蚓激酶抑制血小板聚集的实验观察
作者：张国平 钱睿哲 杨诗春 金惠铭
单位：200032 上海医科大学病理生理学教研室
关键词：
中华医学杂志980528 蚓激酶是从中药地龙(蚯蚓)中提炼出来的一种多份酶[1]。口服蚓激酶制剂对脑血栓、心肌梗塞等具有一定治疗效果[2]。我们已经发现[3]，蚓激酶在正常及高凝大鼠中均有一定的抗凝和激活纤维蛋白溶解的效果。作者进一步探讨正常和高凝大鼠体内用药后和体外加药后血小板聚集的变化，观察血小板聚集与血栓素A2(TXA2)和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)活性的关系，试图明确血小板聚集功能的变化在蚓激酶取得临床疗效的机制中所起的作用。
一、材料与方法
蚓激酶制剂(普恩复)由山东省青岛市双龙制药有限公司生产，批号：950402。动物用SD大鼠24只，体重200～250 g，雌雄各半(上海医科大学动物部提供)，随机分成以下4组：
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1.体内给药组(6只)：将蚓激酶注入胃内，剂量：2.5 mg*ml-1*100g-1，2次/日。次日灌药1次后用1%戊巴比妥钠(剂量：0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉。按文献[4]的方法复制大鼠高凝血症模型。复制模型后即刻从颈动脉取血3 ml，3.8%枸橼酸钠抗凝(1∶10)，制成富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。
2.体内对照组(6只)：用含蚓激酶基质的生理盐水代替蚓激酶，其它操作同上。
3.体外加药组(6只)：用6只正常大鼠血标本按同样方法制作PRP及PPP，然后加入蚓激酶，剂量2.5 mg/ml，体外孵育15分钟。
4.体外对照组(6只)：用含蚓激酶基质的生理盐水代替药物，其它操作同上。
血小板聚集率用SPA-4型血小板聚集仪测定，促聚剂用二磷酸腺苷(ADP)，浓度10 μmol/L。测定指标有一分钟聚集率(A1，)、最大聚集率(Amax)和最大聚集时间(Tmax)。测定血小板聚集时，以PPP调节PRP，使血小板浓度控制在(1.0～1.2)×109/L。以PRP的透光度为0%，PPP的透光度为100%，聚集仪自动记录曲线，计算结果。
, 百拇医药
在体外正常大鼠PRP中加入不同浓度的蚓激酶(0、1.25、2.50、5.00 mg/ml)，孵育10分钟后，连续3次测定血小板体外聚集率，以观察蚓激酶抑制体外血小板聚集的量-效关系。
第1和第2组大鼠分别取血4 ml，分离血浆，用125I标记的放免法(苏州医学院药箱)测定血浆中的TXB2及6-酮-PGF1α的含量。以我室测定的正常大鼠TXB2含量作100%，对TXB2变化的百分率与血小板最高聚集率之间作直线相关分析。按文献[3]的方法测血浆t-PA活性，并在t-PA活性(以2.0 IU/ml为100%)变化与血小板Amax间作直线相关分析。
所有实验数据以均值±标准差表示。组间对比或自身对比均用t检验，相关关系用直线相关分析。
二、结果
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1.蚓激酶对血小板聚集率的影响：高凝大鼠体内用药(2.5 mg*ml-1*100g-1)和正常大鼠PRP体外加药后(2.5 mg/ml)血小板聚集率的变化见表1。结果显示，用药组血小板聚集率均明显抑制(P<0.05)。
表1 蚓激酶对大鼠血小板聚集率的影响(
±s)
组别
鼠数
体内用药
体外加药
A1(%)
Amax(%)
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Tmax(s)
A1(%)
Amax(%)
Tmax(s)
用药组
6
13±11*
15±10*
60±28
10±7*
13± 7*
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128±108
对照组
6
26± 7
28± 7
62± 5
20±8
26±11
94± 64
* 与对照组比较P<0.05
此种抑制作用既可发生在高凝血液中，也存在于正常血液中。在体外用阿斯匹林(8mg/L)作阳性对照，结果显示血小板Amax为50%。
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2.灌服蚓激酶后血浆TXA2与PGI2的变化：高凝大鼠体内实验结果见表2。
表2 蚓激酶对大鼠血浆TXB2和6-
酮-PGF1α含量的影响(±s) 组别
鼠数
TXB2
(ng/ml)
6-酮-PGF1α
(ng/ml)
, 百拇医药
高凝大鼠
用药组
6
130±51*
35±10
对照组
6
267±47
44± 3
正常大鼠
用药组
6
135± 3
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133± 4
对照组
6
157±14
122± 9
与高凝大鼠对照组比较* P<0.01
3.高凝大鼠灌药后血浆TXB2和t-PA浓度变化与血小板最大聚集率(Amax)间的相关关系：两者间的直线相关方程为：Y=44.11+1.88X，r=0.92，P<0.05，由此说明TXB2浓度的下降与血小板聚集率的抑制呈显著正相关。
血小板Amax(%)与t-PA活性变化(%)间的直线相关方程为Y=180.85-0.32X，r=-0.88，P<0.05。结果说明t-PA活性与血小板Amax间呈显著负相关。
, 百拇医药
4.蚓激酶抑制体外血小板聚集的量-效关系：重复3次，结果一致。实验显示，随蚓激酶浓度升高，血小板聚集率的抑制明显加强，说明蚓激酶引起的体外血小板聚集有明显量-效关系。
三、讨论
我们以往的研究发现[4]，口服蚓激酶后体内出现内凝血途径抑制和t-PA活性增高。本研究结果又证明，蚓激酶无论在体内或体外(较大剂量时)均能抑制血小板聚集，且有明显的量效关系。这种抑制作用与用药后血浆TXA2含量的降低显著相关。至于t-PA活性与血小板聚集间的关系，目前存在不同的看法[5，6]。我们以往的研究显示，口服蚓激酶后t-PA活性增高，血栓形成抑制，本研究结果又证明，服蚓激酶后体内t-PA活性与血小板聚集间呈显著负相关。因此我们认为，t-PA对血小板聚集可能有抑制作用。血小板聚集的抑制是蚓激酶预防或治疗血栓性疾病的机制之一，而且此种作用在正常大鼠与高凝大鼠中均可出现，说明此药在血小板聚集的抑制上既有治疗作用，又有预防作用。参考文献
, http://www.100md.com
1 Makajima N, Mihara H, Sumi H, et al. Characterizatrion of potent fibrinolytic enzyme in earthworm. Biosci Biotechnol Biochem, 1993,57：1726～1730.
2 黄德铭，张国桢，陈百华，等.蚯蚓酶治疗脑血栓形成的临床探讨.中国急救医学杂志，1992，12：325-327.
3 金惠铭，曹翔，张国平，等.龙津对体外血栓形成、凝血及纤维蛋白溶解作用的实验研究.微循环技术杂志，1996，4：61-62.
4 朱益栋主编.弥散性血管内凝血.北京：人民卫生出版社，1982；279-293.
5 Kerins DM, Roy L, Fitzgerald GA, et al. Pletelet and vascular function during coronary thrombosis with tissue-type plasminogen activator. Circulation 1989, 80：1718-1725.
6 Loscalzo J，Vaughan DE. Tissue plasminogen activator promotes platelet disaggregation in plasma. J Clin Invest，1987，79：1749-1755.
(收稿：1997-08-08 修回：1998-02-11)
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单位：200032 上海医科大学病理生理学教研室
关键词：
中华医学杂志980528 蚓激酶是从中药地龙(蚯蚓)中提炼出来的一种多份酶[1]。口服蚓激酶制剂对脑血栓、心肌梗塞等具有一定治疗效果[2]。我们已经发现[3]，蚓激酶在正常及高凝大鼠中均有一定的抗凝和激活纤维蛋白溶解的效果。作者进一步探讨正常和高凝大鼠体内用药后和体外加药后血小板聚集的变化，观察血小板聚集与血栓素A2(TXA2)和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)活性的关系，试图明确血小板聚集功能的变化在蚓激酶取得临床疗效的机制中所起的作用。
一、材料与方法
蚓激酶制剂(普恩复)由山东省青岛市双龙制药有限公司生产，批号：950402。动物用SD大鼠24只，体重200～250 g，雌雄各半(上海医科大学动物部提供)，随机分成以下4组：
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1.体内给药组(6只)：将蚓激酶注入胃内，剂量：2.5 mg*ml-1*100g-1，2次/日。次日灌药1次后用1%戊巴比妥钠(剂量：0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉。按文献[4]的方法复制大鼠高凝血症模型。复制模型后即刻从颈动脉取血3 ml，3.8%枸橼酸钠抗凝(1∶10)，制成富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。
2.体内对照组(6只)：用含蚓激酶基质的生理盐水代替蚓激酶，其它操作同上。
3.体外加药组(6只)：用6只正常大鼠血标本按同样方法制作PRP及PPP，然后加入蚓激酶，剂量2.5 mg/ml，体外孵育15分钟。
4.体外对照组(6只)：用含蚓激酶基质的生理盐水代替药物，其它操作同上。
血小板聚集率用SPA-4型血小板聚集仪测定，促聚剂用二磷酸腺苷(ADP)，浓度10 μmol/L。测定指标有一分钟聚集率(A1，)、最大聚集率(Amax)和最大聚集时间(Tmax)。测定血小板聚集时，以PPP调节PRP，使血小板浓度控制在(1.0～1.2)×109/L。以PRP的透光度为0%，PPP的透光度为100%，聚集仪自动记录曲线，计算结果。
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在体外正常大鼠PRP中加入不同浓度的蚓激酶(0、1.25、2.50、5.00 mg/ml)，孵育10分钟后，连续3次测定血小板体外聚集率，以观察蚓激酶抑制体外血小板聚集的量-效关系。
第1和第2组大鼠分别取血4 ml，分离血浆，用125I标记的放免法(苏州医学院药箱)测定血浆中的TXB2及6-酮-PGF1α的含量。以我室测定的正常大鼠TXB2含量作100%，对TXB2变化的百分率与血小板最高聚集率之间作直线相关分析。按文献[3]的方法测血浆t-PA活性，并在t-PA活性(以2.0 IU/ml为100%)变化与血小板Amax间作直线相关分析。
所有实验数据以均值±标准差表示。组间对比或自身对比均用t检验，相关关系用直线相关分析。
二、结果
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1.蚓激酶对血小板聚集率的影响：高凝大鼠体内用药(2.5 mg*ml-1*100g-1)和正常大鼠PRP体外加药后(2.5 mg/ml)血小板聚集率的变化见表1。结果显示，用药组血小板聚集率均明显抑制(P<0.05)。
表1 蚓激酶对大鼠血小板聚集率的影响(
±s)组别
鼠数
体内用药
体外加药
A1(%)
Amax(%)
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Tmax(s)
A1(%)
Amax(%)
Tmax(s)
用药组
6
13±11*
15±10*
60±28
10±7*
13± 7*
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128±108
对照组
6
26± 7
28± 7
62± 5
20±8
26±11
94± 64
* 与对照组比较P<0.05
此种抑制作用既可发生在高凝血液中，也存在于正常血液中。在体外用阿斯匹林(8mg/L)作阳性对照，结果显示血小板Amax为50%。
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2.灌服蚓激酶后血浆TXA2与PGI2的变化：高凝大鼠体内实验结果见表2。
表2 蚓激酶对大鼠血浆TXB2和6-
酮-PGF1α含量的影响(
±s) 组别鼠数
TXB2
(ng/ml)
6-酮-PGF1α
(ng/ml)
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高凝大鼠
用药组
6
130±51*
35±10
对照组
6
267±47
44± 3
正常大鼠
用药组
6
135± 3
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133± 4
对照组
6
157±14
122± 9
与高凝大鼠对照组比较* P<0.01
3.高凝大鼠灌药后血浆TXB2和t-PA浓度变化与血小板最大聚集率(Amax)间的相关关系：两者间的直线相关方程为：Y=44.11+1.88X，r=0.92，P<0.05，由此说明TXB2浓度的下降与血小板聚集率的抑制呈显著正相关。
血小板Amax(%)与t-PA活性变化(%)间的直线相关方程为Y=180.85-0.32X，r=-0.88，P<0.05。结果说明t-PA活性与血小板Amax间呈显著负相关。
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4.蚓激酶抑制体外血小板聚集的量-效关系：重复3次，结果一致。实验显示，随蚓激酶浓度升高，血小板聚集率的抑制明显加强，说明蚓激酶引起的体外血小板聚集有明显量-效关系。
三、讨论
我们以往的研究发现[4]，口服蚓激酶后体内出现内凝血途径抑制和t-PA活性增高。本研究结果又证明，蚓激酶无论在体内或体外(较大剂量时)均能抑制血小板聚集，且有明显的量效关系。这种抑制作用与用药后血浆TXA2含量的降低显著相关。至于t-PA活性与血小板聚集间的关系，目前存在不同的看法[5，6]。我们以往的研究显示，口服蚓激酶后t-PA活性增高，血栓形成抑制，本研究结果又证明，服蚓激酶后体内t-PA活性与血小板聚集间呈显著负相关。因此我们认为，t-PA对血小板聚集可能有抑制作用。血小板聚集的抑制是蚓激酶预防或治疗血栓性疾病的机制之一，而且此种作用在正常大鼠与高凝大鼠中均可出现，说明此药在血小板聚集的抑制上既有治疗作用，又有预防作用。参考文献
, http://www.100md.com
1 Makajima N, Mihara H, Sumi H, et al. Characterizatrion of potent fibrinolytic enzyme in earthworm. Biosci Biotechnol Biochem, 1993,57：1726～1730.
2 黄德铭，张国桢，陈百华，等.蚯蚓酶治疗脑血栓形成的临床探讨.中国急救医学杂志，1992，12：325-327.
3 金惠铭，曹翔，张国平，等.龙津对体外血栓形成、凝血及纤维蛋白溶解作用的实验研究.微循环技术杂志，1996，4：61-62.
4 朱益栋主编.弥散性血管内凝血.北京：人民卫生出版社，1982；279-293.
5 Kerins DM, Roy L, Fitzgerald GA, et al. Pletelet and vascular function during coronary thrombosis with tissue-type plasminogen activator. Circulation 1989, 80：1718-1725.
6 Loscalzo J，Vaughan DE. Tissue plasminogen activator promotes platelet disaggregation in plasma. J Clin Invest，1987，79：1749-1755.
(收稿：1997-08-08 修回：1998-02-11)
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