幽门螺杆菌对胃上皮细胞分泌IL-8的影响
作者：丁 华 许国铭 纪徐淮 杜奕奇 张洪富 许爱芳
单位：
关键词：幽门螺杆菌；白细胞介素8；cagA基因；上皮细胞；胃
第二军医大学学报980517 摘要 目的：了解幽门螺杆菌(Hp)对胃上皮细胞分泌IL-8的影响。方法：将Hp与胃上皮细胞共同孵育24 h，ELISA 法检测上清液中IL-8的浓度。结果：Hp可直接诱导胃上皮细胞分泌IL-8；热灭活、甲醛溶液固定后的菌株该作用明显减弱(P<0.01)； 含有细胞毒素相关基因A(cagA)株的诱导作用大于不含cagA株，差异明显(P<0.05)。结论：Hp能够刺激胃上皮细胞分泌IL-8；这可能与细菌是否含有cagA有关。
中国图书资料分类法分类号 R573
Interleukin-8 response of gastric epithelial cell lines to Helicobacter pylori stimulation
, 百拇医药
Ding Hua， Xu Guoming， Ji Xuhuai， Du Yiqi， Zhang Hongfu， Xu Aifang (Department of Gastroenterology，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai，200433)
Abstract Objective: To study the effects of Helicobacter pylori (Hp) on IL-8 protein secretion in established gastric epithelial cell lines. Methods: Human gastric epithelial cell lines (MKN45,BGC823,SGC7901) were co-cultured with Hp CCUG17874,G50 and 5 clinical isolates (three cagA positive and two cagA negative). IL-8 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results: Hp induced IL-8 secretion from the three cell lines. IL-8 secretion was reduced by heat killing, formalin fixation of Hp (P<0.01). CagA positive strains induced significantly higher IL-8 secretion than negative strains (P<0.05). Conclusion: Hp directly increases gastric epithelial IL-8 protein expression, and it is related to the cagA gene.
, 百拇医药
Key words Helicobacter pylori； interleukin-8；genes, cagA; epithelial cells, gastric
幽门螺杆菌(Hp)相关性胃炎在病理组织学上是以大量中性粒细胞、 单核细胞的浸润为特征， 白细胞介素8 (IL-8) 作为中性粒细胞趋化因子， 有着重要的趋化中性粒细胞、 单核细胞的作用。 本试验旨在了解Hp感染对胃上皮细胞分泌IL-8的影响。
1 材料和方法
1.1 细菌培养与分型 标准菌株CCUG17874，G50由意大利IRIS提供；临床分离株5株，自行分离。采用血培养基2号，加10%脱纤羊血和抗生素，37℃微需氧条件培养72 h。采用PCR及Western blot法将5株临床分离株分为两型。细胞毒素相关基因A(cagA)471 bp引物为5-ATAATGCTAAA TTAGACAACTTGAGCGA-3，472 bp引物为5-TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT- 3[1]，经94℃ 5 min变性，94，60，72℃循环35次，72℃ 5 min退火。1%溴化乙锭琼脂糖电泳，紫外灯下观察297 nm处亮光带。常规Western blot 法，采用抗CagA血清(意大利IRIS提供)为一抗(1∶5 000稀释)，辣根过氧化酶标记兔抗人IgG为二抗(华顺生物试剂公司)。标准菌株CCUG17874为cagA+株，G50为cagA-株。
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1.2 细胞培养 3株人胃癌上皮细胞系MKN45， BGC823， SGC7901由中科院上海细胞所提供， 采用DMEM加10%小牛血清常规培养。 细菌、 细胞按100∶1共孵育24 h， 取上清液在-70℃下保存待测。
1.3 IL-8测定 IL-8 试剂盒为美国Genzyme公司产品， 采用ELISA法测定， 检测最低限为62.5 pg/ml。 标准菌株CCUG17874经热灭活(80℃， 30 min)， 或者经10%甲醛溶液固定30 min为对照组。
2 结 果
2.1 分型 7个菌株的基因型及表现型见表1。
表 1 幽门螺杆菌菌株基因型及表现型
Tab 1 Genotype and phenotype of Hp strains Strains
, 百拇医药
cagA gene
CagA protein
vacA gene
VacA protein
CCUG17874
+
+
+
+
G 50
-
-
+
, 百拇医药
-
6900
+
+
+…
5384
+
+
+…
6877
+
+
+…
4671
, http://www.100md.com
-
-
+…
5466
-
-
+…
2.2 Hp对3株胃上皮细胞分泌IL-8的影响 CCUG17874感染MKN45，BGC823，SGC7901细胞后，3者分泌IL-8浓度分别为(6.00±0.53)，(4.56±0.22)，(3.84±0.47) ng/ml，明显高于未刺激对照组(P<0.05)，后者分别为(1.20±0.47)，(0.82±0.43)，(1.15±0.37) ng/ml。
2.3 热灭活、甲醛溶液固定Hp菌株的诱导作用 经加热或甲醛溶液固定后的CCUG17874菌株感染MKN45，BGC823，SGC7901细胞，其IL-8水平分别为(0.83±0.12)，(0.65±0.34)，(0.80±0.23)ng/ml及(0.46±0.42)，(0.43±0.21)，(0.56±0.31)ng/ml，水平明显下降(P<0.01)。
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2.4 cagA+与cagA-株的作用差异(图1) cagA+菌株(CCUG17874，6900，5384，6877)诱导胃上皮细胞分泌IL-8的作用明显高于cagA-菌株(G50，4671和5466)(P<0.05)。
3 讨 论
近年来，有关 Hp在消化道疾病发病中的作用已成为人们研究的热点。已证实细胞因子IL-8在多种炎症、感染性疾病中的作用[2]。上皮细胞分泌IL-8被认为是细菌-细胞间反应的结果，并且是宿主对该细菌免疫炎症反应过程的重要启始及调节因子[3]。本实验结果也提示Hp可直接诱导胃上皮细胞分泌IL-8，推测Hp侵入胃粘膜，刺激上皮细胞分泌IL-8，趋化并激活中性粒细胞，继而发生一系列病理生理变化，最终导致粘膜损伤。
本实验结果表明，活性Hp菌株可诱导胃上皮细胞分泌IL-8，经热灭活或甲醛溶液固定的菌株此作用则明显减弱，推测Hp菌株诱导胃上皮细胞分泌IL-8是一个活性过程，需要细菌与细胞间的活性直接接触作用[4]以及细菌蛋白质的合成。Hp高动力菌株与IL-8高分泌有一定关联[5]，高动力可能提高了细菌的粘附性，其机制有待进一步研究。
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图 1 Hp感染3株胃上皮细胞24 h后IL-8浓度
Fig 1 IL-8 secretion of gastric epithelial cells after 24 h
of co-culture with cagA+ and cagA- strains of Hp
A:SGC7901; B:BGC823; C:MKN45
*P<0.05 vs cagA+ strains
实验结果还提示，Hp感染胃粘膜上皮细胞诱导分泌IL-8 具有菌株特异性，即表达CagA蛋白的菌株其诱导分泌的IL-8 水平明显高于不表达CagA蛋白的菌株，这一结论与文献报道相似[6]。目前有关Hp致病因子的研究很多，其中空泡毒素(VacA)，CagA等的作用越来越受重视。研究发现，vacA，cagA的表达并非一致，VacA活性大小与CagA蛋白有密切关联[7，8]。Crabtree等[6]通过构建基因突变株反复研究发现，缺乏cagA基因的菌株不能诱导IL-8分泌，但CagA蛋白并非是IL-8诱导的必需条件，CagA蛋白表达量的不同以及其他共同表达的因子可能是导致IL-8不同水平的原因。对cagA基因上游序列的进一步研究发现，在cagA基因上游约4 kb区域包含有966 bp(picA)、2 655 bp(picB)阅读框架，各自编码相对分子质量为3.6万和10.1万的多肽，其中picB编码蛋白与IL-8的关系可能更为密切[9]。
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Hp感染胃粘膜造成的炎症反应除了IL-8以外，还有IL-1,IL-6,IL-10,IL-12等的作用，在细菌与上皮细胞之间存在着细胞因子网络的相互作用。细菌与宿主的免疫炎症反应最终导致了不同的疾病结果，有关这一机制有待进一步探讨。
参 考 文 献
1 Miehlke S, Kibler K, Kim JG, et al. Allelic variation in the cagA of Helicobacter pylori obtained from Korea compared to the United States. Am J Gastroenterol, 1996,91(7):1322
2 Eckmann L, Kagnoff MF, Fierere J. Epithelial cells secrete the chemokine interleukin-8 in response to bacterial entry. Infect Immun, 1993,61(11):4569
, 百拇医药
3 Huang JZ, Otoole PW, Doig P, et al. Stimulation of inter- leukin-8 production in epithelial cell lines by Helicobacter pylori. Infect Immun, 1995,63(5):1732
4 Mai UEH, Perez-Perez GI, Allen JB, et al. Surface proteins from Helicobacter pylori exhibit chemotactic activity for human leukocytes and are present in gastric mucosa. J Exp Med, 1992,175(2):517
5 Ohta-Tada U, Takagi A, Koga Y, et al. Flagellin gene diversity among Helicobacter pylori strains and IL-8 secretion from gastric epithelial cells. Scand J Gastroenterol, 1997,32(5):455
, http://www.100md.com
6 Crabtree JE, Covacci A, Farmery SM, et al. Helicobacter pylori induced interleukin-8 expression in gastric epithelial cells is associated with CagA positive phenotype. J Clin Pathol, 1995,48(1):41
7 Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. Molecular char- acterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(12):5791
8 Tummuru MKR, Cover TL, Blaser MJ. Cloning and expression of a high-molecular-mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immun, 1993,61(5):1799
9 Tummuru MKR, Sharma SA, Blaser MJ. Helicobacter pylori picB, a homologue of the Bordetella pertusis toxin secretion protein, is required for induction of IL-8 in gastric epithelial cells. Mol Microbiol, 1995,18(5):867
(1998-03-06收稿， 1998-07-06修回)
第二军医大学学报 1998 Oct; 19(5)∶454, 百拇医药
单位：
关键词：幽门螺杆菌；白细胞介素8；cagA基因；上皮细胞；胃
第二军医大学学报980517 摘要 目的：了解幽门螺杆菌(Hp)对胃上皮细胞分泌IL-8的影响。方法：将Hp与胃上皮细胞共同孵育24 h，ELISA 法检测上清液中IL-8的浓度。结果：Hp可直接诱导胃上皮细胞分泌IL-8；热灭活、甲醛溶液固定后的菌株该作用明显减弱(P<0.01)； 含有细胞毒素相关基因A(cagA)株的诱导作用大于不含cagA株，差异明显(P<0.05)。结论：Hp能够刺激胃上皮细胞分泌IL-8；这可能与细菌是否含有cagA有关。
中国图书资料分类法分类号 R573
Interleukin-8 response of gastric epithelial cell lines to Helicobacter pylori stimulation
, 百拇医药
Ding Hua， Xu Guoming， Ji Xuhuai， Du Yiqi， Zhang Hongfu， Xu Aifang (Department of Gastroenterology，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai，200433)
Abstract Objective: To study the effects of Helicobacter pylori (Hp) on IL-8 protein secretion in established gastric epithelial cell lines. Methods: Human gastric epithelial cell lines (MKN45,BGC823,SGC7901) were co-cultured with Hp CCUG17874,G50 and 5 clinical isolates (three cagA positive and two cagA negative). IL-8 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results: Hp induced IL-8 secretion from the three cell lines. IL-8 secretion was reduced by heat killing, formalin fixation of Hp (P<0.01). CagA positive strains induced significantly higher IL-8 secretion than negative strains (P<0.05). Conclusion: Hp directly increases gastric epithelial IL-8 protein expression, and it is related to the cagA gene.
, 百拇医药
Key words Helicobacter pylori； interleukin-8；genes, cagA; epithelial cells, gastric
幽门螺杆菌(Hp)相关性胃炎在病理组织学上是以大量中性粒细胞、 单核细胞的浸润为特征， 白细胞介素8 (IL-8) 作为中性粒细胞趋化因子， 有着重要的趋化中性粒细胞、 单核细胞的作用。 本试验旨在了解Hp感染对胃上皮细胞分泌IL-8的影响。
1 材料和方法
1.1 细菌培养与分型 标准菌株CCUG17874，G50由意大利IRIS提供；临床分离株5株，自行分离。采用血培养基2号，加10%脱纤羊血和抗生素，37℃微需氧条件培养72 h。采用PCR及Western blot法将5株临床分离株分为两型。细胞毒素相关基因A(cagA)471 bp引物为5-ATAATGCTAAA TTAGACAACTTGAGCGA-3，472 bp引物为5-TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT- 3[1]，经94℃ 5 min变性，94，60，72℃循环35次，72℃ 5 min退火。1%溴化乙锭琼脂糖电泳，紫外灯下观察297 nm处亮光带。常规Western blot 法，采用抗CagA血清(意大利IRIS提供)为一抗(1∶5 000稀释)，辣根过氧化酶标记兔抗人IgG为二抗(华顺生物试剂公司)。标准菌株CCUG17874为cagA+株，G50为cagA-株。
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1.2 细胞培养 3株人胃癌上皮细胞系MKN45， BGC823， SGC7901由中科院上海细胞所提供， 采用DMEM加10%小牛血清常规培养。 细菌、 细胞按100∶1共孵育24 h， 取上清液在-70℃下保存待测。
1.3 IL-8测定 IL-8 试剂盒为美国Genzyme公司产品， 采用ELISA法测定， 检测最低限为62.5 pg/ml。 标准菌株CCUG17874经热灭活(80℃， 30 min)， 或者经10%甲醛溶液固定30 min为对照组。
2 结 果
2.1 分型 7个菌株的基因型及表现型见表1。
表 1 幽门螺杆菌菌株基因型及表现型
Tab 1 Genotype and phenotype of Hp strains Strains
, 百拇医药
cagA gene
CagA protein
vacA gene
VacA protein
CCUG17874
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2.2 Hp对3株胃上皮细胞分泌IL-8的影响 CCUG17874感染MKN45，BGC823，SGC7901细胞后，3者分泌IL-8浓度分别为(6.00±0.53)，(4.56±0.22)，(3.84±0.47) ng/ml，明显高于未刺激对照组(P<0.05)，后者分别为(1.20±0.47)，(0.82±0.43)，(1.15±0.37) ng/ml。
2.3 热灭活、甲醛溶液固定Hp菌株的诱导作用 经加热或甲醛溶液固定后的CCUG17874菌株感染MKN45，BGC823，SGC7901细胞，其IL-8水平分别为(0.83±0.12)，(0.65±0.34)，(0.80±0.23)ng/ml及(0.46±0.42)，(0.43±0.21)，(0.56±0.31)ng/ml，水平明显下降(P<0.01)。
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2.4 cagA+与cagA-株的作用差异(图1) cagA+菌株(CCUG17874，6900，5384，6877)诱导胃上皮细胞分泌IL-8的作用明显高于cagA-菌株(G50，4671和5466)(P<0.05)。
3 讨 论
近年来，有关 Hp在消化道疾病发病中的作用已成为人们研究的热点。已证实细胞因子IL-8在多种炎症、感染性疾病中的作用[2]。上皮细胞分泌IL-8被认为是细菌-细胞间反应的结果，并且是宿主对该细菌免疫炎症反应过程的重要启始及调节因子[3]。本实验结果也提示Hp可直接诱导胃上皮细胞分泌IL-8，推测Hp侵入胃粘膜，刺激上皮细胞分泌IL-8，趋化并激活中性粒细胞，继而发生一系列病理生理变化，最终导致粘膜损伤。
本实验结果表明，活性Hp菌株可诱导胃上皮细胞分泌IL-8，经热灭活或甲醛溶液固定的菌株此作用则明显减弱，推测Hp菌株诱导胃上皮细胞分泌IL-8是一个活性过程，需要细菌与细胞间的活性直接接触作用[4]以及细菌蛋白质的合成。Hp高动力菌株与IL-8高分泌有一定关联[5]，高动力可能提高了细菌的粘附性，其机制有待进一步研究。
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图 1 Hp感染3株胃上皮细胞24 h后IL-8浓度
Fig 1 IL-8 secretion of gastric epithelial cells after 24 h
of co-culture with cagA+ and cagA- strains of Hp
A:SGC7901; B:BGC823; C:MKN45
*P<0.05 vs cagA+ strains
实验结果还提示，Hp感染胃粘膜上皮细胞诱导分泌IL-8 具有菌株特异性，即表达CagA蛋白的菌株其诱导分泌的IL-8 水平明显高于不表达CagA蛋白的菌株，这一结论与文献报道相似[6]。目前有关Hp致病因子的研究很多，其中空泡毒素(VacA)，CagA等的作用越来越受重视。研究发现，vacA，cagA的表达并非一致，VacA活性大小与CagA蛋白有密切关联[7，8]。Crabtree等[6]通过构建基因突变株反复研究发现，缺乏cagA基因的菌株不能诱导IL-8分泌，但CagA蛋白并非是IL-8诱导的必需条件，CagA蛋白表达量的不同以及其他共同表达的因子可能是导致IL-8不同水平的原因。对cagA基因上游序列的进一步研究发现，在cagA基因上游约4 kb区域包含有966 bp(picA)、2 655 bp(picB)阅读框架，各自编码相对分子质量为3.6万和10.1万的多肽，其中picB编码蛋白与IL-8的关系可能更为密切[9]。
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Hp感染胃粘膜造成的炎症反应除了IL-8以外，还有IL-1,IL-6,IL-10,IL-12等的作用，在细菌与上皮细胞之间存在着细胞因子网络的相互作用。细菌与宿主的免疫炎症反应最终导致了不同的疾病结果，有关这一机制有待进一步探讨。
参 考 文 献
1 Miehlke S, Kibler K, Kim JG, et al. Allelic variation in the cagA of Helicobacter pylori obtained from Korea compared to the United States. Am J Gastroenterol, 1996,91(7):1322
2 Eckmann L, Kagnoff MF, Fierere J. Epithelial cells secrete the chemokine interleukin-8 in response to bacterial entry. Infect Immun, 1993,61(11):4569
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3 Huang JZ, Otoole PW, Doig P, et al. Stimulation of inter- leukin-8 production in epithelial cell lines by Helicobacter pylori. Infect Immun, 1995,63(5):1732
4 Mai UEH, Perez-Perez GI, Allen JB, et al. Surface proteins from Helicobacter pylori exhibit chemotactic activity for human leukocytes and are present in gastric mucosa. J Exp Med, 1992,175(2):517
5 Ohta-Tada U, Takagi A, Koga Y, et al. Flagellin gene diversity among Helicobacter pylori strains and IL-8 secretion from gastric epithelial cells. Scand J Gastroenterol, 1997,32(5):455
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6 Crabtree JE, Covacci A, Farmery SM, et al. Helicobacter pylori induced interleukin-8 expression in gastric epithelial cells is associated with CagA positive phenotype. J Clin Pathol, 1995,48(1):41
7 Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. Molecular char- acterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(12):5791
8 Tummuru MKR, Cover TL, Blaser MJ. Cloning and expression of a high-molecular-mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immun, 1993,61(5):1799
9 Tummuru MKR, Sharma SA, Blaser MJ. Helicobacter pylori picB, a homologue of the Bordetella pertusis toxin secretion protein, is required for induction of IL-8 in gastric epithelial cells. Mol Microbiol, 1995,18(5):867
(1998-03-06收稿， 1998-07-06修回)
第二军医大学学报 1998 Oct; 19(5)∶454, 百拇医药