脑损伤早期脑皮质神经细胞膜D2受体活性变化的实验研究
作者：肖华 李金彩 徐如祥 魏荣贵
单位：肖华 魏荣贵 100101 北京,国防科工委总医院神经外科；李金彩 新乡医学院第三附属医院；徐如祥 第一军医大学附属珠江医院神经外
关键词：脑损伤；神经细胞；D2受体阻滞剂；大鼠
中华创伤杂志980509 【摘要】 目的 通过大鼠的脑损伤模型,观测颅脑损伤后0.5～48小时脑皮质神经细胞膜中D2受体活性的变化及其与脑水肿的关系。方法 采用改良的Feeney脑落体撞击伤方法制作脑损伤模型,采用干-湿法测脑组织含水量;采用同位素标记法测定受体变化;采用D2受体阻滞剂Sulpiride进行实验治疗。结果 脑损伤后0.5小时,D2受体显著增加,至24小时降至最低,48小时仍未恢复正常。结论 D2受体活性变化在外伤性脑水肿的发生发展中起重要作用。
, http://www.100md.com
Experimental Study on D2 Receptor Changes in Cerebral Cortex Neurons in Early Stage of Brain Injury XIAO Hua, LI Jin-cai, XU Ru-xiang, et al. Dept. of Neurosurgery, 514th Hospital, Beijing 100101
【Absract】 Aim To investigate the change of D2 receptor activities in the brain neuron cells and the relationship between the change and the secondary brain edema in the early stage of brain injury. Methods Brain injury models were induced by the improved Feeney's method. The dopaminergic receptors were measured with the radio-ligand binding assay. The water contents of brain tissue were measured by dry-wet method, and the blocker of dopaminergic receptor, Sulpiride, was selected to show its effect on the changes of dopaminergic receptor and traumatic brain edema. Results Dopaminergic receptors increased remarkably at 0.5 hour, then fell, but they were still remarkably different from the control group at 48 hour in brain injury. Conclusion The change of D2 receptor on cell membranes of brain neurons may play an important role in the secondary brain edema.
, 百拇医药
【Key words】 Brain injury Neuron cell D2 receptor Rat
多巴胺受体分为D1和D2两类,在继发性脑损害中起重要作用[1，2]。笔者旨在研究大鼠脑损伤后0.5～48小时,脑皮质神经细胞膜中多巴胺受体D2变化及其与脑水肿的关系。
材料与方法
一、试剂
3H-Spiperone(美国Amersham公司);Sulpiride(美国Sigma公司);pH7.4,0.05mol/L的Tris-HC缓冲液;0.32mol/L模保病蔗糖-Tris缓冲液;pH7.7,0.05mol/L含单胺氧化酶抑制剂的Tris-HCl缓冲液;闪烁液。
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二、实验动物及模型
雄性SD大鼠,体重(250±30)g。脑损伤模型的制作采用改良的Feeney脑落体撞击伤方法,致伤力为0.007N[3]。假手术对照组仅切开头皮,颅骨钻孔,不致脑损伤,术后24小时采样检测;正常对照组不作任何手术操作处理,禁食12小时,采样检测。对照组动物样品采集、处理及检测方法与脑损伤组相同。
三、脑组织含水量的测定
自损伤区后缘取脑皮质和白质各1块,重约(100±10)mg,电子分析天平称脑组织湿重,110℃恒温箱烘烤24小时称干重。
四、细胞膜蛋白的制备
自液氮中取出脑样品,分离脑皮质,加入10倍体积预冷0.32mol/L蔗糖Tris溶液匀浆20次,再在4℃以600×g离心5分钟,弃沉淀。上清加入适量体积预冷的0.32mol/L蔗糖-Tris缓冲液,低温下用电动玻璃匀浆机匀浆10分钟,在4℃以1 500×g离心10分钟,弃沉淀。取上清在37℃水浴中孵化15分钟,置冰浴终止孵化,再进行4℃高速离心15分钟(5 000×g),沉沉为受体膜蛋白,加入pH7.7Tris液适量,以制成膜受体蛋白悬液,一般约为1～2mg/ml左右,立即供实验使用。
, 百拇医药
五、D2受体测定
将D2受体的标记配基设置7个浓度点,每个浓度点复管测定,取平均值为总结合率。另设非特异结合管,总结合与非特异结合之差为特异结合。各浓度测定管中,每管加标记配基100μl。而非特异管中须50μl加非标记配基,相应减少反应液的补充量,使反应总体积保持在350μl。于37℃水浴中温育15分钟后,立即置于冰浴终止反应,用49号玻璃纤维膜行减压抽滤,取出滤膜于80℃烤干,置于5ml闪烁液中,放置24小时后用液闪计数仪测定,通过饱和曲线和作图求出受体的最大结合容量和解离常数。
六、治疗组
伤前给药组于动物致伤前30分钟和伤后12小时腹腔注射Supliride 100mg/kg体重,对照组给等量的等渗盐水。伤后给药组及对照组致伤后6小时和伤后12小时按前述方法给药,治疗对照组均于伤后24小时取脑样本。
, 百拇医药
七、统计学处理
所有实验数据均采用F和t检验。
结 果
一、脑皮质神经细胞D2受体Bmax
D2受体Bmax于脑损伤后0.5小时为312±51,较正常对照(246±43)显著升高(P<0.01),即正向调节,随后下降,即反向调节;伤后24小时为133±15,为最低值(P<0.01),然后回升,到48小时为145±22,与对照值相差仍很明显(P<0.01)。其平衡解离常数(KD)值在伤后0.5小时为2.11±0.23,较正常对照值(1.71±0.11)显著升高(P<0.01),随后下降,至48小时为1.30±1.12,低于对照值(P<0.01)。
二、脑含水量及Sulpiride对脑含水量的影响
, http://www.100md.com
见附表
附表 脑损伤区周围脑组织含水量的变化(
±s) 组别
鼠数
脑组织含水量百分率(%)
皮质
白质
正常对照组
10
78.32±0.40
75.33±0.66
假手术对照组
, http://www.100md.com
10
78.44±0.44
75.40±0.56
伤后
0.5h
10
80.54±0.36**
78.16±067**
1h
10
80.45±0.48**
78.35±0.50**
, http://www.100md.com
3h
10
80.86±0.63**
78.80±0.70**
6h
10
81.53±0.59**
78.80±0.70**
24h
10
81.70±0.49**
, http://www.100md.com
78.99±0.72**
48h
10
80.95±0.60**
79.12±0.68**
治疗对照组
伤前对照组
10
81.68±0.65
78.96±0.56
伤后对照组
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10
81.74±0.74
78.94±0.53
治疗组(Sulpiride)
伤前治疗组
10
79.45±0.75**△△
77.34±0.55**△△
伤后治疗组
10
80.21±0.83**△△
, 百拇医药
77.83±0.81**△△
与对照组比较 **P<0.01; 与伤后24小时比较 △△P<0.01讨 论
一、脑损伤后脑皮质神经细胞膜D2受体活性变化机制
1.Bmax值:正向调节的可能是机制:颅脑损伤后,使原来不易暴露的受体较易暴露,同时动用了部分闲置的受体,以及膜脂质中受体分子向膜表面移动,使膜表面受体密度增加。反向调节的可能机制是:伤后脑内多巴胺水平升高的反向调节[1，4],受体亲和力增加、创伤启动了部分细胞编程死亡,多巴胺受体等缩血管物质增加导致脑组织细胞缺血缺氧、Ca2+内流减少,这些都能使受体减少。另外,脑损伤后多巴胺增高,既使多巴胺受体发生失敏和下行调节、受体的半衰期缩短[5],又使细胞内钙离子超载,进而水解受体蛋白[6]以及伤后神经细胞的丢失都能使受体减少。
, 百拇医药
2.KD值变化的可能原因:颅脑损伤后受体蛋白的磷酸化或脱磷酸,改变受体在细胞表面的分布,膜受体在膜表面聚集,改变受体的活性及受体和受体的转导系统的偶联,最终将导致受体的亲和力降低。另外,脑损伤后,多巴胺受体等缩血管物释质放增加,pH值下降,引起受体蛋白立体构象的改变,使受体产生失敏作用所致。
二、颅脑损伤后脑皮质神经细胞膜D2受体的活性变化与脑水肿的关系
颅脑损伤后多巴胺释放增加,作用于D2受体使脑组织血管收缩,引起缺血缺氧[7],从而引起脑组织内兴奋性氨基酸增加[8]、CO2潴留、自由基大量产生、Ca2+超载等,进而使BBB开放,引起脑水肿。
三、Sulpiride对脑水肿的治疗作用
, http://www.100md.com Sulpiride是D2受体特异性拮抗剂,能与D2受体结合减少多巴胺和受体结合的机率,同时,使KD值增加,使多巴胺和D2受体结合率减少,减轻脑水肿。Sulpiride能与5-HT及肾上腺能α2受体结合,进而减轻5-HT和α2受体对脑水肿的影响。另外,Sulpiride有可能通过减少Zif286基因减少脑水肿[9];Sulpiride使多巴胺和多巴胺受体发生失敏作用、解偶联作用,进而改善PKC、PKA的活性,减轻细胞内钙离子超载,减轻脑继发性损害[10]。
实验结果提示:D2受体与脑水肿有密切关系,其阻制剂Sulpiride对脑水肿有一定的效果。
本课题受军队“九五”重点攻关项目基金资助
参考文献
, 百拇医药
[1]Ke YX, Xu RX, Chen CC. Changes of 5-hydroxytryptamine and dopmine in brain microvessels and the influence on the cerebral edema at early stage of brain injury. J Med Coll PLA, 1995, 10∶102-105.
[2]肖华,邹春芽,徐如祥.中枢多巴胺受体与脑损害,国外医学创伤与外科基本问题分册, 1996, 17∶135-138.
[3]Feeney DM, Broeson MG, Linn WJ, et al. Responses to cortical injury. I: Methodology and local effects of contusion in the rat. Brain Res, 1981, 211∶67-77.
, 百拇医药
[4]柯以铨,徐如祥,陈长才.脑损伤病理过程脑微血管5-TH,DA的水平变化.中华实验外科杂志, 1995, 12∶372-373.
[5]Bolander FF. Receptor regulatio. In: Bolander FF, ed. Molecular endocrinology. San Diego: California Academic Press, Inc. 1989, 118-128.
[6]Taft WC, Lyeth BG, Dixon LF, et al. Evidence of calplain activation following maderaterate grade traumatic brain injury. Soc Neurosic Abst, 1991, 17∶164.
[7]Fillox FM, Adair J, Narangg N. Thetemporal evolution of striatal dopaminer receptor binding and mRNA expression following hypoxia-ischemina in the neonatal rat. Brain Res Dev Brain Res, 1996, 14∶84-91.
, 百拇医药
[8]Healy DJ, Meador Woodurf JH. Differential regulation by MK-801 of dopamin receptor gene express in ratnigro striatal and mesocortic limbic systems. Brain Res, 1996, 708∶38-44.
[9]Wang JQ, Mccinty JF. Differential effects of D1 and D2 dopamine receptor antagonists on acute amphetamine or methamphetamine-induced up-regulation of zif/268 mRNA express in rat forebrain. J Neurochem, 1995, 65∶2706-2715.
[10]Wah F, Plotine M, Boulu R, et al. Involvement of dopaminergic receptors in quinolinate induced striatal lession. Neuroreport, 1993, 18∶151-153.
(收稿:1997-11-24 修回:1998-07-07), http://www.100md.com
单位：肖华 魏荣贵 100101 北京,国防科工委总医院神经外科；李金彩 新乡医学院第三附属医院；徐如祥 第一军医大学附属珠江医院神经外
关键词：脑损伤；神经细胞；D2受体阻滞剂；大鼠
中华创伤杂志980509 【摘要】 目的 通过大鼠的脑损伤模型,观测颅脑损伤后0.5～48小时脑皮质神经细胞膜中D2受体活性的变化及其与脑水肿的关系。方法 采用改良的Feeney脑落体撞击伤方法制作脑损伤模型,采用干-湿法测脑组织含水量;采用同位素标记法测定受体变化;采用D2受体阻滞剂Sulpiride进行实验治疗。结果 脑损伤后0.5小时,D2受体显著增加,至24小时降至最低,48小时仍未恢复正常。结论 D2受体活性变化在外伤性脑水肿的发生发展中起重要作用。
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Experimental Study on D2 Receptor Changes in Cerebral Cortex Neurons in Early Stage of Brain Injury XIAO Hua, LI Jin-cai, XU Ru-xiang, et al. Dept. of Neurosurgery, 514th Hospital, Beijing 100101
【Absract】 Aim To investigate the change of D2 receptor activities in the brain neuron cells and the relationship between the change and the secondary brain edema in the early stage of brain injury. Methods Brain injury models were induced by the improved Feeney's method. The dopaminergic receptors were measured with the radio-ligand binding assay. The water contents of brain tissue were measured by dry-wet method, and the blocker of dopaminergic receptor, Sulpiride, was selected to show its effect on the changes of dopaminergic receptor and traumatic brain edema. Results Dopaminergic receptors increased remarkably at 0.5 hour, then fell, but they were still remarkably different from the control group at 48 hour in brain injury. Conclusion The change of D2 receptor on cell membranes of brain neurons may play an important role in the secondary brain edema.
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【Key words】 Brain injury Neuron cell D2 receptor Rat
多巴胺受体分为D1和D2两类,在继发性脑损害中起重要作用[1，2]。笔者旨在研究大鼠脑损伤后0.5～48小时,脑皮质神经细胞膜中多巴胺受体D2变化及其与脑水肿的关系。
材料与方法
一、试剂
3H-Spiperone(美国Amersham公司);Sulpiride(美国Sigma公司);pH7.4,0.05mol/L的Tris-HC缓冲液;0.32mol/L模保病蔗糖-Tris缓冲液;pH7.7,0.05mol/L含单胺氧化酶抑制剂的Tris-HCl缓冲液;闪烁液。
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二、实验动物及模型
雄性SD大鼠,体重(250±30)g。脑损伤模型的制作采用改良的Feeney脑落体撞击伤方法,致伤力为0.007N[3]。假手术对照组仅切开头皮,颅骨钻孔,不致脑损伤,术后24小时采样检测;正常对照组不作任何手术操作处理,禁食12小时,采样检测。对照组动物样品采集、处理及检测方法与脑损伤组相同。
三、脑组织含水量的测定
自损伤区后缘取脑皮质和白质各1块,重约(100±10)mg,电子分析天平称脑组织湿重,110℃恒温箱烘烤24小时称干重。
四、细胞膜蛋白的制备
自液氮中取出脑样品,分离脑皮质,加入10倍体积预冷0.32mol/L蔗糖Tris溶液匀浆20次,再在4℃以600×g离心5分钟,弃沉淀。上清加入适量体积预冷的0.32mol/L蔗糖-Tris缓冲液,低温下用电动玻璃匀浆机匀浆10分钟,在4℃以1 500×g离心10分钟,弃沉淀。取上清在37℃水浴中孵化15分钟,置冰浴终止孵化,再进行4℃高速离心15分钟(5 000×g),沉沉为受体膜蛋白,加入pH7.7Tris液适量,以制成膜受体蛋白悬液,一般约为1～2mg/ml左右,立即供实验使用。
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五、D2受体测定
将D2受体的标记配基设置7个浓度点,每个浓度点复管测定,取平均值为总结合率。另设非特异结合管,总结合与非特异结合之差为特异结合。各浓度测定管中,每管加标记配基100μl。而非特异管中须50μl加非标记配基,相应减少反应液的补充量,使反应总体积保持在350μl。于37℃水浴中温育15分钟后,立即置于冰浴终止反应,用49号玻璃纤维膜行减压抽滤,取出滤膜于80℃烤干,置于5ml闪烁液中,放置24小时后用液闪计数仪测定,通过饱和曲线和作图求出受体的最大结合容量和解离常数。
六、治疗组
伤前给药组于动物致伤前30分钟和伤后12小时腹腔注射Supliride 100mg/kg体重,对照组给等量的等渗盐水。伤后给药组及对照组致伤后6小时和伤后12小时按前述方法给药,治疗对照组均于伤后24小时取脑样本。
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七、统计学处理
所有实验数据均采用F和t检验。
结 果
一、脑皮质神经细胞D2受体Bmax
D2受体Bmax于脑损伤后0.5小时为312±51,较正常对照(246±43)显著升高(P<0.01),即正向调节,随后下降,即反向调节;伤后24小时为133±15,为最低值(P<0.01),然后回升,到48小时为145±22,与对照值相差仍很明显(P<0.01)。其平衡解离常数(KD)值在伤后0.5小时为2.11±0.23,较正常对照值(1.71±0.11)显著升高(P<0.01),随后下降,至48小时为1.30±1.12,低于对照值(P<0.01)。
二、脑含水量及Sulpiride对脑含水量的影响
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见附表
附表 脑损伤区周围脑组织含水量的变化(
±s) 组别鼠数
脑组织含水量百分率(%)
皮质
白质
正常对照组
10
78.32±0.40
75.33±0.66
假手术对照组
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10
78.44±0.44
75.40±0.56
伤后
0.5h
10
80.54±0.36**
78.16±067**
1h
10
80.45±0.48**
78.35±0.50**
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3h
10
80.86±0.63**
78.80±0.70**
6h
10
81.53±0.59**
78.80±0.70**
24h
10
81.70±0.49**
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78.99±0.72**
48h
10
80.95±0.60**
79.12±0.68**
治疗对照组
伤前对照组
10
81.68±0.65
78.96±0.56
伤后对照组
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10
81.74±0.74
78.94±0.53
治疗组(Sulpiride)
伤前治疗组
10
79.45±0.75**△△
77.34±0.55**△△
伤后治疗组
10
80.21±0.83**△△
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77.83±0.81**△△
与对照组比较 **P<0.01; 与伤后24小时比较 △△P<0.01讨 论
一、脑损伤后脑皮质神经细胞膜D2受体活性变化机制
1.Bmax值:正向调节的可能是机制:颅脑损伤后,使原来不易暴露的受体较易暴露,同时动用了部分闲置的受体,以及膜脂质中受体分子向膜表面移动,使膜表面受体密度增加。反向调节的可能机制是:伤后脑内多巴胺水平升高的反向调节[1，4],受体亲和力增加、创伤启动了部分细胞编程死亡,多巴胺受体等缩血管物质增加导致脑组织细胞缺血缺氧、Ca2+内流减少,这些都能使受体减少。另外,脑损伤后多巴胺增高,既使多巴胺受体发生失敏和下行调节、受体的半衰期缩短[5],又使细胞内钙离子超载,进而水解受体蛋白[6]以及伤后神经细胞的丢失都能使受体减少。
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2.KD值变化的可能原因:颅脑损伤后受体蛋白的磷酸化或脱磷酸,改变受体在细胞表面的分布,膜受体在膜表面聚集,改变受体的活性及受体和受体的转导系统的偶联,最终将导致受体的亲和力降低。另外,脑损伤后,多巴胺受体等缩血管物释质放增加,pH值下降,引起受体蛋白立体构象的改变,使受体产生失敏作用所致。
二、颅脑损伤后脑皮质神经细胞膜D2受体的活性变化与脑水肿的关系
颅脑损伤后多巴胺释放增加,作用于D2受体使脑组织血管收缩,引起缺血缺氧[7],从而引起脑组织内兴奋性氨基酸增加[8]、CO2潴留、自由基大量产生、Ca2+超载等,进而使BBB开放,引起脑水肿。
三、Sulpiride对脑水肿的治疗作用
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实验结果提示:D2受体与脑水肿有密切关系,其阻制剂Sulpiride对脑水肿有一定的效果。
本课题受军队“九五”重点攻关项目基金资助
参考文献
, 百拇医药
[1]Ke YX, Xu RX, Chen CC. Changes of 5-hydroxytryptamine and dopmine in brain microvessels and the influence on the cerebral edema at early stage of brain injury. J Med Coll PLA, 1995, 10∶102-105.
[2]肖华,邹春芽,徐如祥.中枢多巴胺受体与脑损害,国外医学创伤与外科基本问题分册, 1996, 17∶135-138.
[3]Feeney DM, Broeson MG, Linn WJ, et al. Responses to cortical injury. I: Methodology and local effects of contusion in the rat. Brain Res, 1981, 211∶67-77.
, 百拇医药
[4]柯以铨,徐如祥,陈长才.脑损伤病理过程脑微血管5-TH,DA的水平变化.中华实验外科杂志, 1995, 12∶372-373.
[5]Bolander FF. Receptor regulatio. In: Bolander FF, ed. Molecular endocrinology. San Diego: California Academic Press, Inc. 1989, 118-128.
[6]Taft WC, Lyeth BG, Dixon LF, et al. Evidence of calplain activation following maderaterate grade traumatic brain injury. Soc Neurosic Abst, 1991, 17∶164.
[7]Fillox FM, Adair J, Narangg N. Thetemporal evolution of striatal dopaminer receptor binding and mRNA expression following hypoxia-ischemina in the neonatal rat. Brain Res Dev Brain Res, 1996, 14∶84-91.
, 百拇医药
[8]Healy DJ, Meador Woodurf JH. Differential regulation by MK-801 of dopamin receptor gene express in ratnigro striatal and mesocortic limbic systems. Brain Res, 1996, 708∶38-44.
[9]Wang JQ, Mccinty JF. Differential effects of D1 and D2 dopamine receptor antagonists on acute amphetamine or methamphetamine-induced up-regulation of zif/268 mRNA express in rat forebrain. J Neurochem, 1995, 65∶2706-2715.
[10]Wah F, Plotine M, Boulu R, et al. Involvement of dopaminergic receptors in quinolinate induced striatal lession. Neuroreport, 1993, 18∶151-153.
(收稿:1997-11-24 修回:1998-07-07), http://www.100md.com