定条件下与肝非实质细胞混合相互粘附，聚集成高密度的多细胞球形体，由于其中的细胞呈三维立体排列，与体内生存环境较相似，因而具有较高活性。实验过程中，不仅产生分泌了较多的蛋白物质，而且通过大量摄取与结合胆红素，使循环血清中胆红素含量降低，实验后肝细胞活力仍保持较高水平。提示实验采用的肝细胞培养方法可靠有效，晚期重型肝炎血清中复杂的毒性物质对其并未构成大的威胁，这从另一个角度佐证了生物人工肝用于支持治疗重型肝炎的可能与可行性。
, 百拇医药
本课题为国家“九五”攻关基金资助项目(96-920-12-02)
参考文献
1 Wang YJ, Li MD, Wang YM, et al. Simplified isolate and spheroidal aggregate culture of rat hepatocytes. World J Gastroenterol, 1998,4:77-79.
2 Demetriou AA, Rozga J, Podesta I, et al. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver. Scand J Gastroenterol, 1995, 30(Suppl 208):111-117.
3 Shatford RA, Nyberg SL, Meier SJ, et al. Artificial liver: a forthcoming attaction.(elswhere reviews). Hepatology, 1993, 17:1163-1164.
(收稿：1997-05-19 修回：1998-05-08), 百拇医药
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院
关键词：
中华传染病杂志980418 本实验采用混合多细胞聚集培养的人肝细胞、肝非实质细胞为生物材料，中空纤维管为生物反应器，组成人工肝装置。取重型肝炎患者血清进行体外循环，通过观察血清胆红素、白蛋白等部分生化指标和实验装置内肝细胞活力的变化，探讨生物人工肝用于支持治疗重型肝炎的可能性。
材料与方法
一、肝细胞的消化分离与混合培养
生物材料为人肝细胞，以简易体外两步灌流法分离肝细胞，差速离心法反复三次离心，获取肝细胞和肝非实质细胞。分离的两种细胞经台盼蓝染色、计数后，按2∶1混合接种于被覆聚羟乙基异丁烯酸的培养瓶内，置37℃、5%CO2、湿度100%条件进行球形聚集培养[1]。
, 百拇医药
二、中空纤维型生物人工肝装置的构成
以中空纤维管为生物反应器，反应器外腔放置肝细胞及培养上清，内腔经硅胶管与蠕动泵、循环液贮池相连接，整个装置为一闭合循环系统。实验取培养2～3天的混合聚集球形体肝细胞(量约2×108)移入反应器，置37℃、5%CO2条件下，反复旋转反应器使肝细胞均匀分布。
三、实验方法与观察指标
取5例死亡重型肝炎患者血清，置人工肝循环液贮池进行体外循环实验。患者诊断符合1995年《病毒性肝炎防治方案》标准，并有病理检查依据，均死于肝功能衰竭，死后1小时内抽心血离心取血清。采用生化分析方法检测体外循环前后5份血清中总蛋白、白蛋白、甲胎蛋白、胆红素的变化，并观察聚集肝细胞形态与贴壁能力的改变。
结 果
, 百拇医药
一、循环血清胆红素的变化
经过6小时的体外循环，5例患者血清中的胆红素显著降低，平均降低幅度超过350μmol/L，实验前后血清胆红素水平之间差异有显著性(P<0.01)。为了解胆红素的粘附情况，3例患者血清同时以无细胞空白循环为对照，结果见胆红素亦降低，降低幅度平均约140μmol/L。
二、循环血清蛋白含量分析
动态分析循环血清中白蛋白含量变化发现，体外循环2小时后，血清白蛋白较循环前明显降低，以后逐渐回升。总蛋白的变化过程与之大致相似，实验结束时血清中总蛋白含量接近实验前水平。而5份循环血清中甲胎蛋白(AFP)的含量均明显增加，由实验前<31～150μg/L增至120～500μg/L。
三、实验前后肝细胞形态与贴壁能力观察
相差显微镜观察见，实验所用混合培养人肝细胞呈典型多细胞球形聚集体，其在被覆胶原的培养板上贴壁率为88%±7.3%。体外循环实验6小时后，肝细胞仍保持聚集特征和贴壁能力，贴壁率为81%±12.9%，与实验前相比下降不显著(P>0.05)。
, http://www.100md.com
讨论
近年来，新型生物人工肝的研究取得较大进展，在有关基础研究与动物实验继续深入进行的同时，成功救治暴发性肝衰竭患者的临床报道也在不断增多[2]。生物人工肝是否也可用于重型肝炎的支持治疗，成为我们关心的重要课题。为此，用我们以往建立的高密度肝细胞球形聚集培养系统与中空纤维生物反应器、辅助循环装置共同组成生物人工肝装置。采集重型肝炎患者血清进行体外模拟支持治疗实验。结果显示，5份循环血清均有胆红素含量显著降低，蛋白质含量逐渐增加两大主要改变，这一方面表明，实验所用中空纤维型生物人工肝实现了培养肝细胞与循环血清之间物质的双向交流与交换，具备参与蛋白质代谢，完成中间代谢转换等功能，符合生物人工肝的基本要求[3]。另一方面提示该人工肝对重型肝炎可能有降低黄疸、补充蛋白等支持治疗作用。
实验所用肝细胞在综合限定条件下与肝非实质细胞混合相互粘附，聚集成高密度的多细胞球形体，由于其中的细胞呈三维立体排列，与体内生存环境较相似，因而具有较高活性。实验过程中，不仅产生分泌了较多的蛋白物质，而且通过大量摄取与结合胆红素，使循环血清中胆红素含量降低，实验后肝细胞活力仍保持较高水平。提示实验采用的肝细胞培养方法可靠有效，晚期重型肝炎血清中复杂的毒性物质对其并未构成大的威胁，这从另一个角度佐证了生物人工肝用于支持治疗重型肝炎的可能与可行性。
, 百拇医药
本课题为国家“九五”攻关基金资助项目(96-920-12-02)
参考文献
1 Wang YJ, Li MD, Wang YM, et al. Simplified isolate and spheroidal aggregate culture of rat hepatocytes. World J Gastroenterol, 1998,4:77-79.
2 Demetriou AA, Rozga J, Podesta I, et al. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver. Scand J Gastroenterol, 1995, 30(Suppl 208):111-117.
3 Shatford RA, Nyberg SL, Meier SJ, et al. Artificial liver: a forthcoming attaction.(elswhere reviews). Hepatology, 1993, 17:1163-1164.
(收稿：1997-05-19 修回：1998-05-08), 百拇医药