人胰腺癌CD44蛋白表达
作者：郑劲草 许国铭 李淑德 李兆申
单位：第二军医大学长海医院消化内科,上海，200433； △浙江省建德市第三人民医院内科； ▲山东省滕州市财贸医院内科； □西安市中心医院消化科 张永飞，男，1968年6月生，主治医师
关键词：胰腺肿瘤；粘附分子；浸润；转移
第二军医大学学报980513 摘要 目的：探讨CD44蛋白表达与人胰腺癌浸润、转移的关系。方法：应用特异的鼠抗人CD44标准型、变异型单抗及流式细胞和免疫组化技术，研究CD44蛋白在人胰腺癌细胞株和胰腺癌组织标本中的表达。结果：人胰腺癌组织CD44变异型之一的CD44v9表达较非肿瘤组织明显升高(P<0.05),CD44v9的表达与胰腺癌的浸润、转移和分化程度有关。结论：CD44变异型表达可作为胰腺癌分化、浸润和转移的潜在指标。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R735.9
Expression of CD44 protein in human pancreatic adenocarcinoma
Zheng Jingcao, Xu Guoming, Li Shude, Li Zhaoshen (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To investigate the relationship between the expression of cluster of differentiation 44 (CD44) and the infiltration and metastasis of human pancreatic adenocarcinoma. Methods: Flow cytometry and immunohistochemical methods were used to detect the expression of CD44 standard (CD44s) and variant isoforms (CD44v) in human pancreatic carcinoma cell lines (PaTu8988 and SW1990) and tissue sample. Results: At protein level, up-regulated expression of CD44v9 was correlated with infiltration and metastasis as well as tumor differentiation of human pancreatic adenocarcinoma (P<0.05). Conclusion: The over expression of CD44v9 protein may play a role in the infiltration and metastasis of human pancreatic adenocarcinoma, and may be a potential marker of tumor differentiation.
, http://www.100md.com
Key words pancreatic neoplasms; adhesion molecules; infiltration; metastasis
CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白,属于细胞表面粘附分子,主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连过程。CD44标准型(CD44s)在人体许多正常组织中均有表达,而CD44变异型(CD44v)的表达情况不论在正常组织还是肿瘤中都有很大差异[1]。文献报道CD44v表达与胃癌、结肠癌及非霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤的转移和预后有关[2]。本试验通过流式细胞和免疫组化技术,检测两株不同分化程度和转移潜能的人胰腺癌细胞株以及人胰腺癌组织CD44基因的蛋白表达,探讨CD44v表达在胰腺癌浸润、转移中的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞和组织 人胰腺癌细胞株由德国Phillips大学分子生物学和分子病理学研究所Elsasser博士惠赠。SW1990来源于一中度分化胰腺导管上皮癌患者, 具有转移能力。PaTu8988来源于一低度分化胰腺癌患者。32例人胰腺癌组织材料均取自长海医院1994年1月至1996年12月住院手术切除标本, 同时取癌切缘非肿瘤组织19例作对照。32例胰腺癌患者中, 男性20例， 女性12例, 年龄32～76岁, 平均(59.47±10.32)岁。根据胰腺导管分化程度、 肿瘤异质性及有丝分裂相多少, 进行组织学分类, G1期(高度分化)12例, G2期(中度分化)9例, G3期(低度分化)11例。根据肿瘤TNM分期, 临床Ⅰ期者2例, Ⅱ期者7例, Ⅲ期者11例, Ⅳ期者12例。根据有无淋巴结转移， 分为转移组23例和无转移组9例。肿瘤位于胰头部25例, 胰尾部7例。标本经4%甲醛溶液固定, 石蜡包埋, 切片厚度为5 μm。
, http://www.100md.com
1.2 试剂和仪器 CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4单抗由瑞士Basel免疫研究所Gunthert博士惠赠。FITC标记的羊抗鼠IgG，ABC试剂盒购自华美生物工程技术公司。FACStar Plus流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。Nikon荧光显微镜。
1.3 流式细胞分析 (1)PaTu8988和SW1990细胞在含15%小牛血清的DMEM培养液、37℃，5% CO2培养箱中生长。取对数生长期70%融合的细胞,0.25%胰酶消化,0.15 mol/L PBS (pH7.2)洗2次后离心去上清。(2) 用PBS液将细胞浓度调至1×106个/ml,取20 μl该细胞液与10 μl CD44单抗原液混匀,室温孵育30 min。(3) PBS洗3次后与FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶40)混匀，4℃静置30 min。(4) PBS洗2次,调细胞浓度至1×106个/ml后用流式细胞仪分析,每次计数2万个细胞,根据荧光强度确定CD44蛋白表达量。对照组不加一抗,其余步骤同上。
, 百拇医药
1.4 免疫组化 每一标本均先作常规HE染色。石蜡切片脱蜡至水,3% H2O2-CH3OH溶液去除内源性过氧化物酶。与正常马血清孵育后，加适当稀释度一抗于4℃过夜。随后依次加生物素标记二抗和ABC复合物,DAB显色,苏木素衬染,封片。对照组以PBS代替一抗,结果为阴性。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 流式细胞仪分析结果 免疫荧光染色显示，CD44染色主要位于细胞膜上。PaTu8988和SW1990均表达CD44s,而CD44v9主要在SW1990细胞上表达。两株细胞上CD44v6和CD44v4表达信号均很弱。流式细胞仪定量检测CD44蛋白表达结果见表1。
, 百拇医药
表 1 人胰腺癌细胞株CD44蛋白表达
Tab 1 Expression of CD44 protein in human
pancreatic adenocarcinoma cell lines(%) Cell lines
CD44s
CD44v9
CD44v6
CD44v4
SW1990
91.89
, http://www.100md.com 91.96
2.16
1.27
Patu8988
93.69
0.39
0.72
0.75
2.2 免疫组化 细胞膜着棕色,胞浆内也有部分染色(图1中箭头所指，图见封四)为CD44表达阳性。肿瘤组织和非肿瘤组织均表达CD44s,而CD44v6和CD44v4染色均为阴性。CD44v9在胰腺肿瘤组织和非胰腺肿瘤组织表达阳性率分别为71.9%(23/32)，42.1%(8/19),χ2=4.91(P<0.05)。CD44v9表达与胰腺癌组织学分级、临床分期、淋巴结转移及肿瘤部位的关系见表2。
, 百拇医药
图1 免疫组化测定CD44v9在胰腺癌组织中的表达
Fig1 Immunohistochemical deteetion of CD44v9 isoforms in human pancreatic adenocarcinoma tissue
A:Nornal pancreatic tissue(×240)；B：Pancreatic adenocarcinoma with high differentiation grade(×120);C:Pancreatic adenocarcinoma with low differentiatin grade(×120);D:Neighboring normal pancreatic tissue(×120)
表 2 CD44v9蛋白在胰腺肿瘤组织中的表达
, 百拇医药
Tab 2 Expression of CD44v9 protein in
human pancreatic adenocarcinoma tissue Pathological
details
n
Cases of CD44v9
positive staining
Accordant
percentage (%)
Histologic grade
, 百拇医药
Ⅰ
12
10
83.3
Ⅱ
9
8
88.9
Ⅲ
11
5
45.5*
Clinical stage
, 百拇医药
Ⅰ
2
1
50.0
Ⅱ
7
4
57.1
Ⅲ
11
8
72.7
Ⅳ
12
, 百拇医药
10
83.3△
Lymph node metastasis
Positive
23
20
86.9▲▲
Negative
9
3
33.3
Tumor location
, 百拇医药
Head
25
17
68.0
Corpus-Tail
7
6
85.7
*P<0.05 vs grade 1 or 2；△P<0.05 vs clinical stage Ⅰ，Ⅱ orⅢ； ▲▲P<0.05 vs lymph node negative
3 讨 论
, http://www.100md.com
CD44是分布广泛的细胞表面粘附分子。由于外显子选择性剪切，CD44分子可形成多种亚型，其主要功能包括介导淋巴细胞与后毛细血管小静脉的内皮细胞结合,使淋巴细胞穿过血管壁回到淋巴组织;参与淋巴细胞的激活过程;与细胞外基质分子如透明质酸结合,参与细胞迁移活动[2,3]。近年来CD44变异型表达与肿瘤浸润、转移的关系成为研究热点。研究者较为一致的观点认为，CD44变异型表达增加，使肿瘤细胞具有更强的侵袭能力，其具体机制仍有待阐明。本研究采用流式细胞和免疫组化技术检测CD44在人胰腺癌细胞株和组织标本上的蛋白表达,结果显示CD44变异型的表达与胰腺癌的浸润、转移和分化程度有关。
肿瘤细胞的浸润、转移可能利用了体内正常的生理过程中的某些机制。CD44变异型的表达发生改变,使肿瘤细胞与基质分子的粘附力降低，肿瘤细胞从原发部位脱离并侵袭周围组织,发生血行和淋巴转移[4,5]。本研究在人胰腺癌细胞株和组织标本上的结果一致,初步表明CD44v9的表达与胰腺癌的临床分期、有无淋巴结转移和组织学分级有关,而与肿瘤生长部位无关。在晚期胰腺癌组以及肿瘤呈浸润生长、淋巴结转移阳性组,CD44v9的表达明显增强。同时,CD44v9表达与组织学分级有一定关系,分化型癌CD44v9的表达较未分化型癌增强。Mayer等在胃癌,Terpe等在肾癌中也发现,CD44v9的表达增强与预后不良有关；早期结肠腺瘤中即有CD44v9的较强表达[6，7]。由于空间构型的影响，肿瘤细胞上CD44v9的表达增加可使其与基质透明质酸的结合力减弱，从而有利于肿瘤细胞发生局部浸润[5]。胰腺癌发生转移首先以侵袭相邻器官为主要表现，而对乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤等首先发生淋巴和血行转移的肿瘤类型，CD44v6可作为一项独立的预后不良指标[6,7]。因此，CD44变异型的表达无疑在肿瘤的浸润、转移过程中起着一定作用,但不同的肿瘤侵袭表型CD44v剪切表达存在多样性。尚需进一步了解CD44基因家族的功能,尤其是阐明CD44变异型与其特异受体之间的具体作用机制，以便提高肿瘤基因诊断的准确率和采取相应的治疗措施。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Mackay CR, Terpe HJ, Stauder R, et al. Expression and modulation of CD44 variant isoforms in humans. J Cell Biol, 1994,124(1/2):71
2 金顺钱, 张 伟. CD44的变异性表达和肿瘤转移. 国外医学*分子生物学分册，1994，16(2):58
3 Stauder R, Gunthert U. CD44 isoforms impact on lymphocyte activation and differentiation. Immunologist,1995,3(3):78
4 Koopman G, Heider KH, Horst E, et al. Activated human lymphocytes and aggressive non-Hodgkins lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J Exp Med, 1993,177(4):897
, http://www.100md.com
5 Stamenkovic I, Aruffo A, Amiot M, et al. The hematopoietic and epithelial forms of CD44 are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate-bearing cells. EMBO J, 1991, 10(2):343
6 Gunthert U, Stauder R, Mayer B, et al. Are CD44 variant isoforms involved in human tumor progression? Cancer Surv, 1995,24(1):19
7 Gunthert U. CD44 in malignant disorders.Curr Top Microbiol Immunol,1996,213/I:271
(1998-02-20收稿，1998-06-29修回)
张永飞，男，1968年6月生，主治医师, 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院消化内科,上海，200433； △浙江省建德市第三人民医院内科； ▲山东省滕州市财贸医院内科； □西安市中心医院消化科 张永飞，男，1968年6月生，主治医师
关键词：胰腺肿瘤；粘附分子；浸润；转移
第二军医大学学报980513 摘要 目的：探讨CD44蛋白表达与人胰腺癌浸润、转移的关系。方法：应用特异的鼠抗人CD44标准型、变异型单抗及流式细胞和免疫组化技术，研究CD44蛋白在人胰腺癌细胞株和胰腺癌组织标本中的表达。结果：人胰腺癌组织CD44变异型之一的CD44v9表达较非肿瘤组织明显升高(P<0.05),CD44v9的表达与胰腺癌的浸润、转移和分化程度有关。结论：CD44变异型表达可作为胰腺癌分化、浸润和转移的潜在指标。
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中国图书资料分类法分类号 R735.9
Expression of CD44 protein in human pancreatic adenocarcinoma
Zheng Jingcao, Xu Guoming, Li Shude, Li Zhaoshen (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To investigate the relationship between the expression of cluster of differentiation 44 (CD44) and the infiltration and metastasis of human pancreatic adenocarcinoma. Methods: Flow cytometry and immunohistochemical methods were used to detect the expression of CD44 standard (CD44s) and variant isoforms (CD44v) in human pancreatic carcinoma cell lines (PaTu8988 and SW1990) and tissue sample. Results: At protein level, up-regulated expression of CD44v9 was correlated with infiltration and metastasis as well as tumor differentiation of human pancreatic adenocarcinoma (P<0.05). Conclusion: The over expression of CD44v9 protein may play a role in the infiltration and metastasis of human pancreatic adenocarcinoma, and may be a potential marker of tumor differentiation.
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Key words pancreatic neoplasms; adhesion molecules; infiltration; metastasis
CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白,属于细胞表面粘附分子,主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连过程。CD44标准型(CD44s)在人体许多正常组织中均有表达,而CD44变异型(CD44v)的表达情况不论在正常组织还是肿瘤中都有很大差异[1]。文献报道CD44v表达与胃癌、结肠癌及非霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤的转移和预后有关[2]。本试验通过流式细胞和免疫组化技术,检测两株不同分化程度和转移潜能的人胰腺癌细胞株以及人胰腺癌组织CD44基因的蛋白表达,探讨CD44v表达在胰腺癌浸润、转移中的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞和组织 人胰腺癌细胞株由德国Phillips大学分子生物学和分子病理学研究所Elsasser博士惠赠。SW1990来源于一中度分化胰腺导管上皮癌患者, 具有转移能力。PaTu8988来源于一低度分化胰腺癌患者。32例人胰腺癌组织材料均取自长海医院1994年1月至1996年12月住院手术切除标本, 同时取癌切缘非肿瘤组织19例作对照。32例胰腺癌患者中, 男性20例， 女性12例, 年龄32～76岁, 平均(59.47±10.32)岁。根据胰腺导管分化程度、 肿瘤异质性及有丝分裂相多少, 进行组织学分类, G1期(高度分化)12例, G2期(中度分化)9例, G3期(低度分化)11例。根据肿瘤TNM分期, 临床Ⅰ期者2例, Ⅱ期者7例, Ⅲ期者11例, Ⅳ期者12例。根据有无淋巴结转移， 分为转移组23例和无转移组9例。肿瘤位于胰头部25例, 胰尾部7例。标本经4%甲醛溶液固定, 石蜡包埋, 切片厚度为5 μm。
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1.2 试剂和仪器 CD44s，CD44v9，CD44v6和CD44v4单抗由瑞士Basel免疫研究所Gunthert博士惠赠。FITC标记的羊抗鼠IgG，ABC试剂盒购自华美生物工程技术公司。FACStar Plus流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。Nikon荧光显微镜。
1.3 流式细胞分析 (1)PaTu8988和SW1990细胞在含15%小牛血清的DMEM培养液、37℃，5% CO2培养箱中生长。取对数生长期70%融合的细胞,0.25%胰酶消化,0.15 mol/L PBS (pH7.2)洗2次后离心去上清。(2) 用PBS液将细胞浓度调至1×106个/ml,取20 μl该细胞液与10 μl CD44单抗原液混匀,室温孵育30 min。(3) PBS洗3次后与FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶40)混匀，4℃静置30 min。(4) PBS洗2次,调细胞浓度至1×106个/ml后用流式细胞仪分析,每次计数2万个细胞,根据荧光强度确定CD44蛋白表达量。对照组不加一抗,其余步骤同上。
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1.4 免疫组化 每一标本均先作常规HE染色。石蜡切片脱蜡至水,3% H2O2-CH3OH溶液去除内源性过氧化物酶。与正常马血清孵育后，加适当稀释度一抗于4℃过夜。随后依次加生物素标记二抗和ABC复合物,DAB显色,苏木素衬染,封片。对照组以PBS代替一抗,结果为阴性。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 流式细胞仪分析结果 免疫荧光染色显示，CD44染色主要位于细胞膜上。PaTu8988和SW1990均表达CD44s,而CD44v9主要在SW1990细胞上表达。两株细胞上CD44v6和CD44v4表达信号均很弱。流式细胞仪定量检测CD44蛋白表达结果见表1。
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表 1 人胰腺癌细胞株CD44蛋白表达
Tab 1 Expression of CD44 protein in human
pancreatic adenocarcinoma cell lines(%) Cell lines
CD44s
CD44v9
CD44v6
CD44v4
SW1990
91.89
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2.16
1.27
Patu8988
93.69
0.39
0.72
0.75
2.2 免疫组化 细胞膜着棕色,胞浆内也有部分染色(图1中箭头所指，图见封四)为CD44表达阳性。肿瘤组织和非肿瘤组织均表达CD44s,而CD44v6和CD44v4染色均为阴性。CD44v9在胰腺肿瘤组织和非胰腺肿瘤组织表达阳性率分别为71.9%(23/32)，42.1%(8/19),χ2=4.91(P<0.05)。CD44v9表达与胰腺癌组织学分级、临床分期、淋巴结转移及肿瘤部位的关系见表2。
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图1 免疫组化测定CD44v9在胰腺癌组织中的表达
Fig1 Immunohistochemical deteetion of CD44v9 isoforms in human pancreatic adenocarcinoma tissue
A:Nornal pancreatic tissue(×240)；B：Pancreatic adenocarcinoma with high differentiation grade(×120);C:Pancreatic adenocarcinoma with low differentiatin grade(×120);D:Neighboring normal pancreatic tissue(×120)
表 2 CD44v9蛋白在胰腺肿瘤组织中的表达
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Tab 2 Expression of CD44v9 protein in
human pancreatic adenocarcinoma tissue Pathological
details
n
Cases of CD44v9
positive staining
Accordant
percentage (%)
Histologic grade
, 百拇医药
Ⅰ
12
10
83.3
Ⅱ
9
8
88.9
Ⅲ
11
5
45.5*
Clinical stage
, 百拇医药
Ⅰ
2
1
50.0
Ⅱ
7
4
57.1
Ⅲ
11
8
72.7
Ⅳ
12
, 百拇医药
10
83.3△
Lymph node metastasis
Positive
23
20
86.9▲▲
Negative
9
3
33.3
Tumor location
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Head
25
17
68.0
Corpus-Tail
7
6
85.7
*P<0.05 vs grade 1 or 2；△P<0.05 vs clinical stage Ⅰ，Ⅱ orⅢ； ▲▲P<0.05 vs lymph node negative
3 讨 论
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CD44是分布广泛的细胞表面粘附分子。由于外显子选择性剪切，CD44分子可形成多种亚型，其主要功能包括介导淋巴细胞与后毛细血管小静脉的内皮细胞结合,使淋巴细胞穿过血管壁回到淋巴组织;参与淋巴细胞的激活过程;与细胞外基质分子如透明质酸结合,参与细胞迁移活动[2,3]。近年来CD44变异型表达与肿瘤浸润、转移的关系成为研究热点。研究者较为一致的观点认为，CD44变异型表达增加，使肿瘤细胞具有更强的侵袭能力，其具体机制仍有待阐明。本研究采用流式细胞和免疫组化技术检测CD44在人胰腺癌细胞株和组织标本上的蛋白表达,结果显示CD44变异型的表达与胰腺癌的浸润、转移和分化程度有关。
肿瘤细胞的浸润、转移可能利用了体内正常的生理过程中的某些机制。CD44变异型的表达发生改变,使肿瘤细胞与基质分子的粘附力降低，肿瘤细胞从原发部位脱离并侵袭周围组织,发生血行和淋巴转移[4,5]。本研究在人胰腺癌细胞株和组织标本上的结果一致,初步表明CD44v9的表达与胰腺癌的临床分期、有无淋巴结转移和组织学分级有关,而与肿瘤生长部位无关。在晚期胰腺癌组以及肿瘤呈浸润生长、淋巴结转移阳性组,CD44v9的表达明显增强。同时,CD44v9表达与组织学分级有一定关系,分化型癌CD44v9的表达较未分化型癌增强。Mayer等在胃癌,Terpe等在肾癌中也发现,CD44v9的表达增强与预后不良有关；早期结肠腺瘤中即有CD44v9的较强表达[6，7]。由于空间构型的影响，肿瘤细胞上CD44v9的表达增加可使其与基质透明质酸的结合力减弱，从而有利于肿瘤细胞发生局部浸润[5]。胰腺癌发生转移首先以侵袭相邻器官为主要表现，而对乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤等首先发生淋巴和血行转移的肿瘤类型，CD44v6可作为一项独立的预后不良指标[6,7]。因此，CD44变异型的表达无疑在肿瘤的浸润、转移过程中起着一定作用,但不同的肿瘤侵袭表型CD44v剪切表达存在多样性。尚需进一步了解CD44基因家族的功能,尤其是阐明CD44变异型与其特异受体之间的具体作用机制，以便提高肿瘤基因诊断的准确率和采取相应的治疗措施。
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参 考 文 献
1 Mackay CR, Terpe HJ, Stauder R, et al. Expression and modulation of CD44 variant isoforms in humans. J Cell Biol, 1994,124(1/2):71
2 金顺钱, 张 伟. CD44的变异性表达和肿瘤转移. 国外医学*分子生物学分册，1994，16(2):58
3 Stauder R, Gunthert U. CD44 isoforms impact on lymphocyte activation and differentiation. Immunologist,1995,3(3):78
4 Koopman G, Heider KH, Horst E, et al. Activated human lymphocytes and aggressive non-Hodgkins lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J Exp Med, 1993,177(4):897
, http://www.100md.com
5 Stamenkovic I, Aruffo A, Amiot M, et al. The hematopoietic and epithelial forms of CD44 are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate-bearing cells. EMBO J, 1991, 10(2):343
6 Gunthert U, Stauder R, Mayer B, et al. Are CD44 variant isoforms involved in human tumor progression? Cancer Surv, 1995,24(1):19
7 Gunthert U. CD44 in malignant disorders.Curr Top Microbiol Immunol,1996,213/I:271
(1998-02-20收稿，1998-06-29修回)
张永飞，男，1968年6月生，主治医师, 百拇医药