亚硒酸钠对胃粘膜细胞非程序DNA合成、LPO和ras P21表达的影响
作者：房殿春 刘 卫 梁后杰 刘为纹
单位：第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
关键词：亚硒酸钠/药理学；胃粘膜/药物作用；DNA/生物合成；过氧化脂质类/代谢；癌基因蛋白质P21(RAS)/代谢
华人消化杂志/980518.htm Effects of Na2SeO3 on unscheduled DNA synthesis, lipid peroxidation and ras P21 expression in gastric epithelial cells
FANG Dian-Chun, LIU Wei, LIANG Hou-Jie and LIU Wei-Wen
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
, 百拇医药
Subject headings sodium selenite/pharmacology; gastric mucosa/drug effects; DNA/biosynthesis; lipid peroxides/metabolism; oncogene protein P21 (ras)/metabolism
Abstract
AIM To evaluate the preventive effects of Na2SeO3 on gastric epithelial cells (GEC) damaged by N-methyl-N＇-nitrosoguanidine (MNNG).
METHODS Effects of Na2SeO3 on unscheduled DNA synthesis (UDS), lipid peroxidation and ras P21 expression in GEC induced by MNNG were observed.
, 百拇医药
RESULTS UDS level (cpm/×10-6min-1, 116.6±15.6 or 156.6±18.7 vs 183.8±20.5, P<0.01-0.05)，lipid peroxidation products (20?d, μmol/L, 4.5±0.6 or 4.7±0.6 vs 7.4±0.7，P<0.01) and ras P21 concentrations (20d, A, 0.68±0.08 or 0.86±0.07 vs 1.08±0.11，P<0.01-0.05) in GEC, treated with 10?μmol/L and 1μmol/?L Na2SeO3 for 4 hours prior to MNNG administration, decreased obviously, compared with GEC treated without Na2SeO3, the differences were significant.
, 百拇医药
CONCLUSION Na2SeO3 can effectively prevent chemical damages in GEC from MNNG.
中国图书资料分类号 R979.7
摘 要
目的 研究亚硒酸钠对甲基硝基亚硝基胍(MNNG)所致胃粘膜细胞损伤的防护作用.
方法 观察了亚硒酸钠对MNNG所致胃粘膜细胞非程序DNA合成(UDS)、脂质过氧化物(LPO)和ras P21表达的影响.
结果 胃粘膜细胞先用10μmol/L或1μmol/?L亚硒酸钠预处理4?h，再给MNNG组细胞的非程序DNA合成水平(cpm/×10-6min-1，116.6±15.6或156.6±18.7 vs 183.8±20.5, P<0.01～0.05)，脂质过氧化物(20d, μmol/L, 4.5±0.6或4.7±0.6 vs 7.4±0.7，P<0.01)和ras P21蛋白含量(20?d, A, 0.68±0.08或0.86±0.07 vs 1.08±0.11，P<0.01～0.05)均显著低于MNNG组.
, 百拇医药
结论 一定剂量亚硒酸钠对MNNG诱导的胃粘膜细胞损伤有防护作用.
0 引言
国内外大量流行病学调查证明，硒与人类癌症死亡率呈负相关，硒缺乏可增加人类患癌的危险性[1，2]. 动物实验亦证明，硒具有拮抗或抑制化学致癌剂的致癌诱癌作用. 为了解硒对胃粘膜细胞的保护作用，我们观察了亚硒酸钠(Na2SeO3)对甲基硝基亚硝基胍(MNNG)所致胎胃粘膜上皮细胞非程序DNA合成、脂质过氧化和ras基因产物P21蛋白表达的影响.
1 材料和方法
1.1 实验设计 胎胃粘膜上皮细胞的分离、培养和鉴定见前文[3]. 实验共分4组，包括MNNG组、三种不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)加MNNG组：10umol/L Na2SeO3+MNNG组(S1组)、1umol/L Na2SeO3+MNNG组(S2组)、0.1μmol/?L Na2SeO3+MNNG组(S3组). MNNG用量在培养液中终浓度均为10μmol/L. 取第2代培养24h后细胞，S1，S2，S3组分别用相应浓度Na2SeO3预处理4h，再与MNNG组同时加入MNNG，培养24h后，更换正常培养液，继续培养40d，观察实验过程中各组细胞各项指标的变化.
, 百拇医药
1.2 非程序DNA合成(UDS)测定 各组细胞经不同处理后分别加入羟基脲(5mmol/L, Sigma公司)和3H-TdR 5μ ci/ml(中国原子能研究所)，细胞继续培养4h，每瓶取小量细胞行台盼兰染色，以观察细胞成活情况，其余制备样品，按文献方法测定UDS[4].
1.3 脂质过氧化物(LPO)测定 采用硫代巴比妥酸比色法. 检测培养1、5、10、20、30和40?d细胞LPO含量[5].
1.4 ras P21酶联免疫吸附实验 取各组10、20、30、40d细胞测定ras P21蛋白，检测方法见前文[5].
统计学处理 采用方差分析法观察各组间差异的显著性，P<0.05为差别显著，P<0.01为差别非常显著.
, 百拇医药
2 结果
2.1 胎胃粘膜上皮细胞UDS 经台盼兰染色观察，各组细胞成活率均在90%以上. Na2SeO3对MNNG诱导胎胃粘膜上皮细胞UDS的影响，S1组和S2组胃粘膜上皮细胞的UDS水平显著低于MNNG组(P<0.01～0.05)，而S3组UDS水平与MNNG组相比则无显著差别(P>0.05，表1).
表1 各组胃粘膜细胞的UDS水平 组别
cpm/×10-6min-1
MNNG
183.8±20.5
S3
, 百拇医药
169.0±19.1
S2
156.6±18.7a
S1
116.6±15.6b
aP<0.05，bP<0.01，vs MNNG组
2.2 细胞LPO含量 S3组细胞LPO含量与MNNG组同步升降，在各时相两组间无显著差异(P>0.05，表2). S1组和S2组细胞LPO含量缓慢升高，1，5，10，20?d时显著低于MNNG组(P<0.01～0.05). 此后，由于MNNG组LPO下降，30，40?d时各组间LPO水平无显著差异(P>0.05).
, 百拇医药
表2 各组胃上皮细胞LPO含量(umol/L) 组别
t/d
1
5
10
20
30
40
MNNG
5.4±0.6
6.0±0.7
6.4±0.6
7.4±0.7
, 百拇医药
5.5±0.7
4.1±0.5
S3
5.5±0.6
5.9±0.6
6.4±0.6
7.3±0.7
5.7±0.6
4.2±0.5
S2
4.1±0.6a
4.3±0.6b
, http://www.100md.com
4.5±0.6b
4.7±0.6b
4.7±0.6
4.8±0.6
S1
3.9±0.5b
4.1±0.6b
4.3±0.6b
4.5±0.6b
4.7±0.6
, 百拇医药
4.7±0.6
aP<0.05，bP<0.01，vs MNNG组.表3 胃上皮细胞ras P21表达变化(A) 组别
t/d
10
20
30
40
MNNG
0.98±0.99
1.08±0.11
1.12±0.11
, http://www.100md.com
1.12±0.12
S3
0.95±0.11
1.04±0.11
1.08±0.12
1.18±0.11
S2
0.79±0.07a
0.86±0.07a
0.87±0.09b
0.91±0.09b
, 百拇医药
S1
0.65±0.08b
0.68±0.08b
0.68±0.09b
0.69±0.08b
aP<0.05，bP<0.01，vs MNNG组.
2.3 细胞ras P21蛋白含量 在各时相点，S3组细胞ras P21水平与MNNG组相比均无显著差异(P>0.05)，而S1组和S2组细胞ras P21水平则显著低于MNNG组(P<0.01～0.05，表3).
, 百拇医药
3 讨论
正常情况下，细胞DNA合成仅见于S期，但当细胞DNA受到损伤进行修复时，其DNA合成可发生在整个细胞周期. 那些发生于S期以外的DNA合成，谓之非程序DNA合成(unscheduled DNA synthesis, UDS). 测定UDS是一种检测致突变因子的可靠生物学方法，我们过去研究提示MNNG可损伤细胞DNA使细胞UDS水平显著升高[5]. 本研究发现，先用10umol/L(S1组)和1umol/L (S2组)Na2SeO3预处理胃粘膜4h，其UDS水平显著低于MNNG组，而用0.1umol/L(S3组)Na2SeO3预处理，其UDS水平与MNNG组相比则无显著差别，提示一定剂量Na2SeO3可防止MNNG对胃粘膜细胞DNA的损伤.
, http://www.100md.com
LPO是指活性氧与不饱和脂肪酸作用产生的丙二醛等产物，它可致细胞DNA损伤，参与肿瘤的启动和促进过程[6]. 本研究发现，S3组细胞LPO含量与MNNG组同步升降，而S1组和S2组细胞LPO含量在培养d1，d5，d10和d20显著低于MNNG组. 提示一定剂量Na2SeO3可抑制MNNG引起的脂质过氧化，防止其对胃粘膜细胞的损伤.
P21蛋白是癌基因ras产物，我们过去的研究发现，MNNG组ras P21含量显著高于对照组，提示MNNG可诱发ras P21异常表达. 本研究还发现，S1组和S2组ras P21水平显著低于MNNG组，而S3组与MNNG组相比则无显著差异，提示一定剂量Na2SeO3 可抑制胃粘膜上皮细胞ras P21的表达，防止细胞癌变.
, 百拇医药
目前对硒的抗癌机制仍不完全清楚，根据本文资料推测可能与以下有关：①抑制肿瘤细胞生长繁殖；②拮抗化学致癌物对细胞遗传物质的损伤，保护细胞DNA，并促进受损DNA的修复；③抑制癌基因的表达；④抑制致癌物引起的脂质过氧化及自由基的产生，达到防癌目的.
4 参考文献
1 Lane HW, Medina D. Mode of action of selenium inhibition of 7,12-dimethylbenz[α] anthracene-induced mouse mammary tumorigenesis. JNCI, 1985;75(6):675-679
2 Peter T. In vivo effect of selenium on the mutagenic activity of aflatoxin BI. J Hgy Epidemiol Microbiol Immonol, 1990;34(2):123-128
, http://www.100md.com
3 刘卫，房殿春，梁后杰，刘为纹. 胃粘膜上皮细胞分离、培养和鉴定. 第三军医大学学报，1996；18(3)：255-256
4 徐永玲，张启行，李益农. MNNG诱导的胃粘膜细胞的非程序DNA合成. 中华肿瘤杂志，1991；13(2)：90-92
5 房殿春，刘卫，梁后杰，刘为纹. MNNG诱导人胃粘膜上皮细胞的损伤作用. 新消化病学杂志，1997；5(5)：299-300
6 Takahashi M. Enhanced lipid peroxidation in rat gastric mucosa caused by NaCl. Carcinogenesis, 1991;12(11):2201-2205
房殿春，男，1951-06-22生，吉林省长春市人，汉族. 1979年第三军医大学军医系毕业，现为第三军医大学第一附属医院消化内科教授，主任医师，博士生导师，中华消化内镜学会常委，全军消化内科专业委员会副主任委员，主要从事胃癌早期诊治研究，发表论文160篇，参加编写专著4部，获国家和军队科技进步奖10项.
, 百拇医药
通讯作者 房殿春，400038，第三军医大学西南医院消化科，重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号.
Correspondence to:FANG Dian-Chun, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 30 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038, China
Tel. +86*23*68754625， Fax. +86*23*65316682
收稿日期 1998-01-30, 百拇医药
单位：第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
关键词：亚硒酸钠/药理学；胃粘膜/药物作用；DNA/生物合成；过氧化脂质类/代谢；癌基因蛋白质P21(RAS)/代谢
华人消化杂志/980518.htm Effects of Na2SeO3 on unscheduled DNA synthesis, lipid peroxidation and ras P21 expression in gastric epithelial cells
FANG Dian-Chun, LIU Wei, LIANG Hou-Jie and LIU Wei-Wen
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
, 百拇医药
Subject headings sodium selenite/pharmacology; gastric mucosa/drug effects; DNA/biosynthesis; lipid peroxides/metabolism; oncogene protein P21 (ras)/metabolism
Abstract
AIM To evaluate the preventive effects of Na2SeO3 on gastric epithelial cells (GEC) damaged by N-methyl-N＇-nitrosoguanidine (MNNG).
METHODS Effects of Na2SeO3 on unscheduled DNA synthesis (UDS), lipid peroxidation and ras P21 expression in GEC induced by MNNG were observed.
, 百拇医药
RESULTS UDS level (cpm/×10-6min-1, 116.6±15.6 or 156.6±18.7 vs 183.8±20.5, P<0.01-0.05)，lipid peroxidation products (20?d, μmol/L, 4.5±0.6 or 4.7±0.6 vs 7.4±0.7，P<0.01) and ras P21 concentrations (20d, A, 0.68±0.08 or 0.86±0.07 vs 1.08±0.11，P<0.01-0.05) in GEC, treated with 10?μmol/L and 1μmol/?L Na2SeO3 for 4 hours prior to MNNG administration, decreased obviously, compared with GEC treated without Na2SeO3, the differences were significant.
, 百拇医药
CONCLUSION Na2SeO3 can effectively prevent chemical damages in GEC from MNNG.
中国图书资料分类号 R979.7
摘 要
目的 研究亚硒酸钠对甲基硝基亚硝基胍(MNNG)所致胃粘膜细胞损伤的防护作用.
方法 观察了亚硒酸钠对MNNG所致胃粘膜细胞非程序DNA合成(UDS)、脂质过氧化物(LPO)和ras P21表达的影响.
结果 胃粘膜细胞先用10μmol/L或1μmol/?L亚硒酸钠预处理4?h，再给MNNG组细胞的非程序DNA合成水平(cpm/×10-6min-1，116.6±15.6或156.6±18.7 vs 183.8±20.5, P<0.01～0.05)，脂质过氧化物(20d, μmol/L, 4.5±0.6或4.7±0.6 vs 7.4±0.7，P<0.01)和ras P21蛋白含量(20?d, A, 0.68±0.08或0.86±0.07 vs 1.08±0.11，P<0.01～0.05)均显著低于MNNG组.
, 百拇医药
结论 一定剂量亚硒酸钠对MNNG诱导的胃粘膜细胞损伤有防护作用.
0 引言
国内外大量流行病学调查证明，硒与人类癌症死亡率呈负相关，硒缺乏可增加人类患癌的危险性[1，2]. 动物实验亦证明，硒具有拮抗或抑制化学致癌剂的致癌诱癌作用. 为了解硒对胃粘膜细胞的保护作用，我们观察了亚硒酸钠(Na2SeO3)对甲基硝基亚硝基胍(MNNG)所致胎胃粘膜上皮细胞非程序DNA合成、脂质过氧化和ras基因产物P21蛋白表达的影响.
1 材料和方法
1.1 实验设计 胎胃粘膜上皮细胞的分离、培养和鉴定见前文[3]. 实验共分4组，包括MNNG组、三种不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)加MNNG组：10umol/L Na2SeO3+MNNG组(S1组)、1umol/L Na2SeO3+MNNG组(S2组)、0.1μmol/?L Na2SeO3+MNNG组(S3组). MNNG用量在培养液中终浓度均为10μmol/L. 取第2代培养24h后细胞，S1，S2，S3组分别用相应浓度Na2SeO3预处理4h，再与MNNG组同时加入MNNG，培养24h后，更换正常培养液，继续培养40d，观察实验过程中各组细胞各项指标的变化.
, 百拇医药
1.2 非程序DNA合成(UDS)测定 各组细胞经不同处理后分别加入羟基脲(5mmol/L, Sigma公司)和3H-TdR 5μ ci/ml(中国原子能研究所)，细胞继续培养4h，每瓶取小量细胞行台盼兰染色，以观察细胞成活情况，其余制备样品，按文献方法测定UDS[4].
1.3 脂质过氧化物(LPO)测定 采用硫代巴比妥酸比色法. 检测培养1、5、10、20、30和40?d细胞LPO含量[5].
1.4 ras P21酶联免疫吸附实验 取各组10、20、30、40d细胞测定ras P21蛋白，检测方法见前文[5].
统计学处理 采用方差分析法观察各组间差异的显著性，P<0.05为差别显著，P<0.01为差别非常显著.
, 百拇医药
2 结果
2.1 胎胃粘膜上皮细胞UDS 经台盼兰染色观察，各组细胞成活率均在90%以上. Na2SeO3对MNNG诱导胎胃粘膜上皮细胞UDS的影响，S1组和S2组胃粘膜上皮细胞的UDS水平显著低于MNNG组(P<0.01～0.05)，而S3组UDS水平与MNNG组相比则无显著差别(P>0.05，表1).
表1 各组胃粘膜细胞的UDS水平 组别
cpm/×10-6min-1
MNNG
183.8±20.5
S3
, 百拇医药
169.0±19.1
S2
156.6±18.7a
S1
116.6±15.6b
aP<0.05，bP<0.01，vs MNNG组
2.2 细胞LPO含量 S3组细胞LPO含量与MNNG组同步升降，在各时相两组间无显著差异(P>0.05，表2). S1组和S2组细胞LPO含量缓慢升高，1，5，10，20?d时显著低于MNNG组(P<0.01～0.05). 此后，由于MNNG组LPO下降，30，40?d时各组间LPO水平无显著差异(P>0.05).
, 百拇医药
表2 各组胃上皮细胞LPO含量(umol/L) 组别
t/d
1
5
10
20
30
40
MNNG
5.4±0.6
6.0±0.7
6.4±0.6
7.4±0.7
, 百拇医药
5.5±0.7
4.1±0.5
S3
5.5±0.6
5.9±0.6
6.4±0.6
7.3±0.7
5.7±0.6
4.2±0.5
S2
4.1±0.6a
4.3±0.6b
, http://www.100md.com
4.5±0.6b
4.7±0.6b
4.7±0.6
4.8±0.6
S1
3.9±0.5b
4.1±0.6b
4.3±0.6b
4.5±0.6b
4.7±0.6
, 百拇医药
4.7±0.6
aP<0.05，bP<0.01，vs MNNG组.表3 胃上皮细胞ras P21表达变化(A) 组别
t/d
10
20
30
40
MNNG
0.98±0.99
1.08±0.11
1.12±0.11
, http://www.100md.com
1.12±0.12
S3
0.95±0.11
1.04±0.11
1.08±0.12
1.18±0.11
S2
0.79±0.07a
0.86±0.07a
0.87±0.09b
0.91±0.09b
, 百拇医药
S1
0.65±0.08b
0.68±0.08b
0.68±0.09b
0.69±0.08b
aP<0.05，bP<0.01，vs MNNG组.
2.3 细胞ras P21蛋白含量 在各时相点，S3组细胞ras P21水平与MNNG组相比均无显著差异(P>0.05)，而S1组和S2组细胞ras P21水平则显著低于MNNG组(P<0.01～0.05，表3).
, 百拇医药
3 讨论
正常情况下，细胞DNA合成仅见于S期，但当细胞DNA受到损伤进行修复时，其DNA合成可发生在整个细胞周期. 那些发生于S期以外的DNA合成，谓之非程序DNA合成(unscheduled DNA synthesis, UDS). 测定UDS是一种检测致突变因子的可靠生物学方法，我们过去研究提示MNNG可损伤细胞DNA使细胞UDS水平显著升高[5]. 本研究发现，先用10umol/L(S1组)和1umol/L (S2组)Na2SeO3预处理胃粘膜4h，其UDS水平显著低于MNNG组，而用0.1umol/L(S3组)Na2SeO3预处理，其UDS水平与MNNG组相比则无显著差别，提示一定剂量Na2SeO3可防止MNNG对胃粘膜细胞DNA的损伤.
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LPO是指活性氧与不饱和脂肪酸作用产生的丙二醛等产物，它可致细胞DNA损伤，参与肿瘤的启动和促进过程[6]. 本研究发现，S3组细胞LPO含量与MNNG组同步升降，而S1组和S2组细胞LPO含量在培养d1，d5，d10和d20显著低于MNNG组. 提示一定剂量Na2SeO3可抑制MNNG引起的脂质过氧化，防止其对胃粘膜细胞的损伤.
P21蛋白是癌基因ras产物，我们过去的研究发现，MNNG组ras P21含量显著高于对照组，提示MNNG可诱发ras P21异常表达. 本研究还发现，S1组和S2组ras P21水平显著低于MNNG组，而S3组与MNNG组相比则无显著差异，提示一定剂量Na2SeO3 可抑制胃粘膜上皮细胞ras P21的表达，防止细胞癌变.
, 百拇医药
目前对硒的抗癌机制仍不完全清楚，根据本文资料推测可能与以下有关：①抑制肿瘤细胞生长繁殖；②拮抗化学致癌物对细胞遗传物质的损伤，保护细胞DNA，并促进受损DNA的修复；③抑制癌基因的表达；④抑制致癌物引起的脂质过氧化及自由基的产生，达到防癌目的.
4 参考文献
1 Lane HW, Medina D. Mode of action of selenium inhibition of 7,12-dimethylbenz[α] anthracene-induced mouse mammary tumorigenesis. JNCI, 1985;75(6):675-679
2 Peter T. In vivo effect of selenium on the mutagenic activity of aflatoxin BI. J Hgy Epidemiol Microbiol Immonol, 1990;34(2):123-128
, http://www.100md.com
3 刘卫，房殿春，梁后杰，刘为纹. 胃粘膜上皮细胞分离、培养和鉴定. 第三军医大学学报，1996；18(3)：255-256
4 徐永玲，张启行，李益农. MNNG诱导的胃粘膜细胞的非程序DNA合成. 中华肿瘤杂志，1991；13(2)：90-92
5 房殿春，刘卫，梁后杰，刘为纹. MNNG诱导人胃粘膜上皮细胞的损伤作用. 新消化病学杂志，1997；5(5)：299-300
6 Takahashi M. Enhanced lipid peroxidation in rat gastric mucosa caused by NaCl. Carcinogenesis, 1991;12(11):2201-2205
房殿春，男，1951-06-22生，吉林省长春市人，汉族. 1979年第三军医大学军医系毕业，现为第三军医大学第一附属医院消化内科教授，主任医师，博士生导师，中华消化内镜学会常委，全军消化内科专业委员会副主任委员，主要从事胃癌早期诊治研究，发表论文160篇，参加编写专著4部，获国家和军队科技进步奖10项.
, 百拇医药
通讯作者 房殿春，400038，第三军医大学西南医院消化科，重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号.
Correspondence to:FANG Dian-Chun, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 30 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038, China
Tel. +86*23*68754625， Fax. +86*23*65316682
收稿日期 1998-01-30, 百拇医药