干扰素γ对人胰腺癌细胞CD44蛋白表达的影响
作者：郑劲草 许国铭 李淑德 李兆申
单位：第二军医大学长海医院消化内科，上海，200433；△四川凉山州第二人民医院消化内科 阴 绯，女，1965年3月生，主治医师
关键词：干扰素γ；胰腺癌细胞；粘附分子
第二军医大学学报980524 摘要 目的：探讨干扰素γ(IFNγ)对人胰腺癌细胞CD44蛋白表达的影响。方法：使用CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4单抗，采用流式细胞分析和免疫组化方法检测IFNγ作用于人胰腺癌细胞(SW1990)48 h后，CD44蛋白表达的变化。结果：IFNγ作用48 h后，SW1990细胞实验组CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4的表达均较对照组升高，其中CD44v6和CD44v4表达增加在统计学上有显著意义(P<0.05)。结论：IFNγ对人胰腺癌细胞CD44蛋白的表达有调节作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R735.9
Effect of interferon gamma on expression of CD44 in human pancreatic adenocarcinoma cells
Zheng Jingcao， Xu Guoming， Li Shude， Li Zhaoshen (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective：To evaluate the effect of interferon gamma (IFNγ) on expression of cluster of differentiation 44 (CD44) in human pancreatic adenocarcinoma cells. Methods： After IFNγ acting upon human pancreatic adenocarcinoma cell (SW1990) for 48 h，flowcytometry and immunohistochemical methods were used to study the expression of CD44 with mAbs against CD44s, CD44v9,CD44v6 and CD44v4. Results： After acting of IFNγfor 48 h, the expression of CD44 in SW1990 increased as compared with nonacting cell, especially CD44v6 and CD44v4(P<0.05). Conclusion： IFNγ can up-regulate the expression of CD44 in human pancreatic adenocarcinoma cells.
, 百拇医药
Key words interferon γ； pancreatic adenocarcinoma cell； adhesion molecules
由于CD44 mRNA的选择性剪接，CD44分子可以形成多种异质型。CD44标准型(CD44s)主要在间质和造血源性细胞上表达，是透明质酸的主要表面受体。CD44变异型(CD44v)主要在上皮源性细胞和肿瘤细胞中表达。资料表明CD44v的异常表达与肿瘤的浸润、转移有关，而目前对肿瘤细胞表达的调节机制知之甚少。IFNγ可以改变肿瘤细胞的细胞膜特性，增加肿瘤相关性抗原的表达[1]。我们采用免疫组化和流式细胞技术初步研究了IFNγ对人胰腺癌细胞CD44蛋白表达的影响，探讨肿瘤细胞CD44变异型的调节机制。
1 材料和方法
1.1 材料与来源 人胰腺癌细胞株SW1990系本实验室提供，来源于一中度分化胰腺导管上皮癌患者，具有转移能力[2]。CD44s,CD44v9,CD44v6和CD44v4单抗由瑞士Basel免疫研究所Gunthert博士惠赠。FITC标记的羊抗鼠IgG,ABC试剂盒购自华美生物工程技术公司。流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。
, http://www.100md.com
1.2 SW1990细胞处理 (1) 在75 ml培养瓶中加入对数生长期SW1990细胞5×106个，贴壁生长24 h后换培养液，加入IFNγ使浓度达250 U/ml继续培养48 h。对照组细胞处理方式相同，但未加IFNγ。(2)收集细胞爬片：在6孔培养板中每孔放置盖玻片一块，加入对数生长期细胞5×105个，其余处理步骤同(1)。
1.3 流式细胞分析 将培养瓶中细胞用0.25%胰酶消化，PBS洗2次后离心去上清。用PBS液将细胞浓度调至106个/ml，取20 μl与10 μl单抗原液混匀，室温下孵育30 min。PBS洗3次后与FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶40)混匀,4℃静置30 min。PBS洗两次后,调细胞浓度为106个/ml上机,每次计数2万个细胞,根据光强度确定CD44蛋白表达量。对照组不加CD44一抗,其余步骤均相同。
我们分别做了预实验和正式实验各1次。正式实验分为实验组和对照组，每组4瓶(每种抗体各1瓶)。由于抗体量少，未再进行重复实验。
, 百拇医药
1.4 免疫组化 细胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min。采用ABC法,第一抗体为CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4单抗。用PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 流式细胞分析结果 IFNγ作用48 h后，细胞CD44蛋白表达均较对照组升高(表1)，其中CD44v6和CD44v4的表达上调在统计学上有显著差异(P<0.05)。
表 1 流式细胞仪检测CD44蛋白在SW1990中的表达
Tab 1 Detection of expression of CD44 isoforms
, 百拇医药
in SW1990 by using flow cytometry(%) Group
CD44s
CD44v9
CD44v6
CD44v4
Control
91.89
91.96
2.16
1.27
Acting
, http://www.100md.com
94.59
93.85
56.55***
5.35*
*P<0.05 vs control; ***P<0.001 vs control
2.2 免疫组化测定结果 CD44阳性物质主要位于细胞膜上,呈棕色或棕褐色。SW1990细胞对照组主要表达CD44s和CD44v9,而CD44v6和CD44v4几乎不表达。SW1990实验组与对照组比较染色强度增加，CD44表达增加。
3 讨 论
, http://www.100md.com
细胞因子是机体防御肿瘤的一个重要因素,参与调节免疫反应、激活免疫活性细胞，并影响肿瘤细胞的生长和分化。细胞因子对CD44变异型的表达起着重要的调节作用,幼稚T淋巴细胞受到IFNγ、TNFα的刺激后会出现一过性的CD44变异型表达增加,使幼稚T淋巴细胞识别炎症部位的CD44受体[3]。而上皮细胞CD44变异型表达主要受IFNγ的调节，相对不受TNFα的影响[4]。有报道IFNγ可以增加胰腺癌细胞肿瘤相关性抗原的表达，是否影响胰腺癌细胞表达肿瘤转移相关蛋白，尚未见这方面的报道[1]。我们采用流式细胞和免疫组化方法研究IFNγ对人胰腺癌细胞(SW1990)CD44蛋白表达的影响,结果表明IFNγ实验组CD44蛋白的表达量增加,尤其是CD44v6和CD44v4的表达，与对照组相比有显著差异。说明IFNγ对人胰腺癌细胞CD44变异型的表达有调节作用。
CD44变异型的表达在淋巴细胞归巢、胚胎发育、创伤愈合和炎症反应中都是必不可少的,直接参与介导细胞-细胞、细胞-间质的粘附作用和信号传导。研究表明不同发育阶段的淋巴细胞和胚胎生发层细胞具有不同的粘附和移行能力,这与CD44变异型的表达种类和表达量有关[5]，因此CD44变异型在多种高转移性癌细胞上呈高表达，说明肿瘤细胞的转移可能利用了淋巴细胞归巢、组织分化和胚胎发育过程中的某些正常生理调节机制。本研究结果初步表明，人胰腺癌细胞CD44蛋白表达受到IFNγ的调节,其效应类似于炎症反应中的幼稚T淋巴细胞。IFNγ对肿瘤细胞具有抑制和间接杀伤作用，但不同种类的肿瘤细胞的敏感性不同[6]，是否与IFNγ诱导肿瘤转移相关蛋白的表达有关，仍需进一步的研究探讨。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Sivinski CL, Lindner DJ, Borden EC， et al. Modulation of tumor-associated antigen expression on human pancreatic and prostate carcinoma cells in vitro by alpha- and gamma-interferons. J Immunother Emphasis Tumor Immunol, 1995，18(3)：156
2 Kyriazis AP, McCombsⅢ WB, Sandberg AA， et al. Establishment and characterization of human pancreatic adenocarcinoma cell line SW1990 in tissue culture and the nude mouse. Cancer Res,1983，43(9)：4393
, http://www.100md.com
3 Stauder R, Gunthert U. CD44 isoforms impact on lymphocyte activation and differentiation. Immunologist, 1995，3(3)：78
4 Mackay CR, Terpe HJ, Stauder R, et al. Expression and modulation of CD44 variant isoforms in humans. J Cell Biol, 1994,124(1/2)：71
5 Ruiz P, Schwarzler C, Gunthert U. CD44 isoforms during differentiation and development. Bioessays,1995,17(1)：17
6 Schmielau J, Kalthoff H, Roeder C, et al. The role of cytokines in pancreatic cancer. Int J Pancreatol, 1996, 19(3)：157
(1998-03-05收稿,1998-07-30修回)
△四川凉山州第二人民医院消化内科
阴 绯，女，1965年3月生，主治医师, 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院消化内科，上海，200433；△四川凉山州第二人民医院消化内科 阴 绯，女，1965年3月生，主治医师
关键词：干扰素γ；胰腺癌细胞；粘附分子
第二军医大学学报980524 摘要 目的：探讨干扰素γ(IFNγ)对人胰腺癌细胞CD44蛋白表达的影响。方法：使用CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4单抗，采用流式细胞分析和免疫组化方法检测IFNγ作用于人胰腺癌细胞(SW1990)48 h后，CD44蛋白表达的变化。结果：IFNγ作用48 h后，SW1990细胞实验组CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4的表达均较对照组升高，其中CD44v6和CD44v4表达增加在统计学上有显著意义(P<0.05)。结论：IFNγ对人胰腺癌细胞CD44蛋白的表达有调节作用。
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中国图书资料分类法分类号 R735.9
Effect of interferon gamma on expression of CD44 in human pancreatic adenocarcinoma cells
Zheng Jingcao， Xu Guoming， Li Shude， Li Zhaoshen (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective：To evaluate the effect of interferon gamma (IFNγ) on expression of cluster of differentiation 44 (CD44) in human pancreatic adenocarcinoma cells. Methods： After IFNγ acting upon human pancreatic adenocarcinoma cell (SW1990) for 48 h，flowcytometry and immunohistochemical methods were used to study the expression of CD44 with mAbs against CD44s, CD44v9,CD44v6 and CD44v4. Results： After acting of IFNγfor 48 h, the expression of CD44 in SW1990 increased as compared with nonacting cell, especially CD44v6 and CD44v4(P<0.05). Conclusion： IFNγ can up-regulate the expression of CD44 in human pancreatic adenocarcinoma cells.
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Key words interferon γ； pancreatic adenocarcinoma cell； adhesion molecules
由于CD44 mRNA的选择性剪接，CD44分子可以形成多种异质型。CD44标准型(CD44s)主要在间质和造血源性细胞上表达，是透明质酸的主要表面受体。CD44变异型(CD44v)主要在上皮源性细胞和肿瘤细胞中表达。资料表明CD44v的异常表达与肿瘤的浸润、转移有关，而目前对肿瘤细胞表达的调节机制知之甚少。IFNγ可以改变肿瘤细胞的细胞膜特性，增加肿瘤相关性抗原的表达[1]。我们采用免疫组化和流式细胞技术初步研究了IFNγ对人胰腺癌细胞CD44蛋白表达的影响，探讨肿瘤细胞CD44变异型的调节机制。
1 材料和方法
1.1 材料与来源 人胰腺癌细胞株SW1990系本实验室提供，来源于一中度分化胰腺导管上皮癌患者，具有转移能力[2]。CD44s,CD44v9,CD44v6和CD44v4单抗由瑞士Basel免疫研究所Gunthert博士惠赠。FITC标记的羊抗鼠IgG,ABC试剂盒购自华美生物工程技术公司。流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。
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1.2 SW1990细胞处理 (1) 在75 ml培养瓶中加入对数生长期SW1990细胞5×106个，贴壁生长24 h后换培养液，加入IFNγ使浓度达250 U/ml继续培养48 h。对照组细胞处理方式相同，但未加IFNγ。(2)收集细胞爬片：在6孔培养板中每孔放置盖玻片一块，加入对数生长期细胞5×105个，其余处理步骤同(1)。
1.3 流式细胞分析 将培养瓶中细胞用0.25%胰酶消化，PBS洗2次后离心去上清。用PBS液将细胞浓度调至106个/ml，取20 μl与10 μl单抗原液混匀，室温下孵育30 min。PBS洗3次后与FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶40)混匀,4℃静置30 min。PBS洗两次后,调细胞浓度为106个/ml上机,每次计数2万个细胞,根据光强度确定CD44蛋白表达量。对照组不加CD44一抗,其余步骤均相同。
我们分别做了预实验和正式实验各1次。正式实验分为实验组和对照组，每组4瓶(每种抗体各1瓶)。由于抗体量少，未再进行重复实验。
, 百拇医药
1.4 免疫组化 细胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min。采用ABC法,第一抗体为CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4单抗。用PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 流式细胞分析结果 IFNγ作用48 h后，细胞CD44蛋白表达均较对照组升高(表1)，其中CD44v6和CD44v4的表达上调在统计学上有显著差异(P<0.05)。
表 1 流式细胞仪检测CD44蛋白在SW1990中的表达
Tab 1 Detection of expression of CD44 isoforms
, 百拇医药
in SW1990 by using flow cytometry(%) Group
CD44s
CD44v9
CD44v6
CD44v4
Control
91.89
91.96
2.16
1.27
Acting
, http://www.100md.com
94.59
93.85
56.55***
5.35*
*P<0.05 vs control; ***P<0.001 vs control
2.2 免疫组化测定结果 CD44阳性物质主要位于细胞膜上,呈棕色或棕褐色。SW1990细胞对照组主要表达CD44s和CD44v9,而CD44v6和CD44v4几乎不表达。SW1990实验组与对照组比较染色强度增加，CD44表达增加。
3 讨 论
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细胞因子是机体防御肿瘤的一个重要因素,参与调节免疫反应、激活免疫活性细胞，并影响肿瘤细胞的生长和分化。细胞因子对CD44变异型的表达起着重要的调节作用,幼稚T淋巴细胞受到IFNγ、TNFα的刺激后会出现一过性的CD44变异型表达增加,使幼稚T淋巴细胞识别炎症部位的CD44受体[3]。而上皮细胞CD44变异型表达主要受IFNγ的调节，相对不受TNFα的影响[4]。有报道IFNγ可以增加胰腺癌细胞肿瘤相关性抗原的表达，是否影响胰腺癌细胞表达肿瘤转移相关蛋白，尚未见这方面的报道[1]。我们采用流式细胞和免疫组化方法研究IFNγ对人胰腺癌细胞(SW1990)CD44蛋白表达的影响,结果表明IFNγ实验组CD44蛋白的表达量增加,尤其是CD44v6和CD44v4的表达，与对照组相比有显著差异。说明IFNγ对人胰腺癌细胞CD44变异型的表达有调节作用。
CD44变异型的表达在淋巴细胞归巢、胚胎发育、创伤愈合和炎症反应中都是必不可少的,直接参与介导细胞-细胞、细胞-间质的粘附作用和信号传导。研究表明不同发育阶段的淋巴细胞和胚胎生发层细胞具有不同的粘附和移行能力,这与CD44变异型的表达种类和表达量有关[5]，因此CD44变异型在多种高转移性癌细胞上呈高表达，说明肿瘤细胞的转移可能利用了淋巴细胞归巢、组织分化和胚胎发育过程中的某些正常生理调节机制。本研究结果初步表明，人胰腺癌细胞CD44蛋白表达受到IFNγ的调节,其效应类似于炎症反应中的幼稚T淋巴细胞。IFNγ对肿瘤细胞具有抑制和间接杀伤作用，但不同种类的肿瘤细胞的敏感性不同[6]，是否与IFNγ诱导肿瘤转移相关蛋白的表达有关，仍需进一步的研究探讨。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Sivinski CL, Lindner DJ, Borden EC， et al. Modulation of tumor-associated antigen expression on human pancreatic and prostate carcinoma cells in vitro by alpha- and gamma-interferons. J Immunother Emphasis Tumor Immunol, 1995，18(3)：156
2 Kyriazis AP, McCombsⅢ WB, Sandberg AA， et al. Establishment and characterization of human pancreatic adenocarcinoma cell line SW1990 in tissue culture and the nude mouse. Cancer Res,1983，43(9)：4393
, http://www.100md.com
3 Stauder R, Gunthert U. CD44 isoforms impact on lymphocyte activation and differentiation. Immunologist, 1995，3(3)：78
4 Mackay CR, Terpe HJ, Stauder R, et al. Expression and modulation of CD44 variant isoforms in humans. J Cell Biol, 1994,124(1/2)：71
5 Ruiz P, Schwarzler C, Gunthert U. CD44 isoforms during differentiation and development. Bioessays,1995,17(1)：17
6 Schmielau J, Kalthoff H, Roeder C, et al. The role of cytokines in pancreatic cancer. Int J Pancreatol, 1996, 19(3)：157
(1998-03-05收稿,1998-07-30修回)
△四川凉山州第二人民医院消化内科
阴 绯，女，1965年3月生，主治医师, 百拇医药