《临床糖尿病的现代诊断和治疗》一书出版
作者：
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志980511 【摘要】 目的 研究本室自制猪脑GAD是否能保护NOD鼠胰岛β细胞免遭破坏及其意义。方法 在4周龄NOD鼠注射GAD，对照组注射等量牛血清白蛋白(BSA)，分别于19周龄、25周龄和47周龄处死，胰腺组织常规制成石蜡切片，ABC免疫组化染胰岛β细胞并光镜下计数。结果 同周龄GAD组发生胰岛炎程度和胰岛炎评分均明显低于BSA组：同周龄GAD组胰岛β细胞计数明显高于BSA组，均有显著性差异(P<0.001)；胰岛炎分值与胰岛β细胞阳性率存在密切负相关(P<0.001)。结论 本室自制猪脑GAD能减轻NOD雌鼠胰岛炎的发生和保护胰岛β细胞免遭破坏的作用。
Prevention of insulitis by glutamic acid decarboxylase in NOD mice Yang Zhulin,Zhou Zhiguang,Wu Hanwen,et al.Institute of Metabolism and Endocrinology,Hunan Medical University,Changsha,410011
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To study whether porcine brain glutamic acid decarboxylase (GAD) purified in our laboratory can protect β cells. Methods GAD or BSA (control) was injected intraperitoneally into female NOD mice at age of 4 weeks and they were killed separately at 19th, 25th and 47th week. Pancreatic tissues were made into paraffin sections routinely. The islet β cells were stained by ABC immunohistochemical method and counted under microscopy. Results Both incidence and scoring of insulitis were significantly lower in GAD group than that in BSA group of the same age. The number of β cells were significantly higher in GAD group than in BSA group of the same age. A negative correlation was found between score of insulitis and number of β cells in islets (P<0.001). Conclusion The pocrine brain GAD purified in our laboratory ameliorates insulitis and mitigates the damage of β cells in islets in NOD mouse.
, http://www.100md.com
【Key words】 NOD mouse β cells Glutamic acid decarboxylase Immunohistochemistry
(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:315-317)
NOD小鼠(Non-obese diabetic mouse)是一种遗传性1型糖尿病的啮齿动物模型，其发病机理为T细胞介导的胰岛β细胞进行性破坏和数量减少〔1〕。国外学者近年发现1型糖尿病胰岛自身抗原——谷氨酸脱羧酶(GAD)在预防NOD鼠胰岛炎及糖尿病发生中显示良好效果〔2，3〕。本文应用自制猪脑GAD于NOD鼠，观察NOD鼠胰岛内β细胞计数及其意义。
材料和方法
一、材料
, http://www.100md.com
NOD 鼠从澳大利亚 WEHI 医学研究 中心引进，由山西医科大学张志利教授提供。本实验采用的NOD雌鼠群落在210天龄糖尿病自然发病率为70%。所有小鼠在标准饲养环境下喂养，自由饮净化水及全价营养颗粒饮食。
二、方法
25只4周龄NOD雌鼠分成GAD组和BSA组(对照组)。GAD组共15只，于4周龄腹腔内注射GAD 2.4mU酶活性单位(100μl)，分别于19周龄(6只)、25周龄(4只)和47周龄(5只)处死。BSA组共10只，于4周龄腹腔内注射BSA 1mg(100μl)，分别于19周龄(4只)和47周龄(6只)处死。处死后按常规取下胰腺后置10%中性福尔马林液固定，常规制作石蜡切片，厚4μm。
GAD由本所按文献方法制备〔4〕，将新鲜猪脑粗提，HPLC层析分离，收集GAD酶活性峰，本所制备的GAD含两种同功酶(GAD65和GAD67)，产品含蛋白质10mg/ml，含酶活性单位24mU/ml。BSA由上海第二医科大学生产。鼠抗人和动物胰岛素单克隆抗体(1/100)、生物素标记羊抗鼠lgG(1/300)和ABC试剂(1/500)均购自Sigma公司；DAB-HCl由瑞士进口分装。
, http://www.100md.com
胰岛炎评分参照Guytingco和Tisch评分标准〔5，6〕，每只鼠胰在HE染色和高倍镜(HP)下随机计数10个胰岛分值，所得值0分示正常胰岛，1～2分示胰岛周围炎，3～4分示胰岛内炎。胰岛β细胞染色为ABC免疫组化法，β细胞胞浆呈淡棕黄色至深棕黄色颗粒，以0.01M PBS (PH7.4)替代一抗、二抗或ABC试剂作为每次染色阴性对照；高倍光镜下每一切片中随机计数5个胰岛内β细胞数、胰岛炎分值及胰岛内细胞总数，胰岛内β细胞阳性率=β细胞数/胰岛细胞总数。
三、统计学方法
应用t检验、直接概率法及直线回归与相关分析。
结 果
一、胰岛炎发生程度
19周龄鼠中，6只GAD组鼠均为胰岛周围炎，4只BSA组鼠1只为胰岛周围炎和3只为胰岛内炎，两者存在显著差异(P=0.0333)。25周龄鼠中，4只GAD组鼠3只为胰岛周围炎，1只为胰岛内炎，本组无BSA组鼠。47周龄鼠中，5只GAD组鼠3只为胰岛周围炎，2只为胰岛内炎，6只BSA组鼠1只为胰岛周围炎，5只为胰岛内炎，两者无显著差异
, 百拇医药
附表 GAD组胰岛炎评分和β细胞计数阳性率与BSA组比较(
)
Table Comparison of scores of insulitis and number of β
cells between GAD and BSA group 分组
Group
例数
n
胰岛炎评分
Scoring of insulitis
n'=n×10
, 百拇医药
β细胞计数
No. of β cells
n'=n×5
19W GAD组
19W GAD group
6
1.266±0.795
0.6790±0.1098
19W BSA组
19W BSA group
4
2.283±0.985**△△
, 百拇医药
0.4966±0.2136**△△
25W GAD组
25W GAD group
4
1.235±0.899
0.6681±0.0919
47W GAD组
47W GAD group
5
1.175±1.022
0.6920±0.0632
, http://www.100md.com
47W GAD组
47W GAD group
6
2.531±1.071**△△
0.4949±0.1347**△△
注：与同周龄GAD组比较 Compared with GAD of same age,**P<0.001；与25W GAD组比较 Compared with 25W GAD,△△P<0.001
(P=0.197)。附表所示，GAD组鼠胰岛炎评分均数均明显低于BSA组鼠，均有高度显著差异。
二、胰岛内β细胞计数(附表)
, 百拇医药
GAD组胰岛内β细胞计数阳性率均明显高于同周龄BSA组，均有高度显著差异；25周龄GAD组鼠胰岛内β细胞计数阳性率也明显高于19周龄、47周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(图1，2)。
三、胰岛炎分值与胰岛内β细胞计数的相关分析
通过直线相关与回归分析，胰岛炎分值与胰岛内β细胞计数阳性率之间存在高度密切负相关(r=-0.6896,P<0.001)，其回归方程为y=0.7338-0.0836x(y为β细胞阳性率，x为胰岛炎分值)。
图1 3个胰岛炎评分均为0分，其β细胞计数阳性率分别为0.872、0.821和0.745，GAD组鼠(19W)，ABC免疫组化法×100
Fig 1 The score of insulitis of 3 islets are 0, the positive rates of β cell number are 0.872, 0.821 and 0.745, respectively. GAD group (19th week), ABC immunohistochemical method
, http://www.100md.com
图2 2个胰岛胰岛炎评分均为4分，其β细胞计数阳性率分别为0.495和0.120，BSA组鼠(19W)，ABC免疫组化法×200
Fig 2 The score of insulitis of 2 islets is 4,the positive rates of β cell number are 0.495 and 0.120,respectively.BSA group (19th week).ABC immunohistochemical method
讨 论
1型糖尿病发病机理主要表现为自身免疫反应引起的胰岛β细胞进行性破坏。NOD鼠第5周龄起可自发出现自身免疫性胰岛炎，β细胞进行性破坏而发展成糖尿病，NOD鼠糖尿病与人类1型糖尿病有许多相似之处，适用于作为人类1型糖尿病病因病理及预防研究探讨的动物模型〔1-3，6〕。GAD为一种β细胞自身抗原，在人类和NOD鼠1型糖尿病中起重要作用，近年发现GAD65能抑制自身反应性T细胞对GAD65和其肽类的增殖反应，阻止NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生〔2-4〕。Elliott等给4周龄NOD鼠腹腔注射100μg GAD67能预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生〔3〕。国外学者均发现BSA不能预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生，本文用它作对照。本文发现GAD实验组NOD雌鼠胰岛炎发生程度和胰岛炎评分均数明显低于BSA组鼠，其结果与国外文献报道一致，GAD能明显减轻NOD鼠胰岛炎发生。说明通过诱导对GAD的免疫耐受能减轻NOD鼠胰岛炎，从而可预防糖尿病发生，为人类预防和治疗1型糖尿病提供了一条新途径。
, 百拇医药
NOD鼠胰岛内β细胞定位、计数及与GAD预防胰岛炎的关系及其机理国内外尚未见文献报道。本文发现GAD组胰岛β细胞阳性率明显地高于BSA组，且胰岛内β细胞阳性率计数与胰岛炎分值呈高度负相关。其实验结果为GAD预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生提供了病理形态学证据，进一步证实了GAD能预防胰岛炎和糖尿病的发生，且说明了胰岛炎程度与胰岛内β细胞死亡之间存在密切的直线相关。
国家自然科学基金资助(39370343)，湖南省中青年科技基金资助
参 考 文 献
1 Signore A, Pozzilli P, Cale EMA, et al. The natural history of lymphocyte subsets infilitrating the pancreas of NOD mice. Diabetologia, 1989,32:282.
, 百拇医药
2 Tian J, Atkinson MA, Clare-salzler M, et al. Nasal administration of glutamate decarboxylase (GAD) peptids induced Th2 response and prevents murine insulin-dependent diabetes. J Exp Med, 1996,183:1561.
3 Elliot JF, Qin HY, Bhatti S, et al. Immunization with the larger isoform of mouse glutamic acid decarboxylase (GAD67) prevents autoimmune diabetes in NOD mice. Diabetes, 1994,43:1494.
4 Nathan B, Hsu CC, Bao J, et al. Purification and charactrization of a novel form of brain glutamate decarboxylase: a Ca2+-dependent peripheral membrane protein. J Biol Chem, 1994,269:7249.
, http://www.100md.com
5 Guytingco R, Quddus J, Richarclson B, et al. Single administrsation or Bacillus Csalmette-Guerin (BCG) vaccine in non-obese diabetic (NOD) mice results in supression of in vitro T-lymphocyte proliferation and regression of insulitis. Diabetes, 1991,40:152.
6 Tisch R, Yang XD, Singer SM, et al. Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature, 1993,366:72.
(收稿：1998-01-16 修回：1998-08-24), http://www.100md.com
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关键词：
中华内分泌代谢杂志980511 【摘要】 目的 研究本室自制猪脑GAD是否能保护NOD鼠胰岛β细胞免遭破坏及其意义。方法 在4周龄NOD鼠注射GAD，对照组注射等量牛血清白蛋白(BSA)，分别于19周龄、25周龄和47周龄处死，胰腺组织常规制成石蜡切片，ABC免疫组化染胰岛β细胞并光镜下计数。结果 同周龄GAD组发生胰岛炎程度和胰岛炎评分均明显低于BSA组：同周龄GAD组胰岛β细胞计数明显高于BSA组，均有显著性差异(P<0.001)；胰岛炎分值与胰岛β细胞阳性率存在密切负相关(P<0.001)。结论 本室自制猪脑GAD能减轻NOD雌鼠胰岛炎的发生和保护胰岛β细胞免遭破坏的作用。
Prevention of insulitis by glutamic acid decarboxylase in NOD mice Yang Zhulin,Zhou Zhiguang,Wu Hanwen,et al.Institute of Metabolism and Endocrinology,Hunan Medical University,Changsha,410011
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【Abstract】 Objective To study whether porcine brain glutamic acid decarboxylase (GAD) purified in our laboratory can protect β cells. Methods GAD or BSA (control) was injected intraperitoneally into female NOD mice at age of 4 weeks and they were killed separately at 19th, 25th and 47th week. Pancreatic tissues were made into paraffin sections routinely. The islet β cells were stained by ABC immunohistochemical method and counted under microscopy. Results Both incidence and scoring of insulitis were significantly lower in GAD group than that in BSA group of the same age. The number of β cells were significantly higher in GAD group than in BSA group of the same age. A negative correlation was found between score of insulitis and number of β cells in islets (P<0.001). Conclusion The pocrine brain GAD purified in our laboratory ameliorates insulitis and mitigates the damage of β cells in islets in NOD mouse.
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【Key words】 NOD mouse β cells Glutamic acid decarboxylase Immunohistochemistry
(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:315-317)
NOD小鼠(Non-obese diabetic mouse)是一种遗传性1型糖尿病的啮齿动物模型，其发病机理为T细胞介导的胰岛β细胞进行性破坏和数量减少〔1〕。国外学者近年发现1型糖尿病胰岛自身抗原——谷氨酸脱羧酶(GAD)在预防NOD鼠胰岛炎及糖尿病发生中显示良好效果〔2，3〕。本文应用自制猪脑GAD于NOD鼠，观察NOD鼠胰岛内β细胞计数及其意义。
材料和方法
一、材料
, http://www.100md.com
NOD 鼠从澳大利亚 WEHI 医学研究 中心引进，由山西医科大学张志利教授提供。本实验采用的NOD雌鼠群落在210天龄糖尿病自然发病率为70%。所有小鼠在标准饲养环境下喂养，自由饮净化水及全价营养颗粒饮食。
二、方法
25只4周龄NOD雌鼠分成GAD组和BSA组(对照组)。GAD组共15只，于4周龄腹腔内注射GAD 2.4mU酶活性单位(100μl)，分别于19周龄(6只)、25周龄(4只)和47周龄(5只)处死。BSA组共10只，于4周龄腹腔内注射BSA 1mg(100μl)，分别于19周龄(4只)和47周龄(6只)处死。处死后按常规取下胰腺后置10%中性福尔马林液固定，常规制作石蜡切片，厚4μm。
GAD由本所按文献方法制备〔4〕，将新鲜猪脑粗提，HPLC层析分离，收集GAD酶活性峰，本所制备的GAD含两种同功酶(GAD65和GAD67)，产品含蛋白质10mg/ml，含酶活性单位24mU/ml。BSA由上海第二医科大学生产。鼠抗人和动物胰岛素单克隆抗体(1/100)、生物素标记羊抗鼠lgG(1/300)和ABC试剂(1/500)均购自Sigma公司；DAB-HCl由瑞士进口分装。
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胰岛炎评分参照Guytingco和Tisch评分标准〔5，6〕，每只鼠胰在HE染色和高倍镜(HP)下随机计数10个胰岛分值，所得值0分示正常胰岛，1～2分示胰岛周围炎，3～4分示胰岛内炎。胰岛β细胞染色为ABC免疫组化法，β细胞胞浆呈淡棕黄色至深棕黄色颗粒，以0.01M PBS (PH7.4)替代一抗、二抗或ABC试剂作为每次染色阴性对照；高倍光镜下每一切片中随机计数5个胰岛内β细胞数、胰岛炎分值及胰岛内细胞总数，胰岛内β细胞阳性率=β细胞数/胰岛细胞总数。
三、统计学方法
应用t检验、直接概率法及直线回归与相关分析。
结 果
一、胰岛炎发生程度
19周龄鼠中，6只GAD组鼠均为胰岛周围炎，4只BSA组鼠1只为胰岛周围炎和3只为胰岛内炎，两者存在显著差异(P=0.0333)。25周龄鼠中，4只GAD组鼠3只为胰岛周围炎，1只为胰岛内炎，本组无BSA组鼠。47周龄鼠中，5只GAD组鼠3只为胰岛周围炎，2只为胰岛内炎，6只BSA组鼠1只为胰岛周围炎，5只为胰岛内炎，两者无显著差异
, 百拇医药
附表 GAD组胰岛炎评分和β细胞计数阳性率与BSA组比较(
)Table Comparison of scores of insulitis and number of β
cells between GAD and BSA group 分组
Group
例数
n
胰岛炎评分
Scoring of insulitis
n'=n×10
, 百拇医药
β细胞计数
No. of β cells
n'=n×5
19W GAD组
19W GAD group
6
1.266±0.795
0.6790±0.1098
19W BSA组
19W BSA group
4
2.283±0.985**△△
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0.4966±0.2136**△△
25W GAD组
25W GAD group
4
1.235±0.899
0.6681±0.0919
47W GAD组
47W GAD group
5
1.175±1.022
0.6920±0.0632
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47W GAD组
47W GAD group
6
2.531±1.071**△△
0.4949±0.1347**△△
注：与同周龄GAD组比较 Compared with GAD of same age,**P<0.001；与25W GAD组比较 Compared with 25W GAD,△△P<0.001
(P=0.197)。附表所示，GAD组鼠胰岛炎评分均数均明显低于BSA组鼠，均有高度显著差异。
二、胰岛内β细胞计数(附表)
, 百拇医药
GAD组胰岛内β细胞计数阳性率均明显高于同周龄BSA组，均有高度显著差异；25周龄GAD组鼠胰岛内β细胞计数阳性率也明显高于19周龄、47周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(图1，2)。
三、胰岛炎分值与胰岛内β细胞计数的相关分析
通过直线相关与回归分析，胰岛炎分值与胰岛内β细胞计数阳性率之间存在高度密切负相关(r=-0.6896,P<0.001)，其回归方程为y=0.7338-0.0836x(y为β细胞阳性率，x为胰岛炎分值)。
图1 3个胰岛炎评分均为0分，其β细胞计数阳性率分别为0.872、0.821和0.745，GAD组鼠(19W)，ABC免疫组化法×100
Fig 1 The score of insulitis of 3 islets are 0, the positive rates of β cell number are 0.872, 0.821 and 0.745, respectively. GAD group (19th week), ABC immunohistochemical method
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图2 2个胰岛胰岛炎评分均为4分，其β细胞计数阳性率分别为0.495和0.120，BSA组鼠(19W)，ABC免疫组化法×200
Fig 2 The score of insulitis of 2 islets is 4,the positive rates of β cell number are 0.495 and 0.120,respectively.BSA group (19th week).ABC immunohistochemical method
讨 论
1型糖尿病发病机理主要表现为自身免疫反应引起的胰岛β细胞进行性破坏。NOD鼠第5周龄起可自发出现自身免疫性胰岛炎，β细胞进行性破坏而发展成糖尿病，NOD鼠糖尿病与人类1型糖尿病有许多相似之处，适用于作为人类1型糖尿病病因病理及预防研究探讨的动物模型〔1-3，6〕。GAD为一种β细胞自身抗原，在人类和NOD鼠1型糖尿病中起重要作用，近年发现GAD65能抑制自身反应性T细胞对GAD65和其肽类的增殖反应，阻止NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生〔2-4〕。Elliott等给4周龄NOD鼠腹腔注射100μg GAD67能预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生〔3〕。国外学者均发现BSA不能预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生，本文用它作对照。本文发现GAD实验组NOD雌鼠胰岛炎发生程度和胰岛炎评分均数明显低于BSA组鼠，其结果与国外文献报道一致，GAD能明显减轻NOD鼠胰岛炎发生。说明通过诱导对GAD的免疫耐受能减轻NOD鼠胰岛炎，从而可预防糖尿病发生，为人类预防和治疗1型糖尿病提供了一条新途径。
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NOD鼠胰岛内β细胞定位、计数及与GAD预防胰岛炎的关系及其机理国内外尚未见文献报道。本文发现GAD组胰岛β细胞阳性率明显地高于BSA组，且胰岛内β细胞阳性率计数与胰岛炎分值呈高度负相关。其实验结果为GAD预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生提供了病理形态学证据，进一步证实了GAD能预防胰岛炎和糖尿病的发生，且说明了胰岛炎程度与胰岛内β细胞死亡之间存在密切的直线相关。
国家自然科学基金资助(39370343)，湖南省中青年科技基金资助
参 考 文 献
1 Signore A, Pozzilli P, Cale EMA, et al. The natural history of lymphocyte subsets infilitrating the pancreas of NOD mice. Diabetologia, 1989,32:282.
, 百拇医药
2 Tian J, Atkinson MA, Clare-salzler M, et al. Nasal administration of glutamate decarboxylase (GAD) peptids induced Th2 response and prevents murine insulin-dependent diabetes. J Exp Med, 1996,183:1561.
3 Elliot JF, Qin HY, Bhatti S, et al. Immunization with the larger isoform of mouse glutamic acid decarboxylase (GAD67) prevents autoimmune diabetes in NOD mice. Diabetes, 1994,43:1494.
4 Nathan B, Hsu CC, Bao J, et al. Purification and charactrization of a novel form of brain glutamate decarboxylase: a Ca2+-dependent peripheral membrane protein. J Biol Chem, 1994,269:7249.
, http://www.100md.com
5 Guytingco R, Quddus J, Richarclson B, et al. Single administrsation or Bacillus Csalmette-Guerin (BCG) vaccine in non-obese diabetic (NOD) mice results in supression of in vitro T-lymphocyte proliferation and regression of insulitis. Diabetes, 1991,40:152.
6 Tisch R, Yang XD, Singer SM, et al. Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature, 1993,366:72.
(收稿：1998-01-16 修回：1998-08-24), http://www.100md.com