P16蛋白在肺癌中的表达及其临床意义
作者：郭永庆 关钧 葛炳生 范慕贞 赵风瑞 赵洪昌
单位：100029 北京，中日友好医院胸外科(郭永庆、葛炳生、赵风瑞、赵洪昌)，临床医学研究所生化及分子生物学室(关钧、范慕贞)
关键词：肺肿瘤；P16蛋白；免疫组织化学
中华医学杂志980512 【摘要】 目的 探讨抑癌基因p16与肺癌预后的关系。方法 应用SP免疫组织化学方法对76例肺癌标本中CDKN2抑癌基因P16蛋白表达进行了研究。结果 76例肺癌标本中P16蛋白表达阳性率为45%(34/76)。其中鳞癌的阳性率为52%(23/44)，腺癌为29%(7/24)，二者比较差异有显著意义(P<0.05)。P16蛋白表达与肺癌的病理分级及预后呈显著相关性(P<0.05)。结论 p16基因对肺癌的发生发展有着重要意义。
P16 expression in lung cancer and its significance Guo Yongqing, Guan Jun, Ge Bingsheng, et al. Department of Thoracic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029
, 百拇医药
【Abstract 】 Objective To study the relationship of suppressor gene p16 and lung cancer for prognosis evaluation. Methods Immunohistochemical method was used to detect and analyse the expression of P16 protein of CDKN2 suppressor gene of 76 cases in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens of human lung cancer. Results P16 positive rate was 45%: 52% for 23 of 44 cases of squamous carcinoma and 29% for 7 of 24 cases of adenocarcinoma. Differentiation degree and prognosis of lung cancer were associated significantly with P16 expression. P16 expression was somewhat related to clinical stage. Conclusion p16 gene plays a key role in the prognosis of patients with lung cancer.
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【Key words 】 Lung neoplasms P16 protein Immunohistochemistry
(Natl Med J China, 1998, 78:354-355)
1994年Kamb等[1]与Nobori等[2]同时发现一种新型抑癌基因——CDKN2基因。其外显子2编码为16 000分子量的蛋白，即P16蛋白。为了探讨P16蛋白在肺癌中的表达及意义，我们对76例人肺癌组织标本进行了检测，报道如下。
对象与方法
一、对象
为1984～1995年在本院手术的肺癌病人，共76例。其中鳞癌44例，腺癌23例，腺鳞癌1例，大细胞癌3例，小细胞癌5例。76例中男63例，女13例，男女之比为4.8∶1。平均年龄51岁。病理分级：G1期9例，G2期34例，G3期25例，未分化8例。临床分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期31例，Ⅲ期39例。本组76例病人中随访75例，失访1例，术后5年随访率99%。另选5例正常人肺组织标本做对照。
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二、材料
兔抗人P16蛋白多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，LSAB Kit免疫组织化学试剂盒及显色剂DAB购自日本DAKO公司。
三、方法
1.免疫组织化学染色(SP法)：所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋后切片，常规二甲苯脱蜡，3%H2O2滴加片上30分钟，以封闭内源性过氧化物酶。0.1%胰蛋白酶37℃，20～30分钟(根据组织切片厚度)，以消除甲醛固定所致的掩盖作用，增加阳性反应，减少背景非特异性着色。滴加10%正常山羊血清[磷酸盐缓冲液(PBS)稀释]，室温20分钟，以减少非特异性背景着色。滴加一抗体(兔抗人P16蛋白多克隆抗体1∶50，置湿盒中4℃过夜)。二抗体(羊抗兔IgG1∶100，37℃孵育30分钟)。滴加辣根酶标记的链霉卵白素1∶300，37℃孵育30分钟。上述各步间均以PBS浸洗5分钟，3次。用含3%H2O2的DAB液显色。DAB显色为棕褐色。苏木素复染，常规脱水，透明，封片。实验中选用证实有P16蛋白表达的胶质瘤阳性标本作为阳性对照。用PBS替代一抗体作为阴性对照。
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2.统计学处理：采用SAS(6.04)统计软件，进行t检验、χ2检验，数值以
±s表示。
结果
一、P16蛋白表达与病理类型及组织学分级的关系
P16蛋白阳性表达显色为棕黄色，大部分仅见于胞浆表达，少数细胞核和细胞浆均表达。76例肺癌标本中34例为阳性表达(总阳性率为45%)，其中鳞癌为23例(52%)，腺癌为7例(29%)，二者比较，P<0.05；大细胞肺癌1例(1/3)，小细胞肺癌3例(3/5)，因后两种类型病例数较少未做统计学处理。P16蛋白阳性表达在G1期为9例(9/9)，G2期为16例(44%)，G3期为5例(20%)，未分化癌为4例(4/8)。9例癌旁正常肺组织均为阳性，其中鳞癌5例(G1期3例，G2期2例)，腺癌3例(G1期2例，G2期1例)，小细胞肺癌1例。5例正常肺人组织均为阳性表达，主要在支气管粘膜上皮，浆液腺和肺泡上皮细胞表达。
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二、P16蛋白表达与临床分期及预后的关系
P16蛋白阳性表达在Ⅰ期为5例(5/6)，Ⅱ期为15例(48%)，Ⅲ期为14例(36%)，各期之间：r=0.034，P=0.055。随着分期增加P16蛋白阳性表达呈下降趋势。从附图可见，P16蛋白阳性表达组肺癌病人的生存率明显高于阴性组。两组病人1年后的生存率比较差异有显著意义(P<0.001)。
附图 P16蛋白表达阳性组和阴性组生存期比较
讨论
正常细胞生长周期的调控依赖于细胞周期依赖性蛋白激酶(Cdk)的活化物，如细胞周期蛋白(Cyclin)与抑制物(如P15蛋白、P16蛋白)之间的平衡。如果上述过程失衡都会促使细胞增殖失控，继而表现为细胞癌变[3，4]。P16蛋白通过与Cyclin D1竞争结合Cdk 4/6，抑制Cdk 4/6活性，从而阻止视网膜母细胞瘤易感基因的蛋白产物pRb的磷酸化，使细胞停滞于G0和G1期[3]。在此过程中，P16蛋白起着重要的负性调控作用。
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CDKN2基因突变和缺失广泛存在于各种肿瘤中。Kamb等[1]检测了290种不同肿瘤的细胞系，发现75%的细胞系有p16基因的缺失与突变，超过了p53突变率的50%。Wasihimi等[5]检测了20例非小细胞肺癌细胞株中染色体DNA，发现有6例p16缺失。我们通过免疫组织化学方法检测了76例肺癌标本P16蛋白的表达，阳性率为45%，其在腺癌中的阳性表达比在鳞癌中明显低，这可能是腺癌预后较差的原因之一；在小细胞肺癌中P16蛋白阳性表达比例较高，其原因为小细胞肺癌的发生发展可能与p16基因缺失、突变关系不密切或者该型肺癌有不同的转化机制有关，也可能与本组病例数较少有关；在34例P16蛋白阳性表达者中，有25例为G1、G2期，这可能是细胞在增殖过程中所接受的内外增殖信号的一种代偿性反应，以致CDKN2反应性增加转录的结果。而G3期多为阴性表达，这可能与该期CDKN2基因丢失或突变的频率较高有关，提示P16蛋白阳性表达与肿瘤分化程度呈正相关，其在高、中和低分化三者之间差异有显著意义(P<0.05)。P16蛋白阳性表达在临床分期中差异虽无统计学意义，但从趋势上看，病程越晚，阳性表达越低。提示，P16蛋白低表达可能是肺癌的晚期表现。有学者认为CDKN2基因的改变可能是肿瘤发生过程中一个较晚的分子事件，其失活的生物学意义可能在于它使某一亚群细胞获得生长优势，并使这些细胞有转移的表现。另外，本研究中P16蛋白阳性表达组病人生存期长于阴性组，这也许和其表达蛋白产物抑制细胞恶性增殖有关。表明P16基因对肺癌的发生发展有着重要意义。
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参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264:436-440.
2 Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer. Nature, 1994, 368:753-756.
3 Sherr CJ.G1 phase progression: cyclin on cue. Cell, 1994, 79:551-554.
, 百拇医药
4 Peter M, Herskowitz I. Joining the complex: cyclin-dependent kinase inhibitory proteins and the cell cycle. Cell, 1994, 79:181-184.
5 Wasihimi Q, Nagatake M, Osada H, et al. In vivo Occurrence of P16 (MTS1) and p15 (MTS2) Alterations Preferentially in non-small cell lung cancers. Cancer Res, 1995, 55:514-517.
(收稿：1997-06-27 修回：1998-01-20)
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单位：100029 北京，中日友好医院胸外科(郭永庆、葛炳生、赵风瑞、赵洪昌)，临床医学研究所生化及分子生物学室(关钧、范慕贞)
关键词：肺肿瘤；P16蛋白；免疫组织化学
中华医学杂志980512 【摘要】 目的 探讨抑癌基因p16与肺癌预后的关系。方法 应用SP免疫组织化学方法对76例肺癌标本中CDKN2抑癌基因P16蛋白表达进行了研究。结果 76例肺癌标本中P16蛋白表达阳性率为45%(34/76)。其中鳞癌的阳性率为52%(23/44)，腺癌为29%(7/24)，二者比较差异有显著意义(P<0.05)。P16蛋白表达与肺癌的病理分级及预后呈显著相关性(P<0.05)。结论 p16基因对肺癌的发生发展有着重要意义。
P16 expression in lung cancer and its significance Guo Yongqing, Guan Jun, Ge Bingsheng, et al. Department of Thoracic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029
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【Abstract 】 Objective To study the relationship of suppressor gene p16 and lung cancer for prognosis evaluation. Methods Immunohistochemical method was used to detect and analyse the expression of P16 protein of CDKN2 suppressor gene of 76 cases in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens of human lung cancer. Results P16 positive rate was 45%: 52% for 23 of 44 cases of squamous carcinoma and 29% for 7 of 24 cases of adenocarcinoma. Differentiation degree and prognosis of lung cancer were associated significantly with P16 expression. P16 expression was somewhat related to clinical stage. Conclusion p16 gene plays a key role in the prognosis of patients with lung cancer.
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【Key words 】 Lung neoplasms P16 protein Immunohistochemistry
(Natl Med J China, 1998, 78:354-355)
1994年Kamb等[1]与Nobori等[2]同时发现一种新型抑癌基因——CDKN2基因。其外显子2编码为16 000分子量的蛋白，即P16蛋白。为了探讨P16蛋白在肺癌中的表达及意义，我们对76例人肺癌组织标本进行了检测，报道如下。
对象与方法
一、对象
为1984～1995年在本院手术的肺癌病人，共76例。其中鳞癌44例，腺癌23例，腺鳞癌1例，大细胞癌3例，小细胞癌5例。76例中男63例，女13例，男女之比为4.8∶1。平均年龄51岁。病理分级：G1期9例，G2期34例，G3期25例，未分化8例。临床分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期31例，Ⅲ期39例。本组76例病人中随访75例，失访1例，术后5年随访率99%。另选5例正常人肺组织标本做对照。
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二、材料
兔抗人P16蛋白多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，LSAB Kit免疫组织化学试剂盒及显色剂DAB购自日本DAKO公司。
三、方法
1.免疫组织化学染色(SP法)：所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋后切片，常规二甲苯脱蜡，3%H2O2滴加片上30分钟，以封闭内源性过氧化物酶。0.1%胰蛋白酶37℃，20～30分钟(根据组织切片厚度)，以消除甲醛固定所致的掩盖作用，增加阳性反应，减少背景非特异性着色。滴加10%正常山羊血清[磷酸盐缓冲液(PBS)稀释]，室温20分钟，以减少非特异性背景着色。滴加一抗体(兔抗人P16蛋白多克隆抗体1∶50，置湿盒中4℃过夜)。二抗体(羊抗兔IgG1∶100，37℃孵育30分钟)。滴加辣根酶标记的链霉卵白素1∶300，37℃孵育30分钟。上述各步间均以PBS浸洗5分钟，3次。用含3%H2O2的DAB液显色。DAB显色为棕褐色。苏木素复染，常规脱水，透明，封片。实验中选用证实有P16蛋白表达的胶质瘤阳性标本作为阳性对照。用PBS替代一抗体作为阴性对照。
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2.统计学处理：采用SAS(6.04)统计软件，进行t检验、χ2检验，数值以
±s表示。结果
一、P16蛋白表达与病理类型及组织学分级的关系
P16蛋白阳性表达显色为棕黄色，大部分仅见于胞浆表达，少数细胞核和细胞浆均表达。76例肺癌标本中34例为阳性表达(总阳性率为45%)，其中鳞癌为23例(52%)，腺癌为7例(29%)，二者比较，P<0.05；大细胞肺癌1例(1/3)，小细胞肺癌3例(3/5)，因后两种类型病例数较少未做统计学处理。P16蛋白阳性表达在G1期为9例(9/9)，G2期为16例(44%)，G3期为5例(20%)，未分化癌为4例(4/8)。9例癌旁正常肺组织均为阳性，其中鳞癌5例(G1期3例，G2期2例)，腺癌3例(G1期2例，G2期1例)，小细胞肺癌1例。5例正常肺人组织均为阳性表达，主要在支气管粘膜上皮，浆液腺和肺泡上皮细胞表达。
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二、P16蛋白表达与临床分期及预后的关系
P16蛋白阳性表达在Ⅰ期为5例(5/6)，Ⅱ期为15例(48%)，Ⅲ期为14例(36%)，各期之间：r=0.034，P=0.055。随着分期增加P16蛋白阳性表达呈下降趋势。从附图可见，P16蛋白阳性表达组肺癌病人的生存率明显高于阴性组。两组病人1年后的生存率比较差异有显著意义(P<0.001)。
附图 P16蛋白表达阳性组和阴性组生存期比较
讨论
正常细胞生长周期的调控依赖于细胞周期依赖性蛋白激酶(Cdk)的活化物，如细胞周期蛋白(Cyclin)与抑制物(如P15蛋白、P16蛋白)之间的平衡。如果上述过程失衡都会促使细胞增殖失控，继而表现为细胞癌变[3，4]。P16蛋白通过与Cyclin D1竞争结合Cdk 4/6，抑制Cdk 4/6活性，从而阻止视网膜母细胞瘤易感基因的蛋白产物pRb的磷酸化，使细胞停滞于G0和G1期[3]。在此过程中，P16蛋白起着重要的负性调控作用。
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CDKN2基因突变和缺失广泛存在于各种肿瘤中。Kamb等[1]检测了290种不同肿瘤的细胞系，发现75%的细胞系有p16基因的缺失与突变，超过了p53突变率的50%。Wasihimi等[5]检测了20例非小细胞肺癌细胞株中染色体DNA，发现有6例p16缺失。我们通过免疫组织化学方法检测了76例肺癌标本P16蛋白的表达，阳性率为45%，其在腺癌中的阳性表达比在鳞癌中明显低，这可能是腺癌预后较差的原因之一；在小细胞肺癌中P16蛋白阳性表达比例较高，其原因为小细胞肺癌的发生发展可能与p16基因缺失、突变关系不密切或者该型肺癌有不同的转化机制有关，也可能与本组病例数较少有关；在34例P16蛋白阳性表达者中，有25例为G1、G2期，这可能是细胞在增殖过程中所接受的内外增殖信号的一种代偿性反应，以致CDKN2反应性增加转录的结果。而G3期多为阴性表达，这可能与该期CDKN2基因丢失或突变的频率较高有关，提示P16蛋白阳性表达与肿瘤分化程度呈正相关，其在高、中和低分化三者之间差异有显著意义(P<0.05)。P16蛋白阳性表达在临床分期中差异虽无统计学意义，但从趋势上看，病程越晚，阳性表达越低。提示，P16蛋白低表达可能是肺癌的晚期表现。有学者认为CDKN2基因的改变可能是肿瘤发生过程中一个较晚的分子事件，其失活的生物学意义可能在于它使某一亚群细胞获得生长优势，并使这些细胞有转移的表现。另外，本研究中P16蛋白阳性表达组病人生存期长于阴性组，这也许和其表达蛋白产物抑制细胞恶性增殖有关。表明P16基因对肺癌的发生发展有着重要意义。
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参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264:436-440.
2 Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer. Nature, 1994, 368:753-756.
3 Sherr CJ.G1 phase progression: cyclin on cue. Cell, 1994, 79:551-554.
, 百拇医药
4 Peter M, Herskowitz I. Joining the complex: cyclin-dependent kinase inhibitory proteins and the cell cycle. Cell, 1994, 79:181-184.
5 Wasihimi Q, Nagatake M, Osada H, et al. In vivo Occurrence of P16 (MTS1) and p15 (MTS2) Alterations Preferentially in non-small cell lung cancers. Cancer Res, 1995, 55:514-517.
(收稿：1997-06-27 修回：1998-01-20)
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