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编号:10228186
烫伤大鼠组织脂多糖结合蛋白mRNA表达的动态变化
http://www.100md.com 《中华创伤杂志》 1998年第5期
     作者:翟红霞 姚咏明 方文慧 陆连荣 田惠民 盛志勇

    单位:翟红霞 姚咏明 方文慧 陆连荣 田惠民 盛志勇 100037 北京,解放军第三O四医院烧伤研究所基础部

    关键词:烫伤;脂多糖结合蛋白;基因表达;内毒素血症

    中华创伤杂志980511 【摘要】 目的 探讨烫伤后不同组织脂多糖结合蛋白(LBP)mRNA的动态表达及其与内毒素血症的关系。方法 采用大鼠35%体表面积Ⅲ度烫伤模型,实验动物随机分为正常对照组、烫伤组和多粘菌素B治疗组。血浆内毒素水平测定采用改良过氯酸预处理血浆、偶氮显色法鲎实验定量测定,组织LBP mRNA含量采用RT-PCR法。结果 烫伤后门静脉及体循环内毒素水平均显著升高,8小时达峰值。给予多粘菌素B治疗可不同程度地降低血浆内毒素水平。正常组织可表达少量LBP,烫伤后2小时不同组织LBP mRNA表达较对照值有显著升高(P<0.05~0.01),8小时达峰值,约为对照值的2~2.5倍,且一直持续至伤后24小时。给予多粘菌素B抗内毒素治疗,可不同程度抑制肺、肠、肾组织LBP mRNA的表达(P<0.05~0.01)。相关分析显示,门静脉内毒素水平与肺组织LBP mRNA呈显著正相关(r=0.412, P<0.05),但与肝、肠、肾组织无显著相关性。结论 组织LBP mRNA表达在烧伤后显著增多,肠源性内毒素血症可能是刺激组织LBP基因表达的重要因素之一。
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    Dynamic Changes of mRNA Expression in Tissue Lipopolysaccharide-Binding Protein in Rats After Thermal Injury ZHAI Hong-xia, YAO Yong-ming, FANG Wen-hui, et al. Burn Institute, 304th Hospital of PLA, Beijing 100037

    【Abstract】 Aim To observe the dynamic changes of mRNA expression in lipopolysaccharide-binding protein (LBP) and the relationship between LBP mRNA and gut-derived endotoxemia after thermal injury. Methods Fifty-six male Wistar rats were subjected to a 35% total body surface area full-thickness thermal injury, and randomly divided into the normal control group, 35% Ⅲ° injury group and the polymyxin B treatment group. Plasma endotoxin was determined by limulus amebocyte lysate, and the tissue LBP mRNA expression was measured by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results It was found that a significant elevation of endotoxin concentration in both of portal and systemic circulation was observed at 2 hours after burns, peaking at 8 hours (P<0.05~0.01) and decreasing at 24 hours. LBP mRNA expression significantly increased in liver, lung, intestine, and kidney at 2 hours, peaking at 8 hours and sustaining a high level till 24 hours. However, treatment with polymyxin B could markedly reduce both of the portal and systemic endotoxin levels and LBP mRNA expression in various organs. Moreover, a positive correlation between plasma endotoxin value and pulmonary LBP mRNA expression was noted (r=0.421, P<0.05). Conclusion This study suggests that a marked elevation of LBP mRNA expression is evident in multiple organs, which might be associated with gut-derived endotoxemia following thermal injury.
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    【Key words】 Burns Lipopolysaccharide-binding protein Gene expression Endotoxemia

    研究表明,脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein, LBP)可促进内毒素与单核巨噬细胞上的CD14受体结合,显著增强细胞因子的合成与分泌,为体内重要的内毒素增敏系统之一[1]。有关LBP的研究目前多局限于体外观察,关于烧伤后组织LBP mRNA的动态表达及其影响因素,尚未见报道。为此,笔者采用大鼠烫伤模型进行了初步探讨。

    材料与方法

    一、实验动物分组

    雄性Wistar大鼠56只,体重250~300g,随机分为正常对照组(鼠数=8只),烫伤组(鼠数=24)和多粘菌素B治疗组(鼠数=24)。后两组又根据伤后时间的不同分为伤后2,8,24小时组。动物麻醉、脱毛后,将其背部浸入沸水12秒钟造成35%体表面积Ⅲ度烫伤。腹腔注射林格氏液40~50ml/kg抗休克。治疗组于烫伤后即刻肌肉注射多粘菌素B 1×104U/kg(日本Pfizer公司产品),其余处理同烫伤组。所有动物分别于伤后2,8,24小时抽血处死,留取血、组织标本待测。
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    二、观察指标及方法

    1.血浆内毒素含量:采用改良过氯酸法预处理血浆,偶氮显色法鲎试验定量测定[2]。所有试剂系日本生化学工业株式会社与上海市医化所产品。

    2.组织LBP mRNA表达:组织总RNA提取采用酸酚-氯仿非超速离心一步法[3](Promega公司产品)。应用逆转录PCR技术对组织LBP mRNA进行扩增 ,其引物参照文献[4]合成。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)为内参对照进行图象分析,结果以LBP/G3PDH值表示。

    三、数据处理

    结果以均值±标准差(±s)表示。实验资料应用SAS统计软件包进行处理,包括χ2检验、方差分析及相关分析等。
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    结 果

    一、血浆内毒素水平的动态改变

    如表1所示,烫伤后2小时门静脉、体循环血浆内毒素水平均显著升高(P<0.05),8小时达峰值(P<0.01),其中以门脉系统内毒素水平升高尤为明显,8小时二者相差接近有统计学意义(P=0.07);24小时逐渐下降,且门、体循环血浆内毒素水平趋于一致,但仍显著高于对照值。多粘菌素B治疗后,门静脉、体循环血浆内毒素水平均呈不同程度下降,其中以门静脉8小时治疗组下降较为显著(P<0.05)。

    表1 血浆内毒素水平的变化( ±s,EU/ml) 组别

    正常对照组

    伤后时间(h)
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    2

    8

    24

    门静脉

    0.071±0.09

    烫伤组

    0.387±0.300*

    0.707±0.561**

    0.332±0.125**

    治疗组

    体循环

    0.071±0.07
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    烫伤组

    0.286±0.131*

    0.342±0.283**

    0.312±0.115**

    治疗组

    0.219±0.103

    0.240±0.109*

    0.212±0.049**

    与正常对照组比较 *P<0.05 **P<0.01; 与同时相烫伤组比较 P<0.05
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    二、组织LBP mRNA的动态表达

    正常情况下,肺、肝、肠、肾等组织即可表达少量LBP。烫伤后2小时LBP mRNA水平即显著增加,与对照值相比,差异有显著至极显著性意义(P<0.05~0.01)。伤后8小时其含量达峰值(约为对照值的2~2.5倍),且峰值一直持续至伤后24小时。给予多粘菌素B治疗可不同程度降低各时相点肺、肠、肾组织LBP mRNA表达,其中以伤后24小时尤为明显,但对肝脏LBP mRNA表达无显著影响

    (表2)。表2 烫伤后不同组织LBP mRNA表达的动态变化(±s,比值) 组别

    正常对照组

    伤后时间(h)

    2
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    8

    24

    肺

    0.713±0.084

    烫伤组

    1.445±0.221**

    1.757±0.477**

    1.660±0.271**

    治疗组

    1.199±0.597

    1.373±0.253
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    1.270±0.083△△

    肝

    0.923±0.271

    烫伤组

    1.503±0.163**

    1.751±0.437**

    1.795±0.475**

    治疗组

    1.425±0.189

    1.523±0.091

    1.543±0.142
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    肠

    0.887±0.304

    烫伤组

    1.388±0.239*

    1.729±0.333**

    1.750±0.438**

    治疗组

    1.206±0.476

    1.597±0.208

    1.208±0.328△△

    肾
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    0.813±0.177

    烫伤组

    1.558±0.133**

    1.802±0.621**

    1.780±0.394**

    治疗组

    1.332±0.882

    1.340±0.553

    1.320±0.114

    与正常对照组比较 *P<0.05 **P<0.01; 与同时相烫伤组比较 P<0.05 △△P<0.01
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    三、血浆内毒素与LBP mRNA表达的相关分析

    结果显示,门静脉内毒素水平与肺组织LBP mRNA表达呈显著正相关(r=0.421, P<0.05),而与肝(r=0.328,P=0.09)、肠(r=0.318,P=0.10)、肾(r=0.303,P=0.12)组织无显著相关性。

    讨 论

    LBP是一种存在于正常人体内的蛋白质,在急性炎症反应或脓毒症病人中其水平可显著升高

    [1,5]。体外实验证明,LBP可极大程度地增强低浓度内毒素刺激细胞产生多种细胞因子介导炎症反应的过程[1]。虽然创伤后内毒素血症时循环内毒素含量多处于较低水平,但可能诱发机体多脏器的损伤[6]。因此,推测创伤后LBP浓度的增加在增敏内毒素介导的组织损害中具有一定作用。
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    本实验结果显示,正常大鼠仅能表达少量的LBP;烫伤后2小时肺、肝、肠、肾等组织LBP mRNA表达都明显增多,8小时达高峰,且伤后8~24小时一直持续较高水平。另一方面,不同组织之间差异不显著,其LBP mRNA的变化趋势基本一致。这说明LBP在烫伤后可能广泛作用于机体的多个系统,介导内毒素对不同器官的损伤,LBP mRNA的持续表达提示它可能在诱发机体失控的炎症反应及多器官功能障碍综合征(MODS)中起促进作用。反之,采用多粘菌素B部分中和血浆内毒素,可不同程度地减少多种组织LBP mRNA的表达。表明烧伤早期抗内毒素治疗可能有助于减轻机体多个器官LBP基因表达,进而部分阻断LBP/CD14介导的内毒素增敏效应,这对于防止烧伤后脓毒症、MODS的发生与发展可能有一定意义[6]

    虽然烫伤后内毒素血症与诱发组织LBP mRNA表达存在一定的因果关系,但多粘菌素B中和内毒素反应并未能使LBP mRNA表达恢复至正常对照水平。究其原因,一方面可能因为多粘菌素B用量偏小,不足以完全中和血浆内毒素,而微量内毒素可刺激机体组织表达LBP;另一方面,内毒素并非刺激LBP mRNA表达增加的唯一因素。烧伤、缺血及多种炎症介质都可促进LBP mRNA表达过程,降低循环内毒素水平只能部分降低LBP mRNA的表达量。Wong等[7]研究了不同介质如IL-1β、γ-干扰素、TNF、内毒素等对大鼠肺动脉平滑肌细胞LBP mRNA表达的影响。结果发现,IL-1β是刺激大鼠肺动脉平滑肌细胞LBP mRNA表达作用最强的介质。
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    本资料中,降低内毒素水平对于不同器官LBP mRNA表达影响有所不同,其原因尚不清楚。推测可能与内毒素对各种器官亲合力不同或内毒素在局部组织分布差异有关。值得一提的是,肝组织LBP对抗内毒素反应不明显,提示除肠源性内毒素血症外,烫伤后可能有多种因素影响其LBP mRNA表达及损害肝脏的正常功能。肝脏LBP mRNA表达的增多在提高局部组织对内毒素的敏感性仍可能起一定作用。

    总之,严重烧伤可导致机体多种组织LBP mRNA表达持续、显著增多,LBP过量产生在增敏内毒素血症所致组织器官损伤中可能具有重要作用。了解LBP在体内组织动态表达规律对于我们进一步探讨创伤后脓毒症、MODS的发病机制及其防治途径具有指导意义。

    本课题受全军“九五”医药卫生科研基金资助(No.96Q116)

    参考文献

    [1]Schumann RR, Leong SR, Flaggs GW, et al. Structure and function of lipopolysaccharide-binding protein. Science, 1990, 249∶1429-1431.
, 百拇医药
    [2]Yao YM, Yu Y, Sheng ZY, et al. Role of gut-derived endotoxemia and bacterial translocation in rats after thermal injury: Effects of selective decontamination of the digestive tract. Burns, 1995, 21∶580-585.

    [3]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162∶156-159.

    [4]Su GL, Freeswick PD, Geeler DA, et al. Molecular cloning, characterization, and tissue distribution of rat lipopolysaccharide-binding protein. J Immunol, 1994, 153∶743-752.
, 百拇医药
    [5]Horwitz AH, Williams RE, Nowakowski G. Human lipopolysaccharide-binding protein potentiates bacterial activity of human bactericidal/permeability-increasing protein. Infect Immun, 1995, 63∶522-527.

    [6]Yao YM, Redl H, Bahrami S, et al. The inflammatory basis of trauma/shock-associated multiple organ failure. Inflamm Res, 1998, 47∶201-210.

    [7]Wong HR, Pitt BR, Su GL, et al. Induction of lipopolysaccharide-binding protein gene expression in cultured rat pulmonary artery smooth muscle cells by interleukin-1 beta. Am J Respir Cell Mol Biol, 1995, 12∶449-454.

    (收稿:1997-11-24 修回:1998-06-15), 百拇医药