反义c-myc寡脱氧核苷酸对大鼠腹主动脉损伤后内膜增生的影响
作者：王家宁 胡大一 刘克英 刘勃 高天祥
单位：100020 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院心脏中心(王家宁[现在湖北省十堰市郧阳医学院附属太和医院心内科442000]胡大一、刘勃)；湖北省十堰市人民医院(刘克英)；首都医科大学分子生物学教研室(高天祥)
关键词：寡核苷酸类，反义；血管内膜增生
中华医学杂志980526 【摘要】 目的 观察大鼠腹主动脉损伤后内膜增生的影响，为采用反义c-myc战略防治再狭窄的早期临床试验奠定基础。方法 将反义c-myc反义寡脱氧核苷酸(ODN)通过pluronic gel缓释系统和Lipofectin转染导入系统，将其作用于大鼠腹主动脉损伤后的血管外膜，饲养三周后，处死动物，对所取的血管节段进行组织切片和弹力纤维染色，在显微镜下进行形态观察和采用图像分析系统进行图像分析，计算出内膜/中膜(I/M)面积之比和I/M厚度之比，并进行统计学分析。结果 通过形态观察和I/M面积和I/M厚度之比，发现反义c-myc ODN明显抑制了内膜增生，而且随着反义c-myc ODN剂量的增加，其对内膜增生的抑制作用更加明显，而正义c-myc ODN和错配c-myc ODN与对照组相比，对内膜增生无影响。结论 反义c-myc ODN以剂量依赖性和序列特异性方式抑制了新生内膜的形成。为采用反义c-myc途径防治再狭窄的早期临床试验奠定了基础。
, 百拇医药
The inhibitory effect of antisense phosphorothioate c-myc oligodeoxynucleotide on intimal hyperplasia in rat abdominal aortae after injury with a balloon catheter Wang Jianing, Hu Dayi, Liu Keying, et al. Heart center, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100020
【Abstract 】 Objective To evaluate the effect of Antisense phosphorothioate c-myc oligodeoxynucleotide (ODN) on intimal hyperplasia in rat abdominal aortae induced by endothenial-denuded injury with a balloon catheter. Methods Antisense c-myc ODN was applied to the adventitia of injured abdominal aortae in rat introduced by pluronic gel releasing system and lipofectin delivery system. The animals were feeded with routine diet. Three weeks after intervention, the animals were killed and defined segments of arteries were sectioned and the histological sections were stained with elastic fiber staining. The cross-section of the artery was examined microscopically and the image was digitalized by image analysis system. The intima/media(I/M) area and I/M thickness ratios were calculated and analyzed statistically among groups. Results The intimal hyperplasia in antisense c-myc ODN-treated rats was inhibited significantly, demonstrated by microscopically and I/M area and thichness ratios, as compared with that treated with sense c-myc ODN and mismatch c-myc ODN. The larger dose of antisense c-myc ODN, the more obvious the suppression of intimal hyperplasia.Conclusion The results suggest antisense c-myc ODN significantly suppressed the intimal hyperplasia in injured rat aortae in a sequence-specific fashion and dose-dependent manner. The investigation provides the basis for the early clinical trials assessing the therapeutic potential of antisense c-myc approach for the prevention of restenosis after angioplasty.
, 百拇医药
【Key words 】 Oligodeoxynucleotides, antisense Tunica intima hyperplasia, restenosis
(Natl Med J China, 1998, 78:388-391)
采用针对大鼠c-myc mRNA包括腺嘌呤(AUG)在内的前5个密码子的翻译起始区的反义c-myc反义寡脱氧核苷酸(ODN)，以lipofectin作为携带系统，以pluronic gel作为缓释系统，将反义c-myc ODN涂敷于动脉球囊拉伤后大鼠腹主动脉血管外膜，观察了反义c-myc ODN涂敷于动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响，为采用反义c-myc战略防止再狭窄的临床试验奠定基础。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药 1.Lipofectin购自GIBCO/BRL公司；pluronic gel购自Sigma公司；2F Fogarty导管(arterial embolectomy catheter)购自美国Baxter healthcare coporation；图像分析仪；SD大鼠(雄性，500g左右)购自首都医科大学动物室。
二、方法
1.ODN的合成及其序列：ODN由美国Research公司合成；ODN经高压液相色谱法(HPLC)纯化，冻干保存。ODN的5′和3′端各3个磷酸二酯键经过硫代磷酸修饰。正义ODN序列与靶序列的一致，反义ODN序列与靶序列互补，错配ODN序列的碱基组成与反义ODN序列一样，但和靶序列不完全互补。序列如下：正义(Sense)c-myc序列5′ATG CCC CTC AAC GTG3′；反义(Antisense)c-myc序列5′CAC GTT GAG GGG CAT3′；错配(Mismatch)c-myc序列5′CAC GTG GAG TGG CAT3′。
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2.实验分组：每组3只大鼠。假手术组：在腹股沟找到髂股动脉后，对腹主动脉不作球囊拉伤处理。对照组：对腹主动脉球囊拉伤后不作其它处理。pluronicgel组：对腹主动脉损伤后，在肾动脉分支以下的1 cm腹主动脉血管外膜涂以0.25% pluronic gel(PBS配制)。Lipofectin组：血管外膜涂以200 μl含20 μg lipofectin的0.25% pluronic gel的PBS。正义ODN组：血管外膜涂以200 μl含正义c-myc ODN 200 μg，lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel的PBS。错配ODN组：血管外膜涂以200 μl含错配c-myc ODN 200 μg，lipofectin 20 μg，0.25%pluronic gel的PBS。反义ODN 100 μg组：血管外膜涂以200 μl含反义c-myc ODN 100 μg,lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel的PBS。反义ODN 200 μg组：血管外膜涂以200 μl含反义-myc ODN 200 μg，lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel 的PBS；反义300 μg组：血管外膜涂以200 μl含反义c-myc ODN 300 μg，lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel的PBS。
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3.动脉球囊拉伤模型的制备：用3%戊巴比妥钠按30 mg/kg体重给药，腹腔注射。待麻醉成功后，将动物固定于手术台上。先寻找并分离右髂股动脉，结扎远端，近端打一活结，用动脉夹夹住髂动脉近端后，剪开动脉壁，在探针的引导下用2F Fogarty导管插入髂动脉内，轻轻缓慢松开动脉夹，轻系近端活结。将导管送至腹主动脉上端，向气囊推入0.2 ml空气充盈气囊，缓慢后移导管，直至退至髂动脉处，回抽注射器，使气囊回缩。然后按上述方法来回拉伤腹主动脉5次后，退出导管，缝合伤口。当动脉拉伤后，打开腹腔，寻找腹主动脉，在肾动脉分支以下1 cm的腹主动脉为给药范围。将事先准备好的ODN涂敷于血管外膜，待pluronic gel粘附固着于动脉壁后，缝合伤口。将动物置于温度适宜的清洁无菌通风环境中分组饲养三周。
4.原位灌注固定：饲养三周后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠。待麻醉充分后，打开腹腔，找到腹主动脉，在给药部位置一丝线作标记，然后打开胸腔，用0.1 mol/L PBS的4%多聚甲醛进行原位灌注固定。固定充分后，取下所需血管节段。
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5.组织切片和图像分析：将血管段进行组织切片和弹力纤维染色后，在显微镜下观察内膜增生情况，拍照以作记录。经弹力纤维染色的组织切片，采用图像分析仪进行图像分析。每组三只动物中，每只动物取2张切片进行分析。计算出内膜/中膜(I/M)的面积之比和I/M厚度之比。图像分析由不知情者操作。
6.统计学处理：文中数据采用SPSS统计软件处理。多组之间的两两比较采用q检验。P<0.05，有显著性意义。
结果
一、形态观察(图1～6)：大鼠腹主动脉拉伤后内皮剥脱，说明球囊拉伤动脉模型成功；在假手术组，血管内膜有完整的内皮细胞覆盖，无内膜增生；在正义c-myc ODN组，错配c-myc ODN组，lipofectin组，pluronic gel组内膜均有显著增生，与对照组相比，内膜增生程度无显著差别；在反义c-myc ODN 100 μg组、200 μg组、300 μg组，可见内膜增生被显著抑制，而且随着反义c-myc ODN剂量的增加，抑制作用越来越明显，在反义c-myc ODN 300 μg组，内膜增生几乎完全被抑制，且有部分内皮细胞再生。说明反义c-myc ODN对大鼠球囊损伤后新生内膜形成的抑制具有序列特异性和剂量依赖性。
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附表 反义c-myc ODN对大鼠腹主动脉损伤后I/M面积和
I/M厚度之比的影响(
±s) 组 别
鼠数
I/M面积之比
I/M厚度之比
对照组
3
0.83±0.13
1.06±0.05
Lipofectin组
, 百拇医药
3
0.89±0.06
1.08±0.10
Sense组
3
0.85±0.10
0.99±0.19
Mismatch组
3
0.88±0.01
1.13±0.07
Pluronicgel组
, 百拇医药
3
0.88±0.18
1.12±0.36
Antisense 100μg组
3
0.23±0.03*
0.25±0.03*
Antisense 200μg组
3
0.15±0.01*
0.22±0.05*
, 百拇医药
Antisense 300μg组
3
0.011±0.002△*
0.016±0.004*△
注：与对照组相比，* P<0.01；与Antisense 100μg组相比，△ P<0.05
二、图像分析(附表)：I/M面积之比和I/M厚度之比在正义ODN组、错配ODN组、lipofectin组、
图1 对照组 图2、3、4 分别为反义c-myc ODN 100μg，200μg，300μg组 图5 正义c-myc ODN组 图6 错配c-myc ODN组嵌合性硫代修饰的反义c-myc ODN对大鼠腹主动脉球囊损伤后内膜增生的抑制作用
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pluronic gel组和对照组之间差异均无显著性意义；上述各组与反义c-myc ODN 100 μg组，200 μg组，300 μg组间差异均有显著意义，P<0.01，随着反义c-myc ODN剂量的加大，I/M的面积之比，I/M厚度之比均越来越小。图像分析进一步证实了反义c-myc ODN对球囊拉伤动脉后内膜增生的抑制具有序列特异性和剂量依赖性。
讨论
针对c-myb,PCNA,cdk2激酶和cdc2激酶的反义ODN抑制大鼠动脉损伤后新生内膜的形成已获得成功[1～4]。我们采用嵌合性硫代修饰的反义c-myc ODN通过pluronic gel缓释系统和lipofectin转染系统作用于大鼠腹主动脉拉伤后的血管外膜，显著抑制了新生内膜的形成。这为采用反义技术防止再狭窄的早期临床试验奠定了基础。
1.反义ODN的设计：在原核生物中，针对翻译起始区的反义ODN均能抑制相应基因的表达。真核生物中，因其基因组的复杂性，使得设计反义ODN时所针对的序列只能根据理论上的推测和实际经验而定。我们设计的反义c-myc ODN所针对的靶序是大鼠c-myc mRNA翻译起始区的前5个密码子，因该区较少含有二级结构，便于反义ODN与靶序列结合。要使反义ODN在体内发挥作用，必须避免细胞内外各种核酸酶的降解，要有足够长的半衰期。为增加反义ODN的稳定性，本文对反义c-myc ODN进行了硫代磷酸修饰。为使硫代修饰的ODN与靶序列的亲合性不降低，仅对ODN的两端进行修饰，两端的修饰是抵抗核酸酶所必需的。
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2.血管外膜作为给药途径：采用血管外膜给药，目的在于使血管局部在较长一段时间内维持较高的浓度。血管外膜是血管壁中相对忽视的一层，在再狭窄的形成中起重要作用。血管外膜可用来传送针对血管中膜、内膜病变的药物。在有内膜病变的血管，血管滋养管可到达内膜，外膜给药可能是通过血管滋养管进入血管内膜的[5]。
3.Pluronic gel作为缓释系统：自从Simons等[4]采用pluronic gel作为ODN的缓释系统以来，已有不少学者采用了此方法，我们为了使反义c-myc ODN在血管局部作用较长一段时间，也采用了该方法。Pluronic gel的特点是4℃呈液态，37℃时与组织接触时呈固态。Villa[6]对反义c-myb ODN的pluronic gel的体外缓释试验表明，51小时和67小时时分别有90%和100%释放出来。通过pluronic gel缓释系统将FITC标记的反义c-myb ODN作用于血管外膜，24小时时外膜的荧光很强，许多中膜SMC胞浆和胞核深染，一直持续到动脉损伤后72小时，在给予ODN 72小时后管壁仍有完整的ODN。
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4.Lipofectin作为转染系统：我们为增加细胞对反义c-myc ODN的摄取，避免核酸酶的降解，采用lipofectin作为转染系统。Morishita等[3]采用cdk2反义ODN抑制大鼠颈动脉损伤后内膜增生无效，但用liposome作为转染系统后，对内膜增生的抑制达30%，说明liposome作为转染系统的重要性。
5.反义c-myc ODN防治再狭窄的应用前景：c-myc蛋白在抑制细胞增殖中起着十分关键的作用，它是细胞从Go/G1期进入S期的驱动因子，是决定细胞终末分化还是继续增殖的选择开关。我们的研究结果发现，给予c-myc AS-ODN组，其内膜增生被显著抑制，且呈剂量依赖性。反义c-myc ODN导入血管壁后很可能是抑制了球囊损伤后SMC的增殖而抑制内膜增生的。当然，c-myc AS-ODN也可能通过干预SMC的迁移，凋亡和细胞外基质的合成与分泌而达到此作用的。本研究结果说明，反义c-myc ODN对再狭窄的防治有潜在的应用价值。随着对反义ODN的摄入方式和作用机制的阐明，转染效率和稳定性的提高，反义技术有可能用于再狭窄的防治。
, 百拇医药
参考文献
1 Abe J, ZHou W, Taguchi J, et al. Suppression of neointimal smooth muscle cell accumulation in vivo by antisense cdc2 and cdk oligonucleotides in rat carotid artery. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 198:16-24.
2 Morishita R, Gibbons GH, Ellison KE, et al. Single intraluminal delivery of antisense cdc2 kinase and proliferating cell nuclear antigen oligonucleotides results in chronic inhibition of neointimal hyperplasia. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:8474-8478.
, 百拇医药
3 Morishita R, Gibbons GH, Ellison KE, et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest, 1994, 93:1458-1464.
4 Simons M, Edelman ER, DeKeyser J, et al. Antisense c-myb oligonucleotides inhibit arterial smooth muscle cell accumulation in vivo. Nature, 1992, 359:67-70.
5 Huehns TY, Gonschior P, Hofling B. Adventitia as a target for intravascular local drug delivery. Bri Heart J, 1996, 75:537-538.
6 Villa AE, Guzman VL, Poptic EJ, et al. Effects of antisense c-myb oligonucleotides on vascular smooth muscle cell proliferation and response to vesse wall injury. Cir Res, 1995, 76:503-513.
(收稿：1997-04-02 修回：1997-10-21), 百拇医药
单位：100020 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院心脏中心(王家宁[现在湖北省十堰市郧阳医学院附属太和医院心内科442000]胡大一、刘勃)；湖北省十堰市人民医院(刘克英)；首都医科大学分子生物学教研室(高天祥)
关键词：寡核苷酸类，反义；血管内膜增生
中华医学杂志980526 【摘要】 目的 观察大鼠腹主动脉损伤后内膜增生的影响，为采用反义c-myc战略防治再狭窄的早期临床试验奠定基础。方法 将反义c-myc反义寡脱氧核苷酸(ODN)通过pluronic gel缓释系统和Lipofectin转染导入系统，将其作用于大鼠腹主动脉损伤后的血管外膜，饲养三周后，处死动物，对所取的血管节段进行组织切片和弹力纤维染色，在显微镜下进行形态观察和采用图像分析系统进行图像分析，计算出内膜/中膜(I/M)面积之比和I/M厚度之比，并进行统计学分析。结果 通过形态观察和I/M面积和I/M厚度之比，发现反义c-myc ODN明显抑制了内膜增生，而且随着反义c-myc ODN剂量的增加，其对内膜增生的抑制作用更加明显，而正义c-myc ODN和错配c-myc ODN与对照组相比，对内膜增生无影响。结论 反义c-myc ODN以剂量依赖性和序列特异性方式抑制了新生内膜的形成。为采用反义c-myc途径防治再狭窄的早期临床试验奠定了基础。
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The inhibitory effect of antisense phosphorothioate c-myc oligodeoxynucleotide on intimal hyperplasia in rat abdominal aortae after injury with a balloon catheter Wang Jianing, Hu Dayi, Liu Keying, et al. Heart center, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100020
【Abstract 】 Objective To evaluate the effect of Antisense phosphorothioate c-myc oligodeoxynucleotide (ODN) on intimal hyperplasia in rat abdominal aortae induced by endothenial-denuded injury with a balloon catheter. Methods Antisense c-myc ODN was applied to the adventitia of injured abdominal aortae in rat introduced by pluronic gel releasing system and lipofectin delivery system. The animals were feeded with routine diet. Three weeks after intervention, the animals were killed and defined segments of arteries were sectioned and the histological sections were stained with elastic fiber staining. The cross-section of the artery was examined microscopically and the image was digitalized by image analysis system. The intima/media(I/M) area and I/M thickness ratios were calculated and analyzed statistically among groups. Results The intimal hyperplasia in antisense c-myc ODN-treated rats was inhibited significantly, demonstrated by microscopically and I/M area and thichness ratios, as compared with that treated with sense c-myc ODN and mismatch c-myc ODN. The larger dose of antisense c-myc ODN, the more obvious the suppression of intimal hyperplasia.Conclusion The results suggest antisense c-myc ODN significantly suppressed the intimal hyperplasia in injured rat aortae in a sequence-specific fashion and dose-dependent manner. The investigation provides the basis for the early clinical trials assessing the therapeutic potential of antisense c-myc approach for the prevention of restenosis after angioplasty.
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【Key words 】 Oligodeoxynucleotides, antisense Tunica intima hyperplasia, restenosis
(Natl Med J China, 1998, 78:388-391)
采用针对大鼠c-myc mRNA包括腺嘌呤(AUG)在内的前5个密码子的翻译起始区的反义c-myc反义寡脱氧核苷酸(ODN)，以lipofectin作为携带系统，以pluronic gel作为缓释系统，将反义c-myc ODN涂敷于动脉球囊拉伤后大鼠腹主动脉血管外膜，观察了反义c-myc ODN涂敷于动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响，为采用反义c-myc战略防止再狭窄的临床试验奠定基础。
材料与方法
一、材料
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二、方法
1.ODN的合成及其序列：ODN由美国Research公司合成；ODN经高压液相色谱法(HPLC)纯化，冻干保存。ODN的5′和3′端各3个磷酸二酯键经过硫代磷酸修饰。正义ODN序列与靶序列的一致，反义ODN序列与靶序列互补，错配ODN序列的碱基组成与反义ODN序列一样，但和靶序列不完全互补。序列如下：正义(Sense)c-myc序列5′ATG CCC CTC AAC GTG3′；反义(Antisense)c-myc序列5′CAC GTT GAG GGG CAT3′；错配(Mismatch)c-myc序列5′CAC GTG GAG TGG CAT3′。
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2.实验分组：每组3只大鼠。假手术组：在腹股沟找到髂股动脉后，对腹主动脉不作球囊拉伤处理。对照组：对腹主动脉球囊拉伤后不作其它处理。pluronicgel组：对腹主动脉损伤后，在肾动脉分支以下的1 cm腹主动脉血管外膜涂以0.25% pluronic gel(PBS配制)。Lipofectin组：血管外膜涂以200 μl含20 μg lipofectin的0.25% pluronic gel的PBS。正义ODN组：血管外膜涂以200 μl含正义c-myc ODN 200 μg，lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel的PBS。错配ODN组：血管外膜涂以200 μl含错配c-myc ODN 200 μg，lipofectin 20 μg，0.25%pluronic gel的PBS。反义ODN 100 μg组：血管外膜涂以200 μl含反义c-myc ODN 100 μg,lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel的PBS。反义ODN 200 μg组：血管外膜涂以200 μl含反义-myc ODN 200 μg，lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel 的PBS；反义300 μg组：血管外膜涂以200 μl含反义c-myc ODN 300 μg，lipofectin 20 μg，0.25% pluronic gel的PBS。
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3.动脉球囊拉伤模型的制备：用3%戊巴比妥钠按30 mg/kg体重给药，腹腔注射。待麻醉成功后，将动物固定于手术台上。先寻找并分离右髂股动脉，结扎远端，近端打一活结，用动脉夹夹住髂动脉近端后，剪开动脉壁，在探针的引导下用2F Fogarty导管插入髂动脉内，轻轻缓慢松开动脉夹，轻系近端活结。将导管送至腹主动脉上端，向气囊推入0.2 ml空气充盈气囊，缓慢后移导管，直至退至髂动脉处，回抽注射器，使气囊回缩。然后按上述方法来回拉伤腹主动脉5次后，退出导管，缝合伤口。当动脉拉伤后，打开腹腔，寻找腹主动脉，在肾动脉分支以下1 cm的腹主动脉为给药范围。将事先准备好的ODN涂敷于血管外膜，待pluronic gel粘附固着于动脉壁后，缝合伤口。将动物置于温度适宜的清洁无菌通风环境中分组饲养三周。
4.原位灌注固定：饲养三周后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠。待麻醉充分后，打开腹腔，找到腹主动脉，在给药部位置一丝线作标记，然后打开胸腔，用0.1 mol/L PBS的4%多聚甲醛进行原位灌注固定。固定充分后，取下所需血管节段。
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5.组织切片和图像分析：将血管段进行组织切片和弹力纤维染色后，在显微镜下观察内膜增生情况，拍照以作记录。经弹力纤维染色的组织切片，采用图像分析仪进行图像分析。每组三只动物中，每只动物取2张切片进行分析。计算出内膜/中膜(I/M)的面积之比和I/M厚度之比。图像分析由不知情者操作。
6.统计学处理：文中数据采用SPSS统计软件处理。多组之间的两两比较采用q检验。P<0.05，有显著性意义。
结果
一、形态观察(图1～6)：大鼠腹主动脉拉伤后内皮剥脱，说明球囊拉伤动脉模型成功；在假手术组，血管内膜有完整的内皮细胞覆盖，无内膜增生；在正义c-myc ODN组，错配c-myc ODN组，lipofectin组，pluronic gel组内膜均有显著增生，与对照组相比，内膜增生程度无显著差别；在反义c-myc ODN 100 μg组、200 μg组、300 μg组，可见内膜增生被显著抑制，而且随着反义c-myc ODN剂量的增加，抑制作用越来越明显，在反义c-myc ODN 300 μg组，内膜增生几乎完全被抑制，且有部分内皮细胞再生。说明反义c-myc ODN对大鼠球囊损伤后新生内膜形成的抑制具有序列特异性和剂量依赖性。
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附表 反义c-myc ODN对大鼠腹主动脉损伤后I/M面积和
I/M厚度之比的影响(
±s) 组 别鼠数
I/M面积之比
I/M厚度之比
对照组
3
0.83±0.13
1.06±0.05
Lipofectin组
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3
0.89±0.06
1.08±0.10
Sense组
3
0.85±0.10
0.99±0.19
Mismatch组
3
0.88±0.01
1.13±0.07
Pluronicgel组
, 百拇医药
3
0.88±0.18
1.12±0.36
Antisense 100μg组
3
0.23±0.03*
0.25±0.03*
Antisense 200μg组
3
0.15±0.01*
0.22±0.05*
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Antisense 300μg组
3
0.011±0.002△*
0.016±0.004*△
注：与对照组相比，* P<0.01；与Antisense 100μg组相比，△ P<0.05
二、图像分析(附表)：I/M面积之比和I/M厚度之比在正义ODN组、错配ODN组、lipofectin组、
图1 对照组 图2、3、4 分别为反义c-myc ODN 100μg，200μg，300μg组 图5 正义c-myc ODN组 图6 错配c-myc ODN组嵌合性硫代修饰的反义c-myc ODN对大鼠腹主动脉球囊损伤后内膜增生的抑制作用
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pluronic gel组和对照组之间差异均无显著性意义；上述各组与反义c-myc ODN 100 μg组，200 μg组，300 μg组间差异均有显著意义，P<0.01，随着反义c-myc ODN剂量的加大，I/M的面积之比，I/M厚度之比均越来越小。图像分析进一步证实了反义c-myc ODN对球囊拉伤动脉后内膜增生的抑制具有序列特异性和剂量依赖性。
讨论
针对c-myb,PCNA,cdk2激酶和cdc2激酶的反义ODN抑制大鼠动脉损伤后新生内膜的形成已获得成功[1～4]。我们采用嵌合性硫代修饰的反义c-myc ODN通过pluronic gel缓释系统和lipofectin转染系统作用于大鼠腹主动脉拉伤后的血管外膜，显著抑制了新生内膜的形成。这为采用反义技术防止再狭窄的早期临床试验奠定了基础。
1.反义ODN的设计：在原核生物中，针对翻译起始区的反义ODN均能抑制相应基因的表达。真核生物中，因其基因组的复杂性，使得设计反义ODN时所针对的序列只能根据理论上的推测和实际经验而定。我们设计的反义c-myc ODN所针对的靶序是大鼠c-myc mRNA翻译起始区的前5个密码子，因该区较少含有二级结构，便于反义ODN与靶序列结合。要使反义ODN在体内发挥作用，必须避免细胞内外各种核酸酶的降解，要有足够长的半衰期。为增加反义ODN的稳定性，本文对反义c-myc ODN进行了硫代磷酸修饰。为使硫代修饰的ODN与靶序列的亲合性不降低，仅对ODN的两端进行修饰，两端的修饰是抵抗核酸酶所必需的。
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2.血管外膜作为给药途径：采用血管外膜给药，目的在于使血管局部在较长一段时间内维持较高的浓度。血管外膜是血管壁中相对忽视的一层，在再狭窄的形成中起重要作用。血管外膜可用来传送针对血管中膜、内膜病变的药物。在有内膜病变的血管，血管滋养管可到达内膜，外膜给药可能是通过血管滋养管进入血管内膜的[5]。
3.Pluronic gel作为缓释系统：自从Simons等[4]采用pluronic gel作为ODN的缓释系统以来，已有不少学者采用了此方法，我们为了使反义c-myc ODN在血管局部作用较长一段时间，也采用了该方法。Pluronic gel的特点是4℃呈液态，37℃时与组织接触时呈固态。Villa[6]对反义c-myb ODN的pluronic gel的体外缓释试验表明，51小时和67小时时分别有90%和100%释放出来。通过pluronic gel缓释系统将FITC标记的反义c-myb ODN作用于血管外膜，24小时时外膜的荧光很强，许多中膜SMC胞浆和胞核深染，一直持续到动脉损伤后72小时，在给予ODN 72小时后管壁仍有完整的ODN。
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4.Lipofectin作为转染系统：我们为增加细胞对反义c-myc ODN的摄取，避免核酸酶的降解，采用lipofectin作为转染系统。Morishita等[3]采用cdk2反义ODN抑制大鼠颈动脉损伤后内膜增生无效，但用liposome作为转染系统后，对内膜增生的抑制达30%，说明liposome作为转染系统的重要性。
5.反义c-myc ODN防治再狭窄的应用前景：c-myc蛋白在抑制细胞增殖中起着十分关键的作用，它是细胞从Go/G1期进入S期的驱动因子，是决定细胞终末分化还是继续增殖的选择开关。我们的研究结果发现，给予c-myc AS-ODN组，其内膜增生被显著抑制，且呈剂量依赖性。反义c-myc ODN导入血管壁后很可能是抑制了球囊损伤后SMC的增殖而抑制内膜增生的。当然，c-myc AS-ODN也可能通过干预SMC的迁移，凋亡和细胞外基质的合成与分泌而达到此作用的。本研究结果说明，反义c-myc ODN对再狭窄的防治有潜在的应用价值。随着对反义ODN的摄入方式和作用机制的阐明，转染效率和稳定性的提高，反义技术有可能用于再狭窄的防治。
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参考文献
1 Abe J, ZHou W, Taguchi J, et al. Suppression of neointimal smooth muscle cell accumulation in vivo by antisense cdc2 and cdk oligonucleotides in rat carotid artery. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 198:16-24.
2 Morishita R, Gibbons GH, Ellison KE, et al. Single intraluminal delivery of antisense cdc2 kinase and proliferating cell nuclear antigen oligonucleotides results in chronic inhibition of neointimal hyperplasia. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:8474-8478.
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3 Morishita R, Gibbons GH, Ellison KE, et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest, 1994, 93:1458-1464.
4 Simons M, Edelman ER, DeKeyser J, et al. Antisense c-myb oligonucleotides inhibit arterial smooth muscle cell accumulation in vivo. Nature, 1992, 359:67-70.
5 Huehns TY, Gonschior P, Hofling B. Adventitia as a target for intravascular local drug delivery. Bri Heart J, 1996, 75:537-538.
6 Villa AE, Guzman VL, Poptic EJ, et al. Effects of antisense c-myb oligonucleotides on vascular smooth muscle cell proliferation and response to vesse wall injury. Cir Res, 1995, 76:503-513.
(收稿：1997-04-02 修回：1997-10-21), 百拇医药