降钙素基因相关肽在大鼠应激性溃疡发生中的作用
作者：雷银雪△ 李兆申 湛先保 许国铭
单位：
关键词：应激性溃疡；降钙素基因相关肽；一氧化氮
第二军医大学学报980521 摘要 目的:观察降钙素基因相关肽(CGRP)在大鼠冷束缚应激过程中的动态改变及作用。方法:制作大鼠冷束缚应激动物模型，检测应激前及应激后2，4，6，8 h大鼠血浆CGRP含量；不同实验组大鼠,应激前用吲哚美辛(5 mg/kg,皮下)、L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME,5 mg/kg, 颈静脉注射)、生理盐水(5 ml/kg,颈静脉注射)预处理,检测应激2 h大鼠血浆CGRP含量、胃粘膜血流量(GMBF)、胃液pH值及粘膜溃疡指数(UI)。结果:大鼠应激6 h血浆CGRP含量升高(P<0.05),8 h显著升高(P<0.01)。用吲哚美辛和L-NAME预处理后均可降低GMBF、升高UI(P<0.05)、刺激血CGRP升高。结论:大鼠冷束缚应激可导致粘膜严重损伤，血浆CGRP含量升高；阻断一氧化氮合酶及环氧化酶均明显加重粘膜损伤,促进血浆内CGRP含量升高。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R573.1
Role of calcitonin gene-related peptide during the development of rat gastric stress ulceration
Lei Yinxue, Li Zhaoshen, Zhan Xianbao, Xu Guoming (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To evaluate the role of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in plasma of rats after cold restraint stress. Methods: The contents of CGRP in plasma of rats were assessed with RIA before and 2,4,6,8 h after stress. The contents of CGRP in plasma, GMBF, gastric ulcer index and pH of gastric juice were measured 2 h after cold restraint stress in different groups, which were pretreated with indomathacin (5 mg/kg, sc), L-NAME (5 mg/kg, iv) and saline (5 ml/kg, iv). Results: The content of CGRP in plasma rose 6 and 8 h after stress. Compared with control, the content of CGRP in plasma and gastric ulcer index increased, whereas GMBF decreased in groups pretreated with L-NAME or indomethacin; pH of gastric juice had no change. Conclusion: CGRP releasing increases compensatively with serious gastric mucosa lesion after cold restraint stress in rats. Administration of L-NAME and indomethacin before stress exacerbates the gastric mucosa lesion and stimulates the releasing of CGRP.
, 百拇医药
Key words stress ulcer; calcitonin gene-related peptide; nitric oxide
降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是由37个氨基酸残基组成的、 具有舒血管作用的神经肽。在鼠胃内， CGRP除了神经来源, 还有旁分泌及内分泌来源, 分泌细胞主要分布于胃窦的腺上皮中, 而它的神经纤维见于消化管的各壁层， 主要沿粘膜下微动脉、 消化腺及粘膜下肌间神经丛分布[1]， 其释放受辣椒素敏感传入神经支配。 目前认为CGRP通过一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)的介导, 发挥出强大的粘膜血管扩张及粘膜保护作用[2], 同时对胃酸及胃肠激素的释放有调节作用[3，4]。 本实验观察大鼠应激状态下血浆CGRP含量的动态改变, 并且分别用吲哚美辛、 L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)阻断环氧化酶及一氧化氮合酶合成, 观察大鼠应激后血浆CGRP、 胃粘膜血流量(GMBF)、 胃液pH及粘膜溃疡指数(UI)的变化, 探讨血CGRP在应激过程中的动态改变及其意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 试剂与仪器 CGRP放免试剂盒购于东亚免疫技术研究所,L-NAME购于Sigma公司,吲哚美辛为上海申隆制药厂产品。γ计数仪为上海原子核研究所日环仪器厂生产,LDF-Ⅲ型微机化激光多普勒血流量测定系统系南开大学研制,pH-B-1便携式pH计是上海三信仪表厂产品。
1.2 动物分组及实验操作 成年雄性SD大鼠80只,体重180～230 g(上海计划生育研究所提供),随机分组,每组10只,实验前禁食24 h,禁水1 h。动物四肢捆绑后固定于木板上,置 4℃环境中,分别于束缚应激0,2,4,6,8 h断头取血3 ml。另设两预处理组,分别于应激前15 min皮下注射吲哚美辛(5 mg/kg),颈静脉注射L-NAME(5 mg/kg)，对照组予生理盐水(5 ml/kg，颈静脉注射)。冷束缚应激2 h后用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉, 于剑突下腹正中线剖开腹腔并游离胃, 于幽门前0.5 cm胃窦前壁少血管处用5 ml注射器抽出胃液测pH， 然后用手术剪沿穿刺部位剪一直径0.5 cm圆形切口, 插入血流仪探头于胃窦前后壁和大小弯处取4点, 连续监测粘膜血流量90 s, 用微机处理取其均值。 测定后断头取血3 ml， 并取胃沿大弯侧剪开, 用生理盐水漂洗干净后展平, 按Guth标准计算UI。
, 百拇医药
1.3 标本处理 血标本置于预冷的含1%肝素30 μl、抑肽酶1 500 μl的试管中,混匀后离心(3 000 r/min×15 min),吸取上清液移入指形管中,置-20℃冰箱中冻存待测。
1.4 放免法测定血浆CGRP含量 按CGRP放免试剂盒说明书操作。用γ计数仪测定沉淀中125Ⅰ的放射性活度,再根据标准曲线测出样品中CGRP含量(ng/ml)。
1.5 统计学处理 采用第四军医大学曹秀堂等的base统计软件,数据用
±s表示,多组间数据分析用SNK法检验。
2 结 果
2.1 应激大鼠血浆CGRP含量的动态变化 应激前大鼠血浆CGRP含量为(71.09±16.73) ng/ml，应激2 h和4 h后分别升至(94.75±7.99) ng/ml和(96.74±19.11) ng/ml，均与应激前相差无显著性；应激6 h和8 h后CGRP含量均较应激前显著增加，分别达(119.17±16.65) ng/ml(P<0.05)和(158.08±19.54) ng/ml(P<0.01)。
, 百拇医药
2.2 不同预处理对应激2 h大鼠CGRP、GMBF、胃液pH及UI影响 经L-NAME预处理后冷束缚应激2 h大鼠血浆CGRP含量较对照组显著升高(P<0.01)，吲哚美辛预处理组虽较对照组升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。两处理组大鼠GMBF较对照组显著下降(P<0.05)，UI则较对照组显著升高(P<0.05)，但胃液pH值均与对照组无显著性差异(P>0.05，表1)。
表 1 不同预处理对应激2 h大鼠CGRP、GMBF、胃液pH及UI影响
Tab 1 The effects of different pre-treatment on CGRP， GMBF， gastric juice pH and UI 2 h after stress in rats(n=10,±s) Group
, 百拇医药
CGRP (ρB/ng*ml-1)
GMBF (U/mV)
pH
UI
Normal saline
94.75±7.99
118.10±12.06
1.78±0.07
2.45±0.07
Indomethacin
141.32±18.78
, 百拇医药
52.10±19.29*
1.79±0.03
9.30±3.47*
L-NAME
189.65±18.36**
53.40±7.38*
1.76±0.04
6.86±1.95*
*P<0.05, **P<0.01 vs normal saline group
, 百拇医药
3 讨 论
已有不少研究认为CGRP在胃肠道中作用广泛,且主要是通过NO和PG介导,产生粘膜充血及保护作用而维持粘膜完整性[2]。国外实验研究证实：L-NAME、吲哚美辛及CGRP抗体(h CGRP8-37)均可明显降低大鼠GMBF,并加重水杨酸、胆汁酸、乙醇等造成的粘膜损害,而给予L-精氨酸、硝普钠等NO供体可增加粘膜血流,减轻上述因素造成的粘膜损害。
本实验结果显示，大鼠应激早期血浆CGRP含量无明显改变,后期则进行性升高,提示CGRP应激早期缓慢释放，在粘膜严重或持续受损时才明显释放,CGRP明显升高可能是粘膜缺血或严重受损的代偿性反应。从应激性溃疡预防的角度来看,预先给予或应激早期给予外源性CGRP可能减轻粘膜的损害。
本实验还观察到：经吲哚美辛、L-NAME预处理后的大鼠,应激2 h血浆CGRP含量较对照组明显升高,前者未能达到统计学差异显著的水平(可能和样本含量较小有关),而L-NAME组则与生理盐水对照组差异非常显著(P<0.01),提示在引起CGRP释放过程中，NO的作用比PG更为重要。但吲哚美辛和 L-NAME 组均可明显降低GMBF、升高UI、使血浆CGRP含量代偿性升高，证实NO及PG在机体处于应激状态时有增加粘膜血流、保护粘膜的作用。据文献报告，CGRP对胃酸的影响可能是通过激素调节作用和减少组胺的分泌来降低胃酸的分泌[1，5]，而本实验的结果显示CGRP不影响胃液pH,可能是胃酸分泌的调控主要受乙酰胆碱能神经、组胺、胃泌素等综合作用影响,而CGRP单一因素不能对应激状态下胃酸的分泌产生显著影响。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 黄威权, 孙 岚, 谢 文. 大鼠胃肠胰系统中降钙素基因相关肽的免疫组织化学定位. 解剖学杂志, 1994，17(5):429
2 Kinoshita M, Kume E, Tamaki H. Roles of prostaglandin,nitric oxide and the capsaicin-sensitive sensory nerves in gastroprotection produced by ecabet sodium.J Pharmacol Exp Ther, 1996， 274(1):494
3 Takeuchi K, Takehara K, Kaneko T, et al. Nitric oxide and prostoglandins in regulation of acid secretory response in rat stomach following injury. J Pharmacol Exp Ther, 1995，272(1):357
, http://www.100md.com
4 赵建平,彭裕文,刘才栋，等.人和大鼠胃窦粘膜内降钙素基因相关肽阳性结构和D细胞的形态联系.解剖学杂志,1996，19(5)：408
5 Takeuchik K, Kato S, Yasuhlinro T, et al. Mechanism of acid secretory changes in rat stomach after damage by taurocholate. Role of nitric oxide, histamine, and sensory neurons. Dig Dis Sci, 1997，42(3):645
(1998-05-29收稿，1998-08-07修回)
, 百拇医药
单位：
关键词：应激性溃疡；降钙素基因相关肽；一氧化氮
第二军医大学学报980521 摘要 目的:观察降钙素基因相关肽(CGRP)在大鼠冷束缚应激过程中的动态改变及作用。方法:制作大鼠冷束缚应激动物模型，检测应激前及应激后2，4，6，8 h大鼠血浆CGRP含量；不同实验组大鼠,应激前用吲哚美辛(5 mg/kg,皮下)、L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME,5 mg/kg, 颈静脉注射)、生理盐水(5 ml/kg,颈静脉注射)预处理,检测应激2 h大鼠血浆CGRP含量、胃粘膜血流量(GMBF)、胃液pH值及粘膜溃疡指数(UI)。结果:大鼠应激6 h血浆CGRP含量升高(P<0.05),8 h显著升高(P<0.01)。用吲哚美辛和L-NAME预处理后均可降低GMBF、升高UI(P<0.05)、刺激血CGRP升高。结论:大鼠冷束缚应激可导致粘膜严重损伤，血浆CGRP含量升高；阻断一氧化氮合酶及环氧化酶均明显加重粘膜损伤,促进血浆内CGRP含量升高。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R573.1
Role of calcitonin gene-related peptide during the development of rat gastric stress ulceration
Lei Yinxue, Li Zhaoshen, Zhan Xianbao, Xu Guoming (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To evaluate the role of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in plasma of rats after cold restraint stress. Methods: The contents of CGRP in plasma of rats were assessed with RIA before and 2,4,6,8 h after stress. The contents of CGRP in plasma, GMBF, gastric ulcer index and pH of gastric juice were measured 2 h after cold restraint stress in different groups, which were pretreated with indomathacin (5 mg/kg, sc), L-NAME (5 mg/kg, iv) and saline (5 ml/kg, iv). Results: The content of CGRP in plasma rose 6 and 8 h after stress. Compared with control, the content of CGRP in plasma and gastric ulcer index increased, whereas GMBF decreased in groups pretreated with L-NAME or indomethacin; pH of gastric juice had no change. Conclusion: CGRP releasing increases compensatively with serious gastric mucosa lesion after cold restraint stress in rats. Administration of L-NAME and indomethacin before stress exacerbates the gastric mucosa lesion and stimulates the releasing of CGRP.
, 百拇医药
Key words stress ulcer; calcitonin gene-related peptide; nitric oxide
降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是由37个氨基酸残基组成的、 具有舒血管作用的神经肽。在鼠胃内， CGRP除了神经来源, 还有旁分泌及内分泌来源, 分泌细胞主要分布于胃窦的腺上皮中, 而它的神经纤维见于消化管的各壁层， 主要沿粘膜下微动脉、 消化腺及粘膜下肌间神经丛分布[1]， 其释放受辣椒素敏感传入神经支配。 目前认为CGRP通过一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)的介导, 发挥出强大的粘膜血管扩张及粘膜保护作用[2], 同时对胃酸及胃肠激素的释放有调节作用[3，4]。 本实验观察大鼠应激状态下血浆CGRP含量的动态改变, 并且分别用吲哚美辛、 L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)阻断环氧化酶及一氧化氮合酶合成, 观察大鼠应激后血浆CGRP、 胃粘膜血流量(GMBF)、 胃液pH及粘膜溃疡指数(UI)的变化, 探讨血CGRP在应激过程中的动态改变及其意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 试剂与仪器 CGRP放免试剂盒购于东亚免疫技术研究所,L-NAME购于Sigma公司,吲哚美辛为上海申隆制药厂产品。γ计数仪为上海原子核研究所日环仪器厂生产,LDF-Ⅲ型微机化激光多普勒血流量测定系统系南开大学研制,pH-B-1便携式pH计是上海三信仪表厂产品。
1.2 动物分组及实验操作 成年雄性SD大鼠80只,体重180～230 g(上海计划生育研究所提供),随机分组,每组10只,实验前禁食24 h,禁水1 h。动物四肢捆绑后固定于木板上,置 4℃环境中,分别于束缚应激0,2,4,6,8 h断头取血3 ml。另设两预处理组,分别于应激前15 min皮下注射吲哚美辛(5 mg/kg),颈静脉注射L-NAME(5 mg/kg)，对照组予生理盐水(5 ml/kg，颈静脉注射)。冷束缚应激2 h后用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉, 于剑突下腹正中线剖开腹腔并游离胃, 于幽门前0.5 cm胃窦前壁少血管处用5 ml注射器抽出胃液测pH， 然后用手术剪沿穿刺部位剪一直径0.5 cm圆形切口, 插入血流仪探头于胃窦前后壁和大小弯处取4点, 连续监测粘膜血流量90 s, 用微机处理取其均值。 测定后断头取血3 ml， 并取胃沿大弯侧剪开, 用生理盐水漂洗干净后展平, 按Guth标准计算UI。
, 百拇医药
1.3 标本处理 血标本置于预冷的含1%肝素30 μl、抑肽酶1 500 μl的试管中,混匀后离心(3 000 r/min×15 min),吸取上清液移入指形管中,置-20℃冰箱中冻存待测。
1.4 放免法测定血浆CGRP含量 按CGRP放免试剂盒说明书操作。用γ计数仪测定沉淀中125Ⅰ的放射性活度,再根据标准曲线测出样品中CGRP含量(ng/ml)。
1.5 统计学处理 采用第四军医大学曹秀堂等的base统计软件,数据用
±s表示,多组间数据分析用SNK法检验。2 结 果
2.1 应激大鼠血浆CGRP含量的动态变化 应激前大鼠血浆CGRP含量为(71.09±16.73) ng/ml，应激2 h和4 h后分别升至(94.75±7.99) ng/ml和(96.74±19.11) ng/ml，均与应激前相差无显著性；应激6 h和8 h后CGRP含量均较应激前显著增加，分别达(119.17±16.65) ng/ml(P<0.05)和(158.08±19.54) ng/ml(P<0.01)。
, 百拇医药
2.2 不同预处理对应激2 h大鼠CGRP、GMBF、胃液pH及UI影响 经L-NAME预处理后冷束缚应激2 h大鼠血浆CGRP含量较对照组显著升高(P<0.01)，吲哚美辛预处理组虽较对照组升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。两处理组大鼠GMBF较对照组显著下降(P<0.05)，UI则较对照组显著升高(P<0.05)，但胃液pH值均与对照组无显著性差异(P>0.05，表1)。
表 1 不同预处理对应激2 h大鼠CGRP、GMBF、胃液pH及UI影响
Tab 1 The effects of different pre-treatment on CGRP， GMBF， gastric juice pH and UI 2 h after stress in rats(n=10,
±s) Group, 百拇医药
CGRP (ρB/ng*ml-1)
GMBF (U/mV)
pH
UI
Normal saline
94.75±7.99
118.10±12.06
1.78±0.07
2.45±0.07
Indomethacin
141.32±18.78
, 百拇医药
52.10±19.29*
1.79±0.03
9.30±3.47*
L-NAME
189.65±18.36**
53.40±7.38*
1.76±0.04
6.86±1.95*
*P<0.05, **P<0.01 vs normal saline group
, 百拇医药
3 讨 论
已有不少研究认为CGRP在胃肠道中作用广泛,且主要是通过NO和PG介导,产生粘膜充血及保护作用而维持粘膜完整性[2]。国外实验研究证实：L-NAME、吲哚美辛及CGRP抗体(h CGRP8-37)均可明显降低大鼠GMBF,并加重水杨酸、胆汁酸、乙醇等造成的粘膜损害,而给予L-精氨酸、硝普钠等NO供体可增加粘膜血流,减轻上述因素造成的粘膜损害。
本实验结果显示，大鼠应激早期血浆CGRP含量无明显改变,后期则进行性升高,提示CGRP应激早期缓慢释放，在粘膜严重或持续受损时才明显释放,CGRP明显升高可能是粘膜缺血或严重受损的代偿性反应。从应激性溃疡预防的角度来看,预先给予或应激早期给予外源性CGRP可能减轻粘膜的损害。
本实验还观察到：经吲哚美辛、L-NAME预处理后的大鼠,应激2 h血浆CGRP含量较对照组明显升高,前者未能达到统计学差异显著的水平(可能和样本含量较小有关),而L-NAME组则与生理盐水对照组差异非常显著(P<0.01),提示在引起CGRP释放过程中，NO的作用比PG更为重要。但吲哚美辛和 L-NAME 组均可明显降低GMBF、升高UI、使血浆CGRP含量代偿性升高，证实NO及PG在机体处于应激状态时有增加粘膜血流、保护粘膜的作用。据文献报告，CGRP对胃酸的影响可能是通过激素调节作用和减少组胺的分泌来降低胃酸的分泌[1，5]，而本实验的结果显示CGRP不影响胃液pH,可能是胃酸分泌的调控主要受乙酰胆碱能神经、组胺、胃泌素等综合作用影响,而CGRP单一因素不能对应激状态下胃酸的分泌产生显著影响。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 黄威权, 孙 岚, 谢 文. 大鼠胃肠胰系统中降钙素基因相关肽的免疫组织化学定位. 解剖学杂志, 1994，17(5):429
2 Kinoshita M, Kume E, Tamaki H. Roles of prostaglandin,nitric oxide and the capsaicin-sensitive sensory nerves in gastroprotection produced by ecabet sodium.J Pharmacol Exp Ther, 1996， 274(1):494
3 Takeuchi K, Takehara K, Kaneko T, et al. Nitric oxide and prostoglandins in regulation of acid secretory response in rat stomach following injury. J Pharmacol Exp Ther, 1995，272(1):357
, http://www.100md.com
4 赵建平,彭裕文,刘才栋，等.人和大鼠胃窦粘膜内降钙素基因相关肽阳性结构和D细胞的形态联系.解剖学杂志,1996，19(5)：408
5 Takeuchik K, Kato S, Yasuhlinro T, et al. Mechanism of acid secretory changes in rat stomach after damage by taurocholate. Role of nitric oxide, histamine, and sensory neurons. Dig Dis Sci, 1997，42(3):645
(1998-05-29收稿，1998-08-07修回)
, 百拇医药