中国人感染幽门螺杆菌的基因分型及其临床意义
作者：杜奕奇 许国铭 纪徐淮 丁 华 张洪富 姚光弼△ 满晓华 孙振兴
单位：
关键词：幽门螺杆菌；cagA；聚合酶链反应
第二军医大学学报980516 摘要 目的：研究细胞毒素相关基因A(cagA)在幽门螺杆菌(Hp)菌株中的分布， 并初步探讨其应用价值。 方法： 采用特异性引物扩增Hp cagA的297 bp片段， 对74株临床分离Hp菌株进行PCR分型， 并与直接检测胃粘膜中cagA结果进行比较。 同时收集患者的胃镜诊断及胃窦病理资料， 分析cagA与不同上消化道疾病及胃粘膜局部形态学改变的关系。 结果： 90.5%的Hp菌株含cagA(cagA+, Ⅰ型)， 其中消化性溃疡患者Hp菌株cagA携带率(94.9%)高于慢性胃炎患者(85.7%)， 但无显著差异。 病理资料显示Ⅰ， Ⅱ型(cagA-)菌株均可引起胃窦的慢性炎症， 但严重程度Ⅱ型菌株高于Ⅰ型(P<0.05)， 二者在致活动性胃炎、 肠上皮化生、 胃粘膜萎缩及淋巴滤泡形成方面差异不显著。 PCR直接检测胃粘膜与检测Hp菌株中cagA的结果相近似。 结论： 中国人感染HpⅠ型菌株比例较西方国家高， 但cagA尚不能作为区分Hp感染致不同消化道疾病的单一指标。
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中国图书资料分类法分类号 R573.6
Distribution of cagA gene in Helicobacter pylori and its clinical significance
Du Yiqi, Xu Guoming, Ji Xuhuai, Ding Hua, Zhang Hongfu, Yao Guanbi, Man Xiaohua, Sun Zhenxing (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the distribution of cagA gene in Helicobacter pylori (Hp) and its clinical significance. Methods: Typing of Hp was determined by PCR in 74 clinical isolates by using one primer set for the cagA gene. Results: The prevalence of cagA gene in Hp isolates was 90.5%,the positive rate of cagA gene in peptic ulcer patients being 94.9%, higher than that in chronic gastritis patients (85.7%), though the difference was insignificant. Both typeⅠ (cagA+)and typeⅡ (cagA-) isolates led to chronic inflammation of antrum, though the former caused more severe inflammation than the latter. There was no significant difference in severity of active gastritis, intestinal metaplasia, atrophy and lymph folliciles. Conclusion: The high prevalence of cagA gene in Hp isolates from native patients indicates that cagA gene is common in Hp strains, and therefore, is not reliable as a single marker for the discrimination of Hp strains with respect to a specific disease.
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Key words Helicobacter pylori; cagA; polymerase chain reaction
为调查中国人感染幽门螺杆菌(Hp)菌株的毒力状况，我们筛选出74株Hp临床分离株，应用PCR方法检测Hp尿素酶(UreA)基因及细胞毒素相关基因A(cagA)，分析cagA的分子流行病学现状，并初步评价该基因与不同胃部疾病及胃粘膜病理改变严重程度的关系，同时探讨其应用价值。
1 材料和方法
1.1 菌株来源 1996年8月至1996年12月筛选出的74株临床分离的Hp菌株，来自男性患者50例,女性24例，年龄20～67岁，平均(43.2±11.6)岁。经内镜及病理诊断证实的十二指肠球部溃疡32例，胃溃疡4例，复合溃疡3例，慢性浅表性胃炎28例，萎缩性胃炎7例。每例患者均在胃镜检查同时分别于胃窦及胃体各活检1块组织行病理检查，胃窦另取活检2块分别行Hp培养及PCR检测。Hp标准菌株CCUG17874(cagA+)及G50(cagA-)由意大利IRIS研究中心提供。
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1.2 模板DNA的制备 取胃部疾病患者胃窦粘膜活检标本，于改良的Skirrow培养基中37℃微需氧条件下培养72 h。菌落经尿素酶、过氧化氢酶试验及革兰染色鉴定为Hp后，刮取菌落置200 μl冻存液中。采用煮沸裂解法制备细菌DNA模板：取1 μl Hp混悬液加入裂解液200 μl及蛋白酶K(终质量浓度200 μg/ml)，55℃水浴10 min，煮沸10 min，1×104 r/min离心5 min。取上清液5 μl用于PCR扩增。胃粘膜组织经研碎匀浆后，加入TE缓冲液和裂解液(各1/2体积)，余处理方法同上。
1.3 cagA的检测 PCR仪为Bio-Rad公司10216型基因合成仪。PCR引物参照文献[1]由中科院上海生化所合成，针对cagA保守区设计，D008: 5-ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAGCGA-3(1 751～1 778 nt), R008: 5-TTA GAA TAA TCA ACA AAC ATC ACG CCA T-3(2 021～2 048 nt),扩增靶片段长度为297 bp。PCR反应液体积50 μl，内含1 μmol/L D008-R008引物，2.0 U Taq DNA聚合酶(上海华顺试剂公司产品)，0.4 mmol/L dNTP, 2.0 mmol/L MgCl2。反应条件：94℃变性5 min，35个循环(94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min)，终止延伸72℃ 5 min。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳,0.5 μg/ml溴化乙锭染色,于紫外灯下显影。以菌株CCUG17874 DNA作为阳性对照,G50为阴性对照,去离子水作空白对照。
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1.4 UreA基因的检测 采用PCR试剂盒(上海中亚生物基因研究所)，反应体积25 μl，循环条件94℃ 4 min,38个循环(94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 90 s)，终止延伸72℃ 4 min。扩增Hp UreA基因600 bp片段。
2 结 果
2.1 UreA基因及cagA的检测 图1显示采用不同引物扩增Hp菌株所得PCR产物电泳结果，图2为部分临床分离株的检测结果。结果显示全部Hp菌株均含有UreA基因，其中90.5%(67/74)的菌株含有cagA。74例胃粘膜标本中均检测到Hp UreA基因；67例cagA+菌株相应胃粘膜中均检测到cagA，而其余7例胃粘膜检测均得到阴性结果，同直接检测菌株结果相比，二者符合率达100%。
2.2 cagA在不同上消化道疾病中的分布 消化性溃疡患者感染菌株cagA携带率94.9%(37/39)，高于慢性胃炎患者(85.7%,30/35)，但差异无显著性(P>0.05)。
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图 1 UreA及cagA PCR电泳结果
Fig 1 Electrophoresis results of UreA and cagA PCR
1:M-pBR322/MspⅠ; 2,4,6:cagA PCR products of clinical isolates, G50 and CCUG17874, respectively; 3,5,7:UreA PCR products of clinical isolates, G50 and CCUG17874, respectively
图 2 临床分离Hp菌株cagA PCR电泳结果
Fig 2 Electrophoresis results of cagA PCR
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in Hp clinical isolates
1:M-pBR322/MspⅠ; 2～6:Clinical isolates;
7:ddH2O; 8:G50; 9:CCUG17874
2.3 cagA在不同年龄、性别感染Hp患者中的分布 20～34岁、35～49岁和50～67岁年龄组患者感染的Hp菌株cagA阳性率分别为92.3%(12/13)，93.0%(40/43)和83.3%(15/18)，各年龄组间无显著差异；而男性患者阳性率为94.0%(47/50)，显著高于女性的83.3%(20/24)(P<0.05)。
2.4 cagA与胃粘膜病理改变严重程度的关系 74例胃窦、胃体粘膜活检标本均经过常规HE染色,参照悉尼胃炎分类标准[2]，分慢性炎症、活动性炎症、胃粘膜萎缩、肠上皮化生、淋巴滤泡形成5项，每项分0，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 4个等级(相当于无、轻、中、重)。其中活动性炎症指粘膜内见中性粒细胞浸润，0级：无中性粒细胞浸润；Ⅰ级：见少量、散在分布的中性粒细胞；Ⅱ级：介于Ⅰ级和Ⅲ级之间；Ⅲ级：大量中性粒细胞浸润或有组织坏死。慢性炎症指粘膜固有层内淋巴细胞、浆细胞等单个核细胞浸润。所有病理切片由专人观察、评定，以减少误差。
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结果显示， 全部cagA+或cagA-菌株均引起胃窦及胃体同时感染(严重程度为胃窦>胃体)。 经等级资料秩和检验显示， 7株cagA-菌株致胃窦慢性炎症的严重程度显著高于67株cagA+菌株(P<0.05)， 而二者在致活动性胃炎、 肠上皮化生、 胃粘膜萎缩及淋巴滤泡形成方面差异不显著 (表1)。
表 1 cagA与胃窦部粘膜病理改变的关系
Tab 1 The relation between cagA and pathologic change of antral mucosa Strains
Chronic inflammation
Active gastritis
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Atrophy
Intestinal metaplasia
Lymph folliciles
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
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Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
-
+
cagA+
0
37
16
14
49
, 百拇医药
8
4
6
59
7
0
1
59
8
0
0
50
17
cagA-
, 百拇医药
0
2*
0
5*
6
1
0
0
6
1
0
0
5
, 百拇医药
1
0
1
6
1
*P<0.05 vs cagA+
3 讨 论
已经证明Hp是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因，并且可能是致胃癌及粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的危险因素。cagA编码的细胞毒素相关抗原(CagA)是Hp主要的毒力因子之一，可作为评价Hp毒力的指标。
cagA总长约5 925 bp，包含一个3 440 bp的开放阅读框架(ORF)，G+C比例为37%。Tomb等[3]已于1997年完成了对Hp菌株26695全基因序列的测定，细胞空泡毒素(vacA)基因定位于Hp0887，有毒株与无毒株的VacA蛋白氨基末端和中心区存在序列差异，且该菌株与其他有毒株(CCUG17874，G39等)相比，VacA蛋白剪切位点序列不同。关于Hp致病基因的另一研究热点是Hp的“致病岛”(PAI)，它由多个cag基因组成，含29个ORF，插入子IS605将PAI分成cagⅠ及cagⅡ两个区域，cagA位于cagⅠ末端。目前认为PAI与Hp的毒力密切相关，但包括cagA在内的基因群的确切作用尚不清楚。基于Hp菌株在基因型及表型上的差异，可将临床分离株分为两型，即Ⅰ型(含cagA，表达CagA及VacA蛋白)和Ⅱ型(不含cagA，不表达CagA及VacA蛋白),另有部分中间型(仅表达CagA或VacA蛋白)存在。国外报道Ⅰ型菌株在临床分离株中约占76%～88%[5，6]。
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本研究采用针对Hp cagA保守区的特异性引物进行PCR检测，结果显示中国人感染HpⅠ型菌株(cagA+)约占90.5%，Ⅱ型菌株(cagA-)占9.5%,因未对CagA及VacA抗原进行检测，尚无法确定中间型的存在。中国患者Ⅰ型菌株比例高于发达国家,提示目前国内流行的Hp菌株可能在毒力性状上较国外强,亦可部分解释中国人较高的Hp相关消化道疾病的发生率。同时，由于Hp菌株的基因型受地理分布及环境的影响，这种差异可能还表现在cagA本身的序列改变。Miehlke[1]采用两对引物，引物1即本研究采用的引物，引物2扩增序列位于297 bp片段下游，长度为1 418 bp，PCR检测两组来自朝鲜及美国Hp菌株的cagA。结果显示，297 bp片段的检出率分别为98.3%及88.0%，而1.4 kb的产物仅在1.7%的朝鲜Hp分离物中检测到，提示本研究所选引物D008/R008特异性较强，适用于不同来源菌株的基因分型。同时亦表明Hp cagA的序列可能存在地理分布的差异。
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本研究显示，cagA在青年、中年、老年组中的分布无显著差异，而男性的阳性率高于女性，此结果需进一步证实。
尽管cagA已明确为评价Hp毒力的指标之一，且与其他cag家族基因共同构成Hp的“致病岛”，但其确切致病作用目前尚不清楚。本研究显示，cagA与十二指肠球部溃疡的发生无密切关系(P>0.05)，与Weel及Owen等[7,8]的研究结果类似。另外，Ⅱ型菌株(cagA-)由于缺乏活性毒素，在炎症反应中以单个核细胞浸润为主，易导致胃窦严重的、持续性的、慢性感染，在本研究中得到证实。cagA及PAI内的其他基因产物作为抗原可刺激胃内粘膜相关淋巴组织，引起B淋巴细胞异常增殖与分化，导致局部淋巴滤泡形成，因而可能与MALT淋巴瘤的发生有关。本组结果显示，Ⅰ型及Ⅱ型菌株在致活动性胃炎、胃粘膜萎缩、肠上皮化生的严重程度及淋巴滤泡的形成上无显著差异，可能与本研究Ⅱ型菌株数量较少有关。因此，cagA尚不能作为确定Hp感染致某种胃肠道疾病的单一指标。
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依据Hp部分基因组序列的差异进行基因分型的方法不同于微生物学分型， 前者有助于理解菌株的生物学行为及致病特性， 对指导临床诊断及Hp感染的治疗亦有重要意义。因条件及技术因素， 本研究仅采用了PCR方法， 若能结合Southern 杂交、 原位PCR等多种分子生物学方法进行研究， 则可避免单一方法的局限性， 值得在今后的研究中加以考虑。
参 考 文 献
1 Miehlke S, Kibler K, Jong BS, et al. Allelic variation in the cagA gene of Helicobacter pylori obtained from Korea compared to the United States. Am J Gastroenterol, 1996,91(7):1322
2 张锦坤. 悉尼胃炎新分类. 中华消化杂志, 1991,11(2):109
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3 Tomb JF, White O, Kerlavage AR, et al. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 1997,338(6642):539
4 Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. Molecular char- acterization of the 128kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(6):5791
5 Xiang Z, Censini S, Bayeli PF, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun, 1995,63(1):94
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6 Lage AP, Godfroid E, Fauconnier A, et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by PCR: comparison with other invasive techniques and detection of cagA gene in gastric biopsy specimens. J Clin Microbiol, 1995,33(10):2752
7 Weel JF, Hulst RW, Gerrits Y, et al. The interrelationship between cytotoxin-associated gene A, vacuolating cytotoxin, and Helicobacter pylori-related diseases. J Infect Dis, 1996,173(5):1171
8 Owen RJ, Hurtado A, Banatvala N, et al. Conservation of the cytotoxin-associated (cagA) gene of Helicobacter pylori and investigation of association with vacuolating-cytotoxin activity and gastroduodenal disease. FEMS Immunol Med Microbiol, 1994,9(3):307
(1998-02-19收稿，1998-06-01修回), 百拇医药
单位：
关键词：幽门螺杆菌；cagA；聚合酶链反应
第二军医大学学报980516 摘要 目的：研究细胞毒素相关基因A(cagA)在幽门螺杆菌(Hp)菌株中的分布， 并初步探讨其应用价值。 方法： 采用特异性引物扩增Hp cagA的297 bp片段， 对74株临床分离Hp菌株进行PCR分型， 并与直接检测胃粘膜中cagA结果进行比较。 同时收集患者的胃镜诊断及胃窦病理资料， 分析cagA与不同上消化道疾病及胃粘膜局部形态学改变的关系。 结果： 90.5%的Hp菌株含cagA(cagA+, Ⅰ型)， 其中消化性溃疡患者Hp菌株cagA携带率(94.9%)高于慢性胃炎患者(85.7%)， 但无显著差异。 病理资料显示Ⅰ， Ⅱ型(cagA-)菌株均可引起胃窦的慢性炎症， 但严重程度Ⅱ型菌株高于Ⅰ型(P<0.05)， 二者在致活动性胃炎、 肠上皮化生、 胃粘膜萎缩及淋巴滤泡形成方面差异不显著。 PCR直接检测胃粘膜与检测Hp菌株中cagA的结果相近似。 结论： 中国人感染HpⅠ型菌株比例较西方国家高， 但cagA尚不能作为区分Hp感染致不同消化道疾病的单一指标。
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中国图书资料分类法分类号 R573.6
Distribution of cagA gene in Helicobacter pylori and its clinical significance
Du Yiqi, Xu Guoming, Ji Xuhuai, Ding Hua, Zhang Hongfu, Yao Guanbi, Man Xiaohua, Sun Zhenxing (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the distribution of cagA gene in Helicobacter pylori (Hp) and its clinical significance. Methods: Typing of Hp was determined by PCR in 74 clinical isolates by using one primer set for the cagA gene. Results: The prevalence of cagA gene in Hp isolates was 90.5%,the positive rate of cagA gene in peptic ulcer patients being 94.9%, higher than that in chronic gastritis patients (85.7%), though the difference was insignificant. Both typeⅠ (cagA+)and typeⅡ (cagA-) isolates led to chronic inflammation of antrum, though the former caused more severe inflammation than the latter. There was no significant difference in severity of active gastritis, intestinal metaplasia, atrophy and lymph folliciles. Conclusion: The high prevalence of cagA gene in Hp isolates from native patients indicates that cagA gene is common in Hp strains, and therefore, is not reliable as a single marker for the discrimination of Hp strains with respect to a specific disease.
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Key words Helicobacter pylori; cagA; polymerase chain reaction
为调查中国人感染幽门螺杆菌(Hp)菌株的毒力状况，我们筛选出74株Hp临床分离株，应用PCR方法检测Hp尿素酶(UreA)基因及细胞毒素相关基因A(cagA)，分析cagA的分子流行病学现状，并初步评价该基因与不同胃部疾病及胃粘膜病理改变严重程度的关系，同时探讨其应用价值。
1 材料和方法
1.1 菌株来源 1996年8月至1996年12月筛选出的74株临床分离的Hp菌株，来自男性患者50例,女性24例，年龄20～67岁，平均(43.2±11.6)岁。经内镜及病理诊断证实的十二指肠球部溃疡32例，胃溃疡4例，复合溃疡3例，慢性浅表性胃炎28例，萎缩性胃炎7例。每例患者均在胃镜检查同时分别于胃窦及胃体各活检1块组织行病理检查，胃窦另取活检2块分别行Hp培养及PCR检测。Hp标准菌株CCUG17874(cagA+)及G50(cagA-)由意大利IRIS研究中心提供。
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1.2 模板DNA的制备 取胃部疾病患者胃窦粘膜活检标本，于改良的Skirrow培养基中37℃微需氧条件下培养72 h。菌落经尿素酶、过氧化氢酶试验及革兰染色鉴定为Hp后，刮取菌落置200 μl冻存液中。采用煮沸裂解法制备细菌DNA模板：取1 μl Hp混悬液加入裂解液200 μl及蛋白酶K(终质量浓度200 μg/ml)，55℃水浴10 min，煮沸10 min，1×104 r/min离心5 min。取上清液5 μl用于PCR扩增。胃粘膜组织经研碎匀浆后，加入TE缓冲液和裂解液(各1/2体积)，余处理方法同上。
1.3 cagA的检测 PCR仪为Bio-Rad公司10216型基因合成仪。PCR引物参照文献[1]由中科院上海生化所合成，针对cagA保守区设计，D008: 5-ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAGCGA-3(1 751～1 778 nt), R008: 5-TTA GAA TAA TCA ACA AAC ATC ACG CCA T-3(2 021～2 048 nt),扩增靶片段长度为297 bp。PCR反应液体积50 μl，内含1 μmol/L D008-R008引物，2.0 U Taq DNA聚合酶(上海华顺试剂公司产品)，0.4 mmol/L dNTP, 2.0 mmol/L MgCl2。反应条件：94℃变性5 min，35个循环(94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min)，终止延伸72℃ 5 min。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳,0.5 μg/ml溴化乙锭染色,于紫外灯下显影。以菌株CCUG17874 DNA作为阳性对照,G50为阴性对照,去离子水作空白对照。
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1.4 UreA基因的检测 采用PCR试剂盒(上海中亚生物基因研究所)，反应体积25 μl，循环条件94℃ 4 min,38个循环(94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 90 s)，终止延伸72℃ 4 min。扩增Hp UreA基因600 bp片段。
2 结 果
2.1 UreA基因及cagA的检测 图1显示采用不同引物扩增Hp菌株所得PCR产物电泳结果，图2为部分临床分离株的检测结果。结果显示全部Hp菌株均含有UreA基因，其中90.5%(67/74)的菌株含有cagA。74例胃粘膜标本中均检测到Hp UreA基因；67例cagA+菌株相应胃粘膜中均检测到cagA，而其余7例胃粘膜检测均得到阴性结果，同直接检测菌株结果相比，二者符合率达100%。
2.2 cagA在不同上消化道疾病中的分布 消化性溃疡患者感染菌株cagA携带率94.9%(37/39)，高于慢性胃炎患者(85.7%,30/35)，但差异无显著性(P>0.05)。
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图 1 UreA及cagA PCR电泳结果
Fig 1 Electrophoresis results of UreA and cagA PCR
1:M-pBR322/MspⅠ; 2,4,6:cagA PCR products of clinical isolates, G50 and CCUG17874, respectively; 3,5,7:UreA PCR products of clinical isolates, G50 and CCUG17874, respectively
图 2 临床分离Hp菌株cagA PCR电泳结果
Fig 2 Electrophoresis results of cagA PCR
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in Hp clinical isolates
1:M-pBR322/MspⅠ; 2～6:Clinical isolates;
7:ddH2O; 8:G50; 9:CCUG17874
2.3 cagA在不同年龄、性别感染Hp患者中的分布 20～34岁、35～49岁和50～67岁年龄组患者感染的Hp菌株cagA阳性率分别为92.3%(12/13)，93.0%(40/43)和83.3%(15/18)，各年龄组间无显著差异；而男性患者阳性率为94.0%(47/50)，显著高于女性的83.3%(20/24)(P<0.05)。
2.4 cagA与胃粘膜病理改变严重程度的关系 74例胃窦、胃体粘膜活检标本均经过常规HE染色,参照悉尼胃炎分类标准[2]，分慢性炎症、活动性炎症、胃粘膜萎缩、肠上皮化生、淋巴滤泡形成5项，每项分0，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 4个等级(相当于无、轻、中、重)。其中活动性炎症指粘膜内见中性粒细胞浸润，0级：无中性粒细胞浸润；Ⅰ级：见少量、散在分布的中性粒细胞；Ⅱ级：介于Ⅰ级和Ⅲ级之间；Ⅲ级：大量中性粒细胞浸润或有组织坏死。慢性炎症指粘膜固有层内淋巴细胞、浆细胞等单个核细胞浸润。所有病理切片由专人观察、评定，以减少误差。
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结果显示， 全部cagA+或cagA-菌株均引起胃窦及胃体同时感染(严重程度为胃窦>胃体)。 经等级资料秩和检验显示， 7株cagA-菌株致胃窦慢性炎症的严重程度显著高于67株cagA+菌株(P<0.05)， 而二者在致活动性胃炎、 肠上皮化生、 胃粘膜萎缩及淋巴滤泡形成方面差异不显著 (表1)。
表 1 cagA与胃窦部粘膜病理改变的关系
Tab 1 The relation between cagA and pathologic change of antral mucosa Strains
Chronic inflammation
Active gastritis
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Atrophy
Intestinal metaplasia
Lymph folliciles
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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Ⅰ
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Ⅱ
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3 讨 论
已经证明Hp是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因，并且可能是致胃癌及粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的危险因素。cagA编码的细胞毒素相关抗原(CagA)是Hp主要的毒力因子之一，可作为评价Hp毒力的指标。
cagA总长约5 925 bp，包含一个3 440 bp的开放阅读框架(ORF)，G+C比例为37%。Tomb等[3]已于1997年完成了对Hp菌株26695全基因序列的测定，细胞空泡毒素(vacA)基因定位于Hp0887，有毒株与无毒株的VacA蛋白氨基末端和中心区存在序列差异，且该菌株与其他有毒株(CCUG17874，G39等)相比，VacA蛋白剪切位点序列不同。关于Hp致病基因的另一研究热点是Hp的“致病岛”(PAI)，它由多个cag基因组成，含29个ORF，插入子IS605将PAI分成cagⅠ及cagⅡ两个区域，cagA位于cagⅠ末端。目前认为PAI与Hp的毒力密切相关，但包括cagA在内的基因群的确切作用尚不清楚。基于Hp菌株在基因型及表型上的差异，可将临床分离株分为两型，即Ⅰ型(含cagA，表达CagA及VacA蛋白)和Ⅱ型(不含cagA，不表达CagA及VacA蛋白),另有部分中间型(仅表达CagA或VacA蛋白)存在。国外报道Ⅰ型菌株在临床分离株中约占76%～88%[5，6]。
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本研究采用针对Hp cagA保守区的特异性引物进行PCR检测，结果显示中国人感染HpⅠ型菌株(cagA+)约占90.5%，Ⅱ型菌株(cagA-)占9.5%,因未对CagA及VacA抗原进行检测，尚无法确定中间型的存在。中国患者Ⅰ型菌株比例高于发达国家,提示目前国内流行的Hp菌株可能在毒力性状上较国外强,亦可部分解释中国人较高的Hp相关消化道疾病的发生率。同时，由于Hp菌株的基因型受地理分布及环境的影响，这种差异可能还表现在cagA本身的序列改变。Miehlke[1]采用两对引物，引物1即本研究采用的引物，引物2扩增序列位于297 bp片段下游，长度为1 418 bp，PCR检测两组来自朝鲜及美国Hp菌株的cagA。结果显示，297 bp片段的检出率分别为98.3%及88.0%，而1.4 kb的产物仅在1.7%的朝鲜Hp分离物中检测到，提示本研究所选引物D008/R008特异性较强，适用于不同来源菌株的基因分型。同时亦表明Hp cagA的序列可能存在地理分布的差异。
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本研究显示，cagA在青年、中年、老年组中的分布无显著差异，而男性的阳性率高于女性，此结果需进一步证实。
尽管cagA已明确为评价Hp毒力的指标之一，且与其他cag家族基因共同构成Hp的“致病岛”，但其确切致病作用目前尚不清楚。本研究显示，cagA与十二指肠球部溃疡的发生无密切关系(P>0.05)，与Weel及Owen等[7,8]的研究结果类似。另外，Ⅱ型菌株(cagA-)由于缺乏活性毒素，在炎症反应中以单个核细胞浸润为主，易导致胃窦严重的、持续性的、慢性感染，在本研究中得到证实。cagA及PAI内的其他基因产物作为抗原可刺激胃内粘膜相关淋巴组织，引起B淋巴细胞异常增殖与分化，导致局部淋巴滤泡形成，因而可能与MALT淋巴瘤的发生有关。本组结果显示，Ⅰ型及Ⅱ型菌株在致活动性胃炎、胃粘膜萎缩、肠上皮化生的严重程度及淋巴滤泡的形成上无显著差异，可能与本研究Ⅱ型菌株数量较少有关。因此，cagA尚不能作为确定Hp感染致某种胃肠道疾病的单一指标。
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依据Hp部分基因组序列的差异进行基因分型的方法不同于微生物学分型， 前者有助于理解菌株的生物学行为及致病特性， 对指导临床诊断及Hp感染的治疗亦有重要意义。因条件及技术因素， 本研究仅采用了PCR方法， 若能结合Southern 杂交、 原位PCR等多种分子生物学方法进行研究， 则可避免单一方法的局限性， 值得在今后的研究中加以考虑。
参 考 文 献
1 Miehlke S, Kibler K, Jong BS, et al. Allelic variation in the cagA gene of Helicobacter pylori obtained from Korea compared to the United States. Am J Gastroenterol, 1996,91(7):1322
2 张锦坤. 悉尼胃炎新分类. 中华消化杂志, 1991,11(2):109
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3 Tomb JF, White O, Kerlavage AR, et al. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 1997,338(6642):539
4 Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. Molecular char- acterization of the 128kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(6):5791
5 Xiang Z, Censini S, Bayeli PF, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun, 1995,63(1):94
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6 Lage AP, Godfroid E, Fauconnier A, et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by PCR: comparison with other invasive techniques and detection of cagA gene in gastric biopsy specimens. J Clin Microbiol, 1995,33(10):2752
7 Weel JF, Hulst RW, Gerrits Y, et al. The interrelationship between cytotoxin-associated gene A, vacuolating cytotoxin, and Helicobacter pylori-related diseases. J Infect Dis, 1996,173(5):1171
8 Owen RJ, Hurtado A, Banatvala N, et al. Conservation of the cytotoxin-associated (cagA) gene of Helicobacter pylori and investigation of association with vacuolating-cytotoxin activity and gastroduodenal disease. FEMS Immunol Med Microbiol, 1994,9(3):307
(1998-02-19收稿，1998-06-01修回), 百拇医药