惊厥对癫痫易感大鼠星形胶质细胞基因表达的影响
作者：张月华 单魏松 梁英武 张国荣 吴希如
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：
中华医学杂志980529
神经系统损伤可引起星表胶质细胞反应性增生，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillray acidic protein，GFAP)合成增加是代表星形胶质细胞增生 的一个重要特点[1]。在星形胶质细胞增生的同时，是否伴有星形胶质细胞功能的变化，为此，我们从mRNA水平观察了惊厥大鼠脑内GFAP和星形胶质细胞之间缝隙连接蛋白Cx43基因表达的变化。
一、材料和方法
1.动物来源及筛选：P77PMC遗传性癫痫易感大鼠由本校实验动物中心提供，体重250～300 g。使用前2周给予120 dB铃声刺激1分钟，连续3天，选择惊厥反应Ⅴ级(潜伏期-奔跑-休止期-奔跑-强直阵挛性惊厥)的大鼠为研究对象。
, 百拇医药
2.质粒：GFAP cDNA质粒由美国弗吉尼亚大学Oswald Steward博士赠送，Cx43 cDNA质粒由美国哈佛大学医学院David L Paul教授赠送，β-actin cDNA质粒由美国Morgan sheng博士赠送。
3.脑组织总RNA提取：大鼠经120 dB铃声刺激1分钟，分别于惊厥后0、0.5、1、2、4、8、12及24小时断头处死，取出大脑皮层、海马及皮层下组织，以异硫氰酸寡-酚-氯仿一步法提取组织中总RNA。
4.Northern印迹杂交：将转有RNA的尼龙膜预杂交4～6小时，分别与随机引物标记32P的GFAP cDNA、Cx43cDNA、β-actin cDNA探针进行杂交18～24小时，最后于0.1×标准枸橼酸盐水，0.1%十二烷基硫酸钠中洗膜，-70℃放射自显影48～72小时。
5.吸光度(A)测定：测定Northern印迹每个杂交带的总A值，实验内参照以同一样品的β-actin mRNA杂交量显示每个样品的加样。
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二、结果
P77PMC大鼠惊厥后脑内GFAPmRNA表达在大脑皮层、海马及皮层下有一共同规律，即均在惊厥后4小时 表达出现一高峰，分别较惊厥前增加65.8%，113.2%和55.3%，从8小时以后又逐渐恢复，到惊厥后24小时基本恢复到惊厥前水平。在惊厥后不同时间皮层、海马及皮层下β-actin mRNA杂交量与各样品加样量基本相同。
惊厥后在大脑皮层及海马Cx43 mRNA于惊厥后2小时表达量明显增加，8小时达高峰，较对照大鼠分别增加117.3%和70.6%，持续到24小时仍高于惊厥前；皮层下Cx43 mRNA于惊厥后4小时 表达明显增加，12小时达高峰，较对照大鼠增加65.4%，24小时仍高于惊厥前。惊厥后24小时大鼠与惊厥前比较在大脑皮层、海马及皮层下Cx43 mRNA的表达分别增加 69.4%，57.3%和51.1%。
三、讨论
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惊厥时星形胶质细胞Cx43 mRNA及GFAP mRNA表达增加，说明神经元的兴奋性能够上调Cx43及GFAP mRNA的基因表达。Steward等[2]在电点燃模型上发现，检测GFAP mRNA的时间距离最后一次惊厥的时间越近，则GFAP mRNA表达上升越明显。这与本实验中大鼠惊厥后24小时内GFAP mRNA表达的动态变化一致。说明神经元的兴奋性对GFAP基因表达的调控既迅速又短暂。惊厥后，Cx43 mRNA上调出现高峰的时间较晚，且维持时间相对较长。这说明神经元的兴奋性对星形胶质细胞GFAP和Cx43基因表达的调控不呈平行关系。
本课题为卫生部科研基金资助项目
参考文献
1 Yu ACH, Lee YL, Eng LF. Astrogliosis in culture: Ⅰ The Model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res 1993, 34：295-303.
2 Steward O, Torre ER, Tomasulo R, et al. Neuronal activity up-regulates astroglial gene expression. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88：6819-6823.
(收稿：1997-03-13 修回：1997-12-25)
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单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：
中华医学杂志980529
神经系统损伤可引起星表胶质细胞反应性增生，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillray acidic protein，GFAP)合成增加是代表星形胶质细胞增生 的一个重要特点[1]。在星形胶质细胞增生的同时，是否伴有星形胶质细胞功能的变化，为此，我们从mRNA水平观察了惊厥大鼠脑内GFAP和星形胶质细胞之间缝隙连接蛋白Cx43基因表达的变化。
一、材料和方法
1.动物来源及筛选：P77PMC遗传性癫痫易感大鼠由本校实验动物中心提供，体重250～300 g。使用前2周给予120 dB铃声刺激1分钟，连续3天，选择惊厥反应Ⅴ级(潜伏期-奔跑-休止期-奔跑-强直阵挛性惊厥)的大鼠为研究对象。
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2.质粒：GFAP cDNA质粒由美国弗吉尼亚大学Oswald Steward博士赠送，Cx43 cDNA质粒由美国哈佛大学医学院David L Paul教授赠送，β-actin cDNA质粒由美国Morgan sheng博士赠送。
3.脑组织总RNA提取：大鼠经120 dB铃声刺激1分钟，分别于惊厥后0、0.5、1、2、4、8、12及24小时断头处死，取出大脑皮层、海马及皮层下组织，以异硫氰酸寡-酚-氯仿一步法提取组织中总RNA。
4.Northern印迹杂交：将转有RNA的尼龙膜预杂交4～6小时，分别与随机引物标记32P的GFAP cDNA、Cx43cDNA、β-actin cDNA探针进行杂交18～24小时，最后于0.1×标准枸橼酸盐水，0.1%十二烷基硫酸钠中洗膜，-70℃放射自显影48～72小时。
5.吸光度(A)测定：测定Northern印迹每个杂交带的总A值，实验内参照以同一样品的β-actin mRNA杂交量显示每个样品的加样。
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二、结果
P77PMC大鼠惊厥后脑内GFAPmRNA表达在大脑皮层、海马及皮层下有一共同规律，即均在惊厥后4小时 表达出现一高峰，分别较惊厥前增加65.8%，113.2%和55.3%，从8小时以后又逐渐恢复，到惊厥后24小时基本恢复到惊厥前水平。在惊厥后不同时间皮层、海马及皮层下β-actin mRNA杂交量与各样品加样量基本相同。
惊厥后在大脑皮层及海马Cx43 mRNA于惊厥后2小时表达量明显增加，8小时达高峰，较对照大鼠分别增加117.3%和70.6%，持续到24小时仍高于惊厥前；皮层下Cx43 mRNA于惊厥后4小时 表达明显增加，12小时达高峰，较对照大鼠增加65.4%，24小时仍高于惊厥前。惊厥后24小时大鼠与惊厥前比较在大脑皮层、海马及皮层下Cx43 mRNA的表达分别增加 69.4%，57.3%和51.1%。
三、讨论
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惊厥时星形胶质细胞Cx43 mRNA及GFAP mRNA表达增加，说明神经元的兴奋性能够上调Cx43及GFAP mRNA的基因表达。Steward等[2]在电点燃模型上发现，检测GFAP mRNA的时间距离最后一次惊厥的时间越近，则GFAP mRNA表达上升越明显。这与本实验中大鼠惊厥后24小时内GFAP mRNA表达的动态变化一致。说明神经元的兴奋性对GFAP基因表达的调控既迅速又短暂。惊厥后，Cx43 mRNA上调出现高峰的时间较晚，且维持时间相对较长。这说明神经元的兴奋性对星形胶质细胞GFAP和Cx43基因表达的调控不呈平行关系。
本课题为卫生部科研基金资助项目
参考文献
1 Yu ACH, Lee YL, Eng LF. Astrogliosis in culture: Ⅰ The Model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res 1993, 34：295-303.
2 Steward O, Torre ER, Tomasulo R, et al. Neuronal activity up-regulates astroglial gene expression. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88：6819-6823.
(收稿：1997-03-13 修回：1997-12-25)
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