促性腺激素释放素及其受体在人肝癌组织中的分布及意义
作者：张金山 黄高升 黄威权 张远强
单位：710032 西安，第四军医大学基础部组织胚胎学教研室[张金山(研究生)、黄威权、张远强]，病理学教研室(黄高升)
关键词：癌，肝细胞；受体，促性腺激素释放素；免疫组织化学
中华医学杂志980509 【摘要】 目的 观察促性腺激素释放素(GnRH)及其受体在不同分化程度肝癌组织中的定位与分布，为研究GnRH与肝癌细胞增殖调控的关系提供依据。方法 用常规组织学HE染色和免疫组织化学链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(SABC)技术检测了33例人肝细胞性肝癌及其癌旁肝组织中GnRH及其受体的表达和分布情况。结果 GnRH与GnRH受体在肝癌细胞和癌旁肝细胞的定位及分布范围基本一致，阳性物质主要位于癌细胞的胞膜和胞浆，核周区染色增强，胞核未见阳性产物。分化Ⅰ、Ⅱ级肝癌组织GnRH的阳性率为94%(16/17)，高于III级肝癌[50%(5/10，P<0.05)和Ⅳ级肝癌[17%(1/6) P<0.001]。Ⅰ～Ⅱ级肝癌组织GnRH受体阳性率为88%(15/17)，高于Ⅳ级肝癌[17%(1/6)P<0.01]。此外，尽管各分化级别肝癌组织中GnRH及其受体的阳性率均低于其相应癌旁肝硬化组织，但差异无显著意义(P>0.05)。结论 肝癌组织中GnRH及其受体的表达与其分化程度有关。
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Gonadotropin releasing hormone and its receptor in the tissue of human hepatocellular carcinoma Zhang Jinshan,* Huang Gaosheng, Huang Weiquan, et al. Department of Histology and Embryology, * Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xian 710032
【Abstract】 Objective To provide the basis for studying the relationship between gonadotropin releasing hormone(GnRH) and the regulation of hepatocarcinoma cell proliferation and differentiation, we observed the localization and distribution of GnRH and its receptor(GnRH-R) in various differentiated hepatocarcinoma tissues. Methods GnRH and its receptor were detected in 33 hepatocellular carcinoma(HCC) by immunohistochemical SABC technique. Results GnRH and its receptor had the same distributive pattern in hepatocarcinoma cells.The positive signal was found mainly on the surface and in the cytoplasm of hepatoma cells, with enhanced staining in the cytoplasm surrounding the nucleus;no positive signal was revealed in the nucleus. The GnRH positive rate (94%; 16/17) of edmondson grade Ⅰ～Ⅱ HCC was higher than that of grade Ⅲ HCC (50%; 5/10) and grade IV HCC(17%;1/6), (P<0.05 and P<0.001 respectively). In grades Ⅰ～Ⅱ HCC GnRH-R positive rate was 88% (15/17),which was higher than 17%(1/6) in grade IV HCC (P<0.01).Although GnRH and GnRH-R positive rates in every grade HCC were lower than those in their related peri-cancerous tissues,the differences were not signifcant (P>0.05). Conclusion The expression of GnRH and GnRH-R in the tissues of hepatocarcinoma is related to their degree of differentiation.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatocellular, carcinoma Receptors, Gonadoliberin Immunohistochemistry
(Natl Med J China, 1998, 78：343-346)
促性腺激素释放素(GnRH)最初是从哺乳类动物下丘脑分离出的一种十肽激素，其主要功能是调节垂体前叶促性腺激素的分泌，从而对生殖轴起作用。随后的研究发现，GnRH对垂体外的多种外周组织的生理功能有调节作用[1]。一些实验还发现，乳腺、前列腺、卵巢、垂体和胰腺发生的肿瘤细胞上有GnRH结合位点，GnRH类似物可抑制这些肿瘤细胞的生长[2]。原发性肝癌的发病率具有明显的性别差异(男/女=9/1～7/1)，实验研究和临床观察均提示肝癌可能是一种性激素依赖性肿瘤[3]。最近有人证明培养的人肝癌细胞上存在GnRH结合位点，GnRH对该细胞系的生长有抑制作用[4]；我们对不同分化级别肝癌组织中GnRH及其受体的定位和分布进行了观察，以期为研究GnRH调控肝癌细胞增殖的机理提供依据。
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材料和方法
一、标本来源及切片制备
33例肝细胞性肝癌标本均来自第四军医大学附属医院住院病人，其中24例带有癌旁肝组织。所有标本均用10%甲醛固定24小时，常规石蜡包埋，制备5 μm厚连续切片，贴附于涂有0.5%铬矾明胶的载玻片上。对每例肝癌组织切片分别用抗GnRH抗体和抗GnRH抗独特型抗体进行免疫组织化学染色；并作常规HE染色，以判定肝癌组织的分化程度。
二、主要试剂
兔抗鸡GnRH-Ⅱ多克隆抗血清由南非共和国开普敦大学医学院化学病理研究室Judy A K博士惠赠，工作浓度为1∶400；兔抗GnRH抗独特型抗体为第四军医大学组织胚胎学教研室研制[5]，工作浓度为1∶200；链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒购自武汉博士德(Boster)生物工程公司；3，3-二氨基苯联胺(DAB)为美国Sigma公司产品。
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三、免疫组织化学染色
按Boster公司推荐的SABC染色程序稍加改变，具体步骤为：(1) 切片经二甲苯脱蜡，0.3%甲醇-双氧水孵育30分钟，消除内源性过氧化物酶，梯度酒精水化，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)振洗5分钟；(2) 滴加2%正常羊血清封闭背景30分钟；(3) 弃去封闭血清，分别滴加抗GnRH抗血清或抗GnRH抗独特型抗体，4℃孵育16小时；(4) PBS液洗3次、每次5分钟；(5) 加生物素化羊抗兔IgG，室温孵育2小时；(6) PBS液洗3次、每次5分钟；(7) 加SABC复合物室温孵育1小时；(8) PBS液洗3次、每次5分钟；(9) DAB-H2O2显色8分钟；(10) 脱水、透明、中性树胶封片。
四、对照实验
分别用大鼠下丘脑和垂体组织切片作为GnRH和GnRH-R的阳性对照，4例尸检正常肝组织标本作为阴性对照[6]；并分别用1.5%正常兔血清和0.01 mol/L PBS取代第一抗体进行孵育，作为替代对照和空白对照，以确保实验结果的可靠性和特异性。
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五、统计学处理
采用χ2检验对组织学分级不同的肝癌组织中GnRH及其受体(GnRH-R)表达的阳性率进行比较。
结果
一、33例肝细胞性肝癌的病理组织学分级
所有切片标本均经HE染色，按常用的Edmondson氏4级分级法[7]进行分级。本组病例中Ⅰ级3例，Ⅱ级14例，Ⅲ级10例，Ⅳ级6例；共有24例肝癌组织标本中带癌旁肝组织，各分化级别所占例数见附表。
附表 肝癌及其癌旁肝组织中GnRH及GnRH-R的
免疫组织化学检测结果(例数) 病理诊断
例数
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GnRH阳性
GnRH-R阳性
肝癌组织
33
22
22
Ⅰ～Ⅱ级
17
16
15
Ⅲ级
10
5
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6
Ⅳ级
6
1
1
癌旁肝组织
24
20
21
Ⅰ～Ⅱ级
13
11
12
Ⅲ级
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6
5
5
Ⅳ级
5
4
4
二、GnRH及其受体在肝癌及癌旁肝组织的定位与分布特点
大鼠下丘脑组织呈GnRH免疫反应阳性，垂体组织呈GnRH-R阳性；尸检正常肝组织及空白和替代对照切片中均未见免疫反应阳性信号。在癌及癌旁肝组织中，GnRH及GnRH-R免疫反应阳性产物呈棕褐色，细颗粒状；背景不着色或略显淡黄色，阳性细胞容易辩认。在癌及癌旁肝组织中，GnRH和GnRH-R在肝癌细胞及癌旁肝细胞的定位及分布区域基本一致，阳性物质主要位于癌细胞及癌旁肝细胞的胞膜和(或)胞浆，胞浆内阳性信号紧靠核周区或呈弥漫性分布，胞核未见阳性产物(图1～3)。GnRH和GnRH-R阳性肝癌细胞呈局灶型或弥漫型分布，分化程度高的Ⅰ～Ⅱ级肝癌多以弥漫型为主；而分化程度低的Ⅲ～Ⅳ级肝癌则以局灶型多见，少数可有散在分布。癌旁组织中GnRH和GnRH-R阳性细胞呈弥漫型分布，并且阳性信号强度高于其相对应癌组织(图4，5)。
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三、GnRH和GnRH-R阳性率与肝癌组织学分级的关系
如附表所示，经统计学连续校正卡方检验，Ⅰ、Ⅱ级肝癌组织GnRH的阳性率高于Ⅲ级肝癌组织(χ2=4.76，P<0.05)和Ⅳ级肝癌组织(χ2=10.07，P<0.001)；而Ⅲ级与Ⅳ级肝癌组织之间的GnRH的阳性率差异无显著意义(χ2=0.64，P>0.05)。Ⅰ、Ⅱ级肝癌组织中GnRH-R的阳性率高于Ⅳ级肝癌组织(χ2=7.62，P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅲ级与Ⅳ级肝癌组织之间的GnRH-R阳性率差异均无显著意义(χ2=1.50，χ2=1.34；P>0.05)。
图1 肝癌组织Ⅰ级；抗GnRH多克隆抗体免疫染色，示阳性物质呈弥散分布、定位于肝癌细胞胞浆和胞膜 SABC法×170
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图2 肝癌组织Ⅱ级；GnRH抗独特型抗体免疫染色，阳性物质呈灶性分布，见于癌细胞胞浆、近核膜处染色增强 SABC法×170
图3 肝癌Ⅱ级之癌旁组织，示GnRH免疫反应强阳性 SABC法×340
图4 肝癌Ⅲ级及其癌旁组织；上部的癌旁组织呈弥漫性GnRH免疫染色强阳性，下部的癌组织中GnRH阳性肝癌细胞呈散在分布 SABC法×170
图5 肝癌Ⅳ级及其癌旁组织；上部的癌旁组织呈弥散性GnRH免疫染色阳性，下部的癌组织呈GnRH免疫反应阴性 SABC法×170
四、肝癌与其癌旁肝组织中GnRH和GnRH-R表达阳性率的差异
各分化级别肝癌相对应的癌旁肝硬化组织中GnRH和GnRH-R的阳性率见附表。除Ⅰ～Ⅱ级肝癌组织的GnRH阳性率略高于其癌旁组织外，其它各分化级别肝癌组织中GnRH及其受体表达的阳性率均低于其相对应的癌旁肝组织，但差异均无显著意义(P>0.05)。
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讨论
本研究用免疫组织化学方法，首次在组织原位发现人肝癌细胞和癌旁肝硬化组织细胞中有GnRH及其受体分布；两者在肝癌细胞均定位于胞浆和(或)胞膜，胞核未见阳性信号，分布范围大致相同。在肝癌细胞中同时检出GnRH和其受体，提示肝癌细胞可能具有自分泌GnRH的功能；这有待于进一步的GnRH及其受体mRNA检测加以证实。我们的检测结果还显示，肝细胞性肝癌组织中GnRH和其受体表达的阳性率与癌组织的分化程度有一定关系。肝癌分化越好，阳性率越高；反之，分化越差，阳性率也越低。分化程度高的Edmondson氏Ⅰ～Ⅱ级肝癌阳性率最高；Ⅲ级的阳性率次之；Ⅳ级的阳性率最低。此外，癌旁肝组织的GnRH和其受体表达的阳性率均高于其相对应的肝癌组织。统计学检验差异无显著意义，可能与例数较少、特别是Ⅲ～Ⅳ级病例例数少有关，增加病例数可能会得出有统计学意义的结果。
肝癌细胞表达GnRH和其受体的意义尚不清楚。大量的研究资料证实，GnRH与性激素依赖性肿瘤细胞的增殖调控有关，GnRH类似物或拮抗剂已被用于这类肿瘤患者的临床治疗。最近Irmer等[8]用反转录PCR技术和Southern杂交方法，在人卵巢癌细胞中检出了GnRH和其受体的mRNA。GnRH拮抗剂(SB-75)可抑制裸鼠卵巢癌细胞的生长[9]。有人用受体放射分析法证明培养的人肝癌细胞存在高亲合力GnRH结合位点，[D-Lys6]GnRH对该细胞系的生长有抑制作用[4]。对肝癌大鼠模型的研究也发现，用GnRH类似物治疗可使瘤体缩小；病理组织学观察发现低分化癌的数目明显减少，而高分化的小梁状或腺样癌的数目增加；癌组织中雄激素受体mRNA水平下降[10]。我们的研究结果结合上述已有实验资料，推测GnRH可能对肝癌细胞的增殖有抑制作用，而促进肝癌细胞的分化。检测GnRH和其受体可为肝癌的临床内分泌治疗提供参考依据和治疗的基础。
, 百拇医药
本课题为“九五”军队医药卫生科研基金资助项目
参考文献
1 Chieffi G,Pierantoni R,Fasano S. Immunoreactive GnRH in hypothalamic and extrahypothalamic areas. Int Rev Cytol,1991,127：1-55.
2 Szende B,Srkalovic G,Timar J,et al. Localization of receptors for luteinizing hormone-releasing hormone in pancreatic and mammary cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:4153-4156.
3 Yager JD,Zurlo J,Ni N. Sex hormones and tumor promotion in liver. Prog Soc Exp Biol Med, 1991,198:667-674.
, 百拇医药
4 Pati D,Habibi HR. Inhibition of human hepatocarcinoma cell proliferation by mammalian and fish gonadotropin-releasing hormones. Endocrinology, 1995,136:75-84.
5 黄威权，孙岚，张崇理.GnRH抗独特型抗体的制备及鉴定.解剖学杂志.1994，17(增刊)：353-356.
6 Kakar SS,Musgrove LC,Devor DC,et al. Cloning,sequencing,and expression of human gonadotropin releasing hormone(GnRH) receptor. Biochem Biophys Res Commun 1992,189：289-295.
7 顾公望.原发性肝癌病理学(原发性肝癌). 见：池肇春，叶维法主编. 新编实用肝病学. 北京：中国医药科技出版社，1994：393-396.
, 百拇医药
8 Irmer G,Burger C,Muller R,et al. Expression of the messenger RNAs for luteinizing hormone-releasing hormone(LHRH) and its receptor in human ovarian epithelial carcinoma. Cancer Res, 1995,55:817-822
9 Manetta A,Gamboa-Vujicic G,Paredes P,et al. Inhibition of growth of human ovarian cancer in nude mice by luteinizing hormone-releasing hormone antagonist cetrorelix(SB-75). Fertil Steril, 1995,63:282-287.
10 Matsuura B, Taniguchi Y,Ohta Y. Effect of antiandrogen treatment on chemical hepatocarcinogenesis in rats. J Hepatol, 1994,21:187-193.
(收稿：1997-04-16 修回：1997-12-15), 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学基础部组织胚胎学教研室[张金山(研究生)、黄威权、张远强]，病理学教研室(黄高升)
关键词：癌，肝细胞；受体，促性腺激素释放素；免疫组织化学
中华医学杂志980509 【摘要】 目的 观察促性腺激素释放素(GnRH)及其受体在不同分化程度肝癌组织中的定位与分布，为研究GnRH与肝癌细胞增殖调控的关系提供依据。方法 用常规组织学HE染色和免疫组织化学链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(SABC)技术检测了33例人肝细胞性肝癌及其癌旁肝组织中GnRH及其受体的表达和分布情况。结果 GnRH与GnRH受体在肝癌细胞和癌旁肝细胞的定位及分布范围基本一致，阳性物质主要位于癌细胞的胞膜和胞浆，核周区染色增强，胞核未见阳性产物。分化Ⅰ、Ⅱ级肝癌组织GnRH的阳性率为94%(16/17)，高于III级肝癌[50%(5/10，P<0.05)和Ⅳ级肝癌[17%(1/6) P<0.001]。Ⅰ～Ⅱ级肝癌组织GnRH受体阳性率为88%(15/17)，高于Ⅳ级肝癌[17%(1/6)P<0.01]。此外，尽管各分化级别肝癌组织中GnRH及其受体的阳性率均低于其相应癌旁肝硬化组织，但差异无显著意义(P>0.05)。结论 肝癌组织中GnRH及其受体的表达与其分化程度有关。
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Gonadotropin releasing hormone and its receptor in the tissue of human hepatocellular carcinoma Zhang Jinshan,* Huang Gaosheng, Huang Weiquan, et al. Department of Histology and Embryology, * Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xian 710032
【Abstract】 Objective To provide the basis for studying the relationship between gonadotropin releasing hormone(GnRH) and the regulation of hepatocarcinoma cell proliferation and differentiation, we observed the localization and distribution of GnRH and its receptor(GnRH-R) in various differentiated hepatocarcinoma tissues. Methods GnRH and its receptor were detected in 33 hepatocellular carcinoma(HCC) by immunohistochemical SABC technique. Results GnRH and its receptor had the same distributive pattern in hepatocarcinoma cells.The positive signal was found mainly on the surface and in the cytoplasm of hepatoma cells, with enhanced staining in the cytoplasm surrounding the nucleus;no positive signal was revealed in the nucleus. The GnRH positive rate (94%; 16/17) of edmondson grade Ⅰ～Ⅱ HCC was higher than that of grade Ⅲ HCC (50%; 5/10) and grade IV HCC(17%;1/6), (P<0.05 and P<0.001 respectively). In grades Ⅰ～Ⅱ HCC GnRH-R positive rate was 88% (15/17),which was higher than 17%(1/6) in grade IV HCC (P<0.01).Although GnRH and GnRH-R positive rates in every grade HCC were lower than those in their related peri-cancerous tissues,the differences were not signifcant (P>0.05). Conclusion The expression of GnRH and GnRH-R in the tissues of hepatocarcinoma is related to their degree of differentiation.
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【Key words】 Hepatocellular, carcinoma Receptors, Gonadoliberin Immunohistochemistry
(Natl Med J China, 1998, 78：343-346)
促性腺激素释放素(GnRH)最初是从哺乳类动物下丘脑分离出的一种十肽激素，其主要功能是调节垂体前叶促性腺激素的分泌，从而对生殖轴起作用。随后的研究发现，GnRH对垂体外的多种外周组织的生理功能有调节作用[1]。一些实验还发现，乳腺、前列腺、卵巢、垂体和胰腺发生的肿瘤细胞上有GnRH结合位点，GnRH类似物可抑制这些肿瘤细胞的生长[2]。原发性肝癌的发病率具有明显的性别差异(男/女=9/1～7/1)，实验研究和临床观察均提示肝癌可能是一种性激素依赖性肿瘤[3]。最近有人证明培养的人肝癌细胞上存在GnRH结合位点，GnRH对该细胞系的生长有抑制作用[4]；我们对不同分化级别肝癌组织中GnRH及其受体的定位和分布进行了观察，以期为研究GnRH调控肝癌细胞增殖的机理提供依据。
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材料和方法
一、标本来源及切片制备
33例肝细胞性肝癌标本均来自第四军医大学附属医院住院病人，其中24例带有癌旁肝组织。所有标本均用10%甲醛固定24小时，常规石蜡包埋，制备5 μm厚连续切片，贴附于涂有0.5%铬矾明胶的载玻片上。对每例肝癌组织切片分别用抗GnRH抗体和抗GnRH抗独特型抗体进行免疫组织化学染色；并作常规HE染色，以判定肝癌组织的分化程度。
二、主要试剂
兔抗鸡GnRH-Ⅱ多克隆抗血清由南非共和国开普敦大学医学院化学病理研究室Judy A K博士惠赠，工作浓度为1∶400；兔抗GnRH抗独特型抗体为第四军医大学组织胚胎学教研室研制[5]，工作浓度为1∶200；链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒购自武汉博士德(Boster)生物工程公司；3，3-二氨基苯联胺(DAB)为美国Sigma公司产品。
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三、免疫组织化学染色
按Boster公司推荐的SABC染色程序稍加改变，具体步骤为：(1) 切片经二甲苯脱蜡，0.3%甲醇-双氧水孵育30分钟，消除内源性过氧化物酶，梯度酒精水化，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)振洗5分钟；(2) 滴加2%正常羊血清封闭背景30分钟；(3) 弃去封闭血清，分别滴加抗GnRH抗血清或抗GnRH抗独特型抗体，4℃孵育16小时；(4) PBS液洗3次、每次5分钟；(5) 加生物素化羊抗兔IgG，室温孵育2小时；(6) PBS液洗3次、每次5分钟；(7) 加SABC复合物室温孵育1小时；(8) PBS液洗3次、每次5分钟；(9) DAB-H2O2显色8分钟；(10) 脱水、透明、中性树胶封片。
四、对照实验
分别用大鼠下丘脑和垂体组织切片作为GnRH和GnRH-R的阳性对照，4例尸检正常肝组织标本作为阴性对照[6]；并分别用1.5%正常兔血清和0.01 mol/L PBS取代第一抗体进行孵育，作为替代对照和空白对照，以确保实验结果的可靠性和特异性。
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五、统计学处理
采用χ2检验对组织学分级不同的肝癌组织中GnRH及其受体(GnRH-R)表达的阳性率进行比较。
结果
一、33例肝细胞性肝癌的病理组织学分级
所有切片标本均经HE染色，按常用的Edmondson氏4级分级法[7]进行分级。本组病例中Ⅰ级3例，Ⅱ级14例，Ⅲ级10例，Ⅳ级6例；共有24例肝癌组织标本中带癌旁肝组织，各分化级别所占例数见附表。
附表 肝癌及其癌旁肝组织中GnRH及GnRH-R的
免疫组织化学检测结果(例数) 病理诊断
例数
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GnRH阳性
GnRH-R阳性
肝癌组织
33
22
22
Ⅰ～Ⅱ级
17
16
15
Ⅲ级
10
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Ⅳ级
6
1
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癌旁肝组织
24
20
21
Ⅰ～Ⅱ级
13
11
12
Ⅲ级
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6
5
5
Ⅳ级
5
4
4
二、GnRH及其受体在肝癌及癌旁肝组织的定位与分布特点
大鼠下丘脑组织呈GnRH免疫反应阳性，垂体组织呈GnRH-R阳性；尸检正常肝组织及空白和替代对照切片中均未见免疫反应阳性信号。在癌及癌旁肝组织中，GnRH及GnRH-R免疫反应阳性产物呈棕褐色，细颗粒状；背景不着色或略显淡黄色，阳性细胞容易辩认。在癌及癌旁肝组织中，GnRH和GnRH-R在肝癌细胞及癌旁肝细胞的定位及分布区域基本一致，阳性物质主要位于癌细胞及癌旁肝细胞的胞膜和(或)胞浆，胞浆内阳性信号紧靠核周区或呈弥漫性分布，胞核未见阳性产物(图1～3)。GnRH和GnRH-R阳性肝癌细胞呈局灶型或弥漫型分布，分化程度高的Ⅰ～Ⅱ级肝癌多以弥漫型为主；而分化程度低的Ⅲ～Ⅳ级肝癌则以局灶型多见，少数可有散在分布。癌旁组织中GnRH和GnRH-R阳性细胞呈弥漫型分布，并且阳性信号强度高于其相对应癌组织(图4，5)。
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三、GnRH和GnRH-R阳性率与肝癌组织学分级的关系
如附表所示，经统计学连续校正卡方检验，Ⅰ、Ⅱ级肝癌组织GnRH的阳性率高于Ⅲ级肝癌组织(χ2=4.76，P<0.05)和Ⅳ级肝癌组织(χ2=10.07，P<0.001)；而Ⅲ级与Ⅳ级肝癌组织之间的GnRH的阳性率差异无显著意义(χ2=0.64，P>0.05)。Ⅰ、Ⅱ级肝癌组织中GnRH-R的阳性率高于Ⅳ级肝癌组织(χ2=7.62，P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅲ级与Ⅳ级肝癌组织之间的GnRH-R阳性率差异均无显著意义(χ2=1.50，χ2=1.34；P>0.05)。
图1 肝癌组织Ⅰ级；抗GnRH多克隆抗体免疫染色，示阳性物质呈弥散分布、定位于肝癌细胞胞浆和胞膜 SABC法×170
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图2 肝癌组织Ⅱ级；GnRH抗独特型抗体免疫染色，阳性物质呈灶性分布，见于癌细胞胞浆、近核膜处染色增强 SABC法×170
图3 肝癌Ⅱ级之癌旁组织，示GnRH免疫反应强阳性 SABC法×340
图4 肝癌Ⅲ级及其癌旁组织；上部的癌旁组织呈弥漫性GnRH免疫染色强阳性，下部的癌组织中GnRH阳性肝癌细胞呈散在分布 SABC法×170
图5 肝癌Ⅳ级及其癌旁组织；上部的癌旁组织呈弥散性GnRH免疫染色阳性，下部的癌组织呈GnRH免疫反应阴性 SABC法×170
四、肝癌与其癌旁肝组织中GnRH和GnRH-R表达阳性率的差异
各分化级别肝癌相对应的癌旁肝硬化组织中GnRH和GnRH-R的阳性率见附表。除Ⅰ～Ⅱ级肝癌组织的GnRH阳性率略高于其癌旁组织外，其它各分化级别肝癌组织中GnRH及其受体表达的阳性率均低于其相对应的癌旁肝组织，但差异均无显著意义(P>0.05)。
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讨论
本研究用免疫组织化学方法，首次在组织原位发现人肝癌细胞和癌旁肝硬化组织细胞中有GnRH及其受体分布；两者在肝癌细胞均定位于胞浆和(或)胞膜，胞核未见阳性信号，分布范围大致相同。在肝癌细胞中同时检出GnRH和其受体，提示肝癌细胞可能具有自分泌GnRH的功能；这有待于进一步的GnRH及其受体mRNA检测加以证实。我们的检测结果还显示，肝细胞性肝癌组织中GnRH和其受体表达的阳性率与癌组织的分化程度有一定关系。肝癌分化越好，阳性率越高；反之，分化越差，阳性率也越低。分化程度高的Edmondson氏Ⅰ～Ⅱ级肝癌阳性率最高；Ⅲ级的阳性率次之；Ⅳ级的阳性率最低。此外，癌旁肝组织的GnRH和其受体表达的阳性率均高于其相对应的肝癌组织。统计学检验差异无显著意义，可能与例数较少、特别是Ⅲ～Ⅳ级病例例数少有关，增加病例数可能会得出有统计学意义的结果。
肝癌细胞表达GnRH和其受体的意义尚不清楚。大量的研究资料证实，GnRH与性激素依赖性肿瘤细胞的增殖调控有关，GnRH类似物或拮抗剂已被用于这类肿瘤患者的临床治疗。最近Irmer等[8]用反转录PCR技术和Southern杂交方法，在人卵巢癌细胞中检出了GnRH和其受体的mRNA。GnRH拮抗剂(SB-75)可抑制裸鼠卵巢癌细胞的生长[9]。有人用受体放射分析法证明培养的人肝癌细胞存在高亲合力GnRH结合位点，[D-Lys6]GnRH对该细胞系的生长有抑制作用[4]。对肝癌大鼠模型的研究也发现，用GnRH类似物治疗可使瘤体缩小；病理组织学观察发现低分化癌的数目明显减少，而高分化的小梁状或腺样癌的数目增加；癌组织中雄激素受体mRNA水平下降[10]。我们的研究结果结合上述已有实验资料，推测GnRH可能对肝癌细胞的增殖有抑制作用，而促进肝癌细胞的分化。检测GnRH和其受体可为肝癌的临床内分泌治疗提供参考依据和治疗的基础。
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本课题为“九五”军队医药卫生科研基金资助项目
参考文献
1 Chieffi G,Pierantoni R,Fasano S. Immunoreactive GnRH in hypothalamic and extrahypothalamic areas. Int Rev Cytol,1991,127：1-55.
2 Szende B,Srkalovic G,Timar J,et al. Localization of receptors for luteinizing hormone-releasing hormone in pancreatic and mammary cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:4153-4156.
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(收稿：1997-04-16 修回：1997-12-15), 百拇医药