四种脱蛋白骨组织学和生物力学比较研究
作者：胡永康 安洪 曹本珍 倪卫东 张健
单位：胡永康 安洪 曹本珍 倪卫东 张健 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院骨伤研究室
关键词：脱蛋白骨；组织学；生物力学；植骨；载体
中华创伤杂志980505 【摘要】 目的 通过对不同化学方法制作的异体脱蛋白骨的组织学反应和生物力学强度的比较研究,以明确何种方法制作的脱蛋白骨宜于作为植骨材料或生物活性人工骨的载体。方法 采用Oswestry骨制作法(Ⅰ种)、Kiel骨制作法(Ⅱ种)、氯仿甲醇磷酸盐过氧化氢乙醇法(Ⅲ种)、过氧化氢乙醚法(Ⅳ种)所制成的4种脱蛋白骨,植入12只Wistar大白鼠肌袋内,于术后1,2,4,6周处死行组织学观察;另将4种脱蛋白骨制成形态、重量一致的试件,分别进行压缩、折弯、剪切、扭转等力学测 试。结果 Ⅰ种脱蛋白骨组织学相容性最好,但力学性能最差;Ⅲ种生物力学性能较好,但炎症反应较重;Ⅱ和Ⅳ种组织相容性和生物力学性能较好。结论 Ⅱ、Ⅳ种材料适合作为植骨材料或生物活性人工骨的载体。
, http://www.100md.com
Comparative Study on Four Types of Deproteined Bones Histologically and Biomechanically HU Yong-kang, AN Hong, CAO Ben-zhen, et al. Institute of Orthopaedics, First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016
【Abstract】 Aim To find out which type of deproteined bone is more appropriate to be the bone-graft material or the bioactive carrier of artificial bone. Methods Firstly, the four types (① Oswestry bone, ② Kiel bone, ③ Chloroform-Methanol bone, ④ H2O2-Ether bone) of deproteined bones were implanted in the muscular pocket of Wistar rats respectively. The rats were killed and studied on the histology of deproteined bones 1, 2, 4, and 6 weeks postoperation. Secondly, the specimen models of the four types of deproteined bones with same morphology and weight were compressed, bent, shared and torsioned, respectively. Results The outcome revealed that Oswestry bone had the best biocompatibility and the worst biomechanical values, the Chloroform-Methanol bone caused inflammatory response but had the best biomechanical character than the other types. Both of the Kiel bone and the H2O2-Ether bone had good biocompatibility and biomechanical values. Conclusion The Kiel bone and the H2O2-Ether bone are more appropriate to be the bone graft material or bioactive carrier of artificial bones for growth factors than the others.
, 百拇医药
【Key words】 Deproteined bone Histology Biomechanics Bone graft Carrier
临床应用和实验研究中,用于修补骨缺损的材料或作为生物活性人工骨载体的种类很多。如:自体骨、库骨、生物陶瓷、煅石膏、脱蛋白骨等。其中脱蛋白骨来源广泛,组织相容性较好,是一种可选择的生物材料。脱蛋白骨的处理方法较多,笔者对4种常用方法制备的脱蛋白骨进行比较研究,旨在探讨何种方法制备的脱蛋白骨更适合作为植骨材料或人工生物活性骨载体。
材料与方法
一、材料制备
1.取新鲜牛股骨,剥除软组织,去除股骨两端,将骨干锯成条状。
2.脱蛋白骨的制备方法:Ⅰ种Oswestry骨:将骨条浸泡于30%过氧化氢溶液中(38℃)48小时(在24小时更换新过氧化氢1次),流水冲洗,除去软组织残渣,放入乙醚中脱脂24小时。取出放入Soxleht容器中,用乙二胺循环提取24小时,取出流水冲洗,干燥,再用乙醇浸泡24小时,去除残余乙二胺,然后放入乙醇中备用[1]。Ⅱ种Kiel骨:将骨条放入20%过氧化氢溶液中(38℃)72小时,每24小时更换1次过氧化氢溶液。换液时,再次去除软组织残渣,用流水冲洗后乙醇脱脂24小时,再用丙酮干燥[2]。Ⅲ种氯仿甲醇磷酸盐过氧化氢乙醇法:将骨条放入1∶1氯仿甲醇溶液中4小时;0.1mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(含10mmol/L NaN3)中40小时;20%过氧化氢12小时;75%乙醇48小时,冷冻干燥后-30℃保存[3]。Ⅳ种过氧化氢乙醚法:将骨条放入38℃、20%过氧化氢溶液中72小时,每12小时换液1次。换液时,去除软组织残渣,用流水冲洗后放入Soxleht容器中用乙醚循环脱脂24小时,取出待乙醚挥发后,-30℃保存[4]。
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3.选择外形条件一致的4种脱蛋白骨条,磨成6mm×6mm×80mm柱状,每种材料12条做生物力学试验。做同一力学测试的材料来自同一根股骨。4种脱蛋白骨每种用1条切成颗粒,选择等重(约20mg)、大小一致者,用环氧乙烷消毒后备用。
二、动物模型
用200～300g Wistar大白鼠12只,用戊巴比妥钠腹腔麻醉,暴露背部两侧及四肢肌肉,分别植入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种脱蛋白骨材料各1粒。
三、观察方法
1.组织学观察:大白鼠于术后1,2,4,6周各处死3只,取下标本,固定、脱钙、HE染色,在光镜下对96个标本进行组织学观察。
2.生物力学测试:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种脱蛋白骨48条,加上对照未处理皮质骨12条共60个标本,在WD-10型万能电子试验机上进行压缩、折弯、剪切、扭转破坏性试验。每种材料作3个平行实验,观察应变力大小。
, 百拇医药
四、统计学方法
采用t检验,各组与对照比较,求出P值。
结 果
一、组织学
植入大白鼠肌肉内1周取材光镜下观察,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种植入骨周围均有少许炎症细胞,纤维增生。2周时,Ⅰ种无明显炎症细胞,纤维增生;Ⅱ和Ⅳ种有少许炎症细胞,纤维增生;Ⅲ种有炎症细胞,并有大量纤维增生。4周时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ种有纤维增生,但未见炎症细胞;Ⅲ种有少许炎症细胞,纤维增生。6周时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种材料均未见炎症细胞,仍有少量纤维增生。根据植入物各时相点光镜下组织学改变,其结果分为6级[3]。4种材料评分统计学结果表明:Ⅰ种材料组织学反应最轻;Ⅲ种材料较重;Ⅱ、Ⅳ种材料介于Ⅰ、Ⅱ种材料之间。
二、生物力学测试
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结果见表1～4。
表1 折弯试验(
±s) 组别
折弯破坏载荷(N)
强度(N/mm2)
弯矩(N.M)
Ⅰ
119±30.55
15.53±8.98**
4.76±2.75
Ⅱ
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651±112.00
83.89±14.43**
26.04±4.48
Ⅲ
1050±52.91
113.82±5.73△
42.00±2.12
Ⅳ
713±77.46
89.57±9.73**
28.52±3.10
, http://www.100md.com
对照
1103±30.55
125.91±3.49
44.12±1.62
与对照比较 △P>0.05 **P<0.01表2 压缩试验(±s) 组别
压缩破坏载荷(N)
压缩强度(N/mm2)
Ⅰ
1081±680.10
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26.70±16.81**
Ⅱ
1947±486.45
52.59±13.34**
Ⅲ
3233±516.17
84.01±13.41*
Ⅳ
2730±710.84
70.43±18.34**
对照
, http://www.100md.com
3683±251.66
98.40±6.72
与对照比较 *P<0.05 **P<0.01表3 剪切试验(±s) 组别
剪切破坏载荷
(N)
剪切强度
(N/mm2)
弯矩
(N.M)
Ⅰ
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210±121.65
27.49±15.92**
4.20±2.42
Ⅱ
1120±363.86
128.00±41.58△
22.40±7.28
Ⅲ
1153±352.33
136.29±41.65△
23.06±7.05
, 百拇医药
Ⅳ
1061±400.68
123.95±46.81△
21.22±8.01
对照
1250±467.76
156.25±58.47
25.00±9.36
与对照比较 △P>0.05 **P<0.01表4 扭转试验(±s) 组别
, 百拇医药
扭矩(N.M)
扭转强度(N/mm2)
扭角(°)
Ⅰ
2.89±0.88
8.00±2.44**
4.7±0.9
Ⅱ
6.07±3.03
16.86±8.42**
7.6±0.6
, http://www.100md.com
Ⅲ
7.13±1.13
19.80±3.14△
9.0±0.0
Ⅳ
5.98±3.02
16.61±8.39**
6.0±0.0
对照
9.00±2.52
25.00±7.00
9.0±0.0
, 百拇医药
与对照比较 △P>0.05 **P<0.01
讨 论
脱蛋白骨作为植骨材料或骨形态发生蛋白(BMP)载体具有以下优点:(1)脱蛋白骨类似受体骨,其内在天然密集微孔和胶原纤维适合作为BMP载体。(2)脱蛋白骨易于在体内降解吸收被新骨替代。但作为一种异体或异种骨,其免疫源性和生物力学性能是较重要的临床问题。
骨基质主要由胶原纤维、羟基磷灰石和少量蛋白质组成的复合材料。骨的力学性能与骨的类型、几何形状、纤维与基质的联接、纤维联接点的构造有关[5]。由于4种脱蛋白骨标本来自同一根股骨,试件外形一致,因此影响4种脱蛋白骨生物力学性能的主要因素为胶原纤维的破坏程度、纤维与基质的联接和纤维联接点的破坏程度。本组资料显示生物力学强度Ⅲ种材料最好,Ⅰ种最差,Ⅱ、Ⅳ种介于Ⅰ、Ⅲ种之间。研究证明,引起组织学反应的主要因素为材料中的蛋白质含量,特别是芳香族氨基酸的含量。这4种方法中破坏蛋白质和胶原纤维的主要试剂为过氧化氢和乙二胺,浓度越高,作用时间越长,蛋白质和胶原纤维破坏就越完全,组织反应就越轻。笔者曾对这4种脱蛋白骨进行氨基酸分析,其芳香族氨基酸的含量分别为Ⅰ种:3.0504ng/mg;Ⅱ种:12.27ng/mg;Ⅲ种:17.57ng/mg;Ⅳ种:1.033ng/mg。而芳香族氨基酸含量与免疫反应密切相关[6]。实验证实:Ⅲ种材料组织学反应最重,Ⅰ种材料最轻,Ⅱ、Ⅳ种介于Ⅰ、Ⅲ种之间。与胡蕴玉等[3]、丁真奇等
, 百拇医药
[4]、Hancox等[7]、张健等[8]的研究在不同角度发现类似现象。
综上所述:Ⅰ种材料组织学反应较轻,但生物力学强度较差,只宜作骨腔洞填充用。Ⅲ种材料生物力学强度虽好,但组织学反应较重,不宜采用。Ⅱ种和Ⅳ种材料有较好生物力学强度,组织学反应较轻,是较理想的植骨材料或生物活性人工骨载体。
参考文献
[1]Kershaw R. Preparation of anorgenic bone grafting material. Pharmacouticou Journal , 1963, 190∶537-545.
[2]Saluma MB. Xenogenil bone grafting in human. Clin Orthop, 1983, 174∶114-120.
, 百拇医药
[3]胡蕴玉,陆裕朴,刘玮.异种骨移植修复骨缺损实验研究.中华骨科杂志, 1990,10∶33-36.
[4]丁真奇,谭富生,吴祖尧.四种移植材料修复兔颅骨缺损的比较研究.中华创伤杂志, 1994, 10∶261-263.
[5]冯元祯主编.骨与软骨的力学性质.生物力学.第一版.北京:北京科学出版社, 1983, 240-263.
[6]郑武飞主编.抗原,医学免疫学.第一版.北京:北京人民卫生出版社, 1989, 17-33.
[7]Hancox NM, Ouwn R, Singleton A. Cross-species grafts of deproteinized bone. J Bone Joint Surg (Br), 1961, 43∶152-159.
[8]张健,安洪,蒋电明,等.脱蛋白骨、骨形态发生蛋白和肿瘤坏死因子重组合人工骨实验研究.中华创伤杂志, 1995, 11∶142-144.
(收稿:1997-11-15 修回;1998-07-03), 百拇医药
单位：胡永康 安洪 曹本珍 倪卫东 张健 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院骨伤研究室
关键词：脱蛋白骨；组织学；生物力学；植骨；载体
中华创伤杂志980505 【摘要】 目的 通过对不同化学方法制作的异体脱蛋白骨的组织学反应和生物力学强度的比较研究,以明确何种方法制作的脱蛋白骨宜于作为植骨材料或生物活性人工骨的载体。方法 采用Oswestry骨制作法(Ⅰ种)、Kiel骨制作法(Ⅱ种)、氯仿甲醇磷酸盐过氧化氢乙醇法(Ⅲ种)、过氧化氢乙醚法(Ⅳ种)所制成的4种脱蛋白骨,植入12只Wistar大白鼠肌袋内,于术后1,2,4,6周处死行组织学观察;另将4种脱蛋白骨制成形态、重量一致的试件,分别进行压缩、折弯、剪切、扭转等力学测 试。结果 Ⅰ种脱蛋白骨组织学相容性最好,但力学性能最差;Ⅲ种生物力学性能较好,但炎症反应较重;Ⅱ和Ⅳ种组织相容性和生物力学性能较好。结论 Ⅱ、Ⅳ种材料适合作为植骨材料或生物活性人工骨的载体。
, http://www.100md.com
Comparative Study on Four Types of Deproteined Bones Histologically and Biomechanically HU Yong-kang, AN Hong, CAO Ben-zhen, et al. Institute of Orthopaedics, First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016
【Abstract】 Aim To find out which type of deproteined bone is more appropriate to be the bone-graft material or the bioactive carrier of artificial bone. Methods Firstly, the four types (① Oswestry bone, ② Kiel bone, ③ Chloroform-Methanol bone, ④ H2O2-Ether bone) of deproteined bones were implanted in the muscular pocket of Wistar rats respectively. The rats were killed and studied on the histology of deproteined bones 1, 2, 4, and 6 weeks postoperation. Secondly, the specimen models of the four types of deproteined bones with same morphology and weight were compressed, bent, shared and torsioned, respectively. Results The outcome revealed that Oswestry bone had the best biocompatibility and the worst biomechanical values, the Chloroform-Methanol bone caused inflammatory response but had the best biomechanical character than the other types. Both of the Kiel bone and the H2O2-Ether bone had good biocompatibility and biomechanical values. Conclusion The Kiel bone and the H2O2-Ether bone are more appropriate to be the bone graft material or bioactive carrier of artificial bones for growth factors than the others.
, 百拇医药
【Key words】 Deproteined bone Histology Biomechanics Bone graft Carrier
临床应用和实验研究中,用于修补骨缺损的材料或作为生物活性人工骨载体的种类很多。如:自体骨、库骨、生物陶瓷、煅石膏、脱蛋白骨等。其中脱蛋白骨来源广泛,组织相容性较好,是一种可选择的生物材料。脱蛋白骨的处理方法较多,笔者对4种常用方法制备的脱蛋白骨进行比较研究,旨在探讨何种方法制备的脱蛋白骨更适合作为植骨材料或人工生物活性骨载体。
材料与方法
一、材料制备
1.取新鲜牛股骨,剥除软组织,去除股骨两端,将骨干锯成条状。
2.脱蛋白骨的制备方法:Ⅰ种Oswestry骨:将骨条浸泡于30%过氧化氢溶液中(38℃)48小时(在24小时更换新过氧化氢1次),流水冲洗,除去软组织残渣,放入乙醚中脱脂24小时。取出放入Soxleht容器中,用乙二胺循环提取24小时,取出流水冲洗,干燥,再用乙醇浸泡24小时,去除残余乙二胺,然后放入乙醇中备用[1]。Ⅱ种Kiel骨:将骨条放入20%过氧化氢溶液中(38℃)72小时,每24小时更换1次过氧化氢溶液。换液时,再次去除软组织残渣,用流水冲洗后乙醇脱脂24小时,再用丙酮干燥[2]。Ⅲ种氯仿甲醇磷酸盐过氧化氢乙醇法:将骨条放入1∶1氯仿甲醇溶液中4小时;0.1mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(含10mmol/L NaN3)中40小时;20%过氧化氢12小时;75%乙醇48小时,冷冻干燥后-30℃保存[3]。Ⅳ种过氧化氢乙醚法:将骨条放入38℃、20%过氧化氢溶液中72小时,每12小时换液1次。换液时,去除软组织残渣,用流水冲洗后放入Soxleht容器中用乙醚循环脱脂24小时,取出待乙醚挥发后,-30℃保存[4]。
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3.选择外形条件一致的4种脱蛋白骨条,磨成6mm×6mm×80mm柱状,每种材料12条做生物力学试验。做同一力学测试的材料来自同一根股骨。4种脱蛋白骨每种用1条切成颗粒,选择等重(约20mg)、大小一致者,用环氧乙烷消毒后备用。
二、动物模型
用200～300g Wistar大白鼠12只,用戊巴比妥钠腹腔麻醉,暴露背部两侧及四肢肌肉,分别植入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种脱蛋白骨材料各1粒。
三、观察方法
1.组织学观察:大白鼠于术后1,2,4,6周各处死3只,取下标本,固定、脱钙、HE染色,在光镜下对96个标本进行组织学观察。
2.生物力学测试:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种脱蛋白骨48条,加上对照未处理皮质骨12条共60个标本,在WD-10型万能电子试验机上进行压缩、折弯、剪切、扭转破坏性试验。每种材料作3个平行实验,观察应变力大小。
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四、统计学方法
采用t检验,各组与对照比较,求出P值。
结 果
一、组织学
植入大白鼠肌肉内1周取材光镜下观察,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种植入骨周围均有少许炎症细胞,纤维增生。2周时,Ⅰ种无明显炎症细胞,纤维增生;Ⅱ和Ⅳ种有少许炎症细胞,纤维增生;Ⅲ种有炎症细胞,并有大量纤维增生。4周时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ种有纤维增生,但未见炎症细胞;Ⅲ种有少许炎症细胞,纤维增生。6周时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ种材料均未见炎症细胞,仍有少量纤维增生。根据植入物各时相点光镜下组织学改变,其结果分为6级[3]。4种材料评分统计学结果表明:Ⅰ种材料组织学反应最轻;Ⅲ种材料较重;Ⅱ、Ⅳ种材料介于Ⅰ、Ⅱ种材料之间。
二、生物力学测试
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结果见表1～4。
表1 折弯试验(
±s) 组别折弯破坏载荷(N)
强度(N/mm2)
弯矩(N.M)
Ⅰ
119±30.55
15.53±8.98**
4.76±2.75
Ⅱ
, http://www.100md.com
651±112.00
83.89±14.43**
26.04±4.48
Ⅲ
1050±52.91
113.82±5.73△
42.00±2.12
Ⅳ
713±77.46
89.57±9.73**
28.52±3.10
, http://www.100md.com
对照
1103±30.55
125.91±3.49
44.12±1.62
与对照比较 △P>0.05 **P<0.01表2 压缩试验(
±s) 组别压缩破坏载荷(N)
压缩强度(N/mm2)
Ⅰ
1081±680.10
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26.70±16.81**
Ⅱ
1947±486.45
52.59±13.34**
Ⅲ
3233±516.17
84.01±13.41*
Ⅳ
2730±710.84
70.43±18.34**
对照
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3683±251.66
98.40±6.72
与对照比较 *P<0.05 **P<0.01表3 剪切试验(
±s) 组别剪切破坏载荷
(N)
剪切强度
(N/mm2)
弯矩
(N.M)
Ⅰ
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210±121.65
27.49±15.92**
4.20±2.42
Ⅱ
1120±363.86
128.00±41.58△
22.40±7.28
Ⅲ
1153±352.33
136.29±41.65△
23.06±7.05
, 百拇医药
Ⅳ
1061±400.68
123.95±46.81△
21.22±8.01
对照
1250±467.76
156.25±58.47
25.00±9.36
与对照比较 △P>0.05 **P<0.01表4 扭转试验(
±s) 组别, 百拇医药
扭矩(N.M)
扭转强度(N/mm2)
扭角(°)
Ⅰ
2.89±0.88
8.00±2.44**
4.7±0.9
Ⅱ
6.07±3.03
16.86±8.42**
7.6±0.6
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Ⅲ
7.13±1.13
19.80±3.14△
9.0±0.0
Ⅳ
5.98±3.02
16.61±8.39**
6.0±0.0
对照
9.00±2.52
25.00±7.00
9.0±0.0
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与对照比较 △P>0.05 **P<0.01
讨 论
脱蛋白骨作为植骨材料或骨形态发生蛋白(BMP)载体具有以下优点:(1)脱蛋白骨类似受体骨,其内在天然密集微孔和胶原纤维适合作为BMP载体。(2)脱蛋白骨易于在体内降解吸收被新骨替代。但作为一种异体或异种骨,其免疫源性和生物力学性能是较重要的临床问题。
骨基质主要由胶原纤维、羟基磷灰石和少量蛋白质组成的复合材料。骨的力学性能与骨的类型、几何形状、纤维与基质的联接、纤维联接点的构造有关[5]。由于4种脱蛋白骨标本来自同一根股骨,试件外形一致,因此影响4种脱蛋白骨生物力学性能的主要因素为胶原纤维的破坏程度、纤维与基质的联接和纤维联接点的破坏程度。本组资料显示生物力学强度Ⅲ种材料最好,Ⅰ种最差,Ⅱ、Ⅳ种介于Ⅰ、Ⅲ种之间。研究证明,引起组织学反应的主要因素为材料中的蛋白质含量,特别是芳香族氨基酸的含量。这4种方法中破坏蛋白质和胶原纤维的主要试剂为过氧化氢和乙二胺,浓度越高,作用时间越长,蛋白质和胶原纤维破坏就越完全,组织反应就越轻。笔者曾对这4种脱蛋白骨进行氨基酸分析,其芳香族氨基酸的含量分别为Ⅰ种:3.0504ng/mg;Ⅱ种:12.27ng/mg;Ⅲ种:17.57ng/mg;Ⅳ种:1.033ng/mg。而芳香族氨基酸含量与免疫反应密切相关[6]。实验证实:Ⅲ种材料组织学反应最重,Ⅰ种材料最轻,Ⅱ、Ⅳ种介于Ⅰ、Ⅲ种之间。与胡蕴玉等[3]、丁真奇等
, 百拇医药
[4]、Hancox等[7]、张健等[8]的研究在不同角度发现类似现象。
综上所述:Ⅰ种材料组织学反应较轻,但生物力学强度较差,只宜作骨腔洞填充用。Ⅲ种材料生物力学强度虽好,但组织学反应较重,不宜采用。Ⅱ种和Ⅳ种材料有较好生物力学强度,组织学反应较轻,是较理想的植骨材料或生物活性人工骨载体。
参考文献
[1]Kershaw R. Preparation of anorgenic bone grafting material. Pharmacouticou Journal , 1963, 190∶537-545.
[2]Saluma MB. Xenogenil bone grafting in human. Clin Orthop, 1983, 174∶114-120.
, 百拇医药
[3]胡蕴玉,陆裕朴,刘玮.异种骨移植修复骨缺损实验研究.中华骨科杂志, 1990,10∶33-36.
[4]丁真奇,谭富生,吴祖尧.四种移植材料修复兔颅骨缺损的比较研究.中华创伤杂志, 1994, 10∶261-263.
[5]冯元祯主编.骨与软骨的力学性质.生物力学.第一版.北京:北京科学出版社, 1983, 240-263.
[6]郑武飞主编.抗原,医学免疫学.第一版.北京:北京人民卫生出版社, 1989, 17-33.
[7]Hancox NM, Ouwn R, Singleton A. Cross-species grafts of deproteinized bone. J Bone Joint Surg (Br), 1961, 43∶152-159.
[8]张健,安洪,蒋电明,等.脱蛋白骨、骨形态发生蛋白和肿瘤坏死因子重组合人工骨实验研究.中华创伤杂志, 1995, 11∶142-144.
(收稿:1997-11-15 修回;1998-07-03), 百拇医药