糖尿病大鼠血清中NO和组织中NOS活性的测定及其意义
作者：许化溪 王卉放 李良菊
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志980514 许多因素可延缓皮下注射胰岛素的吸收，然而，临床上进行合理处理后仍不能满意增加胰岛素的吸收率，研究表明胰岛素的生理、生化特征是影响其吸收的最大障碍，胰岛素的三级结构末端易形成稳定的、非平行、非共价的β折叠，与另一个分子形成二聚体，如此构成了胰岛素自身结合的基础，而且在锌离子存在时，三个二聚体结合成更稳定的六聚体。由于只有单分子胰岛素才较易通过毛细血管内皮细胞屏障吸收，多聚体必须裂解成单体才可吸收〔1〕。为此，近年来为减少胰岛素分子聚合、改善其吸收过程作了众多探讨。
一、结构特征
既然二聚体是胰岛素多聚体形成的必备条件，就需要研制出既能在溶液中维持单体，又能发挥胰岛素效应的人胰岛素类似物，1992年Drejer〔1〕为研制能用于人的快速吸收人胰岛素类似物获得了初步成功，发现AspB10及AspB9-GluB27类似物自身结合减少，皮下注射后快速吸收，遗憾的是AspB10类似物引发了小鼠乳腺肿瘤的增加，致使人体研究中断，其致瘤作用可能归结于它与胰岛素及IGF-1受体结合亲和力高于人胰岛素。此外AspB9-GluB27类似物与胰岛素结合的亲和力较人胰岛素显著下降，可见上述类似物显然不适合用于临床。经数学模型和X线晶体显像研究，最终确定了β链28位上脯氨酸残基在胰岛素二聚体形成中具有关键性作用，随后发现IGF-1分子中B28赖氨酸与B29脯氨酸结构不易形成二聚体。将人胰岛素分子中B28脯氨酸与B29赖氨酸残基反转后减少了自身结合能力，从而，研制了人胰岛素类似物(简称Lispro)。由于胰岛素β链COOH末端不参与同受体结合，因此，Lispro的生物学活性不受影响，事实上，就与胰岛素受体结合及对细胞葡萄糖摄取效应而言，Lispro与胰岛素受体结合是等效的〔2〕。Lispro与IGF-1受体亲和力较胰岛素增加约50～60%，但体外用其刺激人乳腺上皮细胞无明显加速生长作用。
, 百拇医药
二、药代动力学特征
临床上Lispro作为第一个获准用于人体的快作用胰岛素制剂是有效的，皮下注射后5～15分钟开始作用，30～60分钟达峰浓度，峰值效应为60～90分钟，作用维持4～5小时，峰值胰岛素浓度较注射正规人胰岛素(RHI)后高3～4倍〔2〕，故抑制肝葡萄糖生成更有效，而外周葡萄糖利用仅轻度增加〔3〕。附表显示Lispro及临床上常用人胰岛素的药动学参数。注射部位对Lispro吸收影响较少，尽管将Lispro注射到三角肌及大腿部位较腹部的作用时间轻度延长，但Lispro开始作用在不同注射部位无明显变化，相反RHI注射到三角肌或大腿部位，作用开始及维持时间均延迟〔4〕。
附表 Lispro及常用人胰岛素制剂的药动学参数 品种
作用时间(h)
, 百拇医药 开始
高峰
维持
Lispro
1/12-1/4
1-2
4-5
正规
1/2-1
2-4
6-8
NPH
1-2
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5-7
13-18
慢胰岛素
1-3
4-8
13-20
三、免疫原性
Lispro的结构与RHI有所不同，该差异能否改变免疫原性，从而改变了体内胰岛素抗体状态，尤其能否提高胰岛素抗体的阳性率?为此Fineberg用自身空白消减试验(Self-blank subtraction assay)对以往应用胰岛素的糖尿病患者作了胰岛素特异抗体(ISA)、Lispro特异性抗体(LSA)及交叉性抗体(CRA)估价，结果显示用Lispro治疗前LSA 0-4%阳性，ISA 10%阳性，而CRA 30-50%阳性，改用Lispro 6月后未见ISA，LSA及CRA的阳性率及阳性状态呈显著改变，表明Lispro并未增强免疫原性〔5〕。然而Lahtela〔6〕报道一例用人胰岛素伴发严重胰岛素抵抗的患者，改用Lispro后，经一年随访胰岛素剂量、HbA1c及胰岛素抗体水平均呈显著下降，晨间低血糖反应消失，提示Lispro与人胰岛素分子结构不同，亦可能阻止了Lispro与胰岛素抗体的结合，改善了胰岛素的敏感性，因而认为Lispro可作为免疫原性胰岛素抵抗的治疗。
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四、对胰岛素受体的影响
Jehle〔7〕研究了Lispro和RHI强化治疗对胰岛素受体状态的影响，用分离的单核细胞作竞争性放射性胰岛素结合试验，结果显示Lispro治疗组较RHI治疗组胰岛素结合位点总数显著增加(9 400±2 200 vs 20 300±3 000)，竞争50%胰岛素结合位点所需要胰岛素浓度Lispro组(0.1±0.03mmol/L)显著低于RHI组(0.6±0.2nmol/L)。此外，如用Lispro治疗1型糖尿病，其空腹状态、注射后1小时、5小时单核细胞受体与胰岛素结合的亲和力及容量均与正常对照组内源性胰岛素的状况相近(1小时最低，5小时恢复)，与此相对比的是若用RHI，则胰岛素与单核细胞受体的亲和力及容量在空腹状态就低，并呈持续下降，以5小时为最显著。提示Lispro治疗模仿了生理性胰岛素分泌的作用，亦改善了胰岛素受体的敏感性。但用Lispro和RHI预处理IM-9淋巴母细胞对胰岛素结合的降调节未显示差异。
, 百拇医药 五、临床研究
Lispro与RHI的长时期、随机、多中心研究显示Lispro能改善2型糖尿病患者的餐后2小时血糖，尤其餐前，注射Lispro组较餐前30分钟注射RHI组餐后2小时血糖降低更显著〔8〕。Lispro控制餐后早期血糖的作用已被许多研究证实〔9，10〕，而对餐后晚期血糖的效应报道较少，甚至某些研究始终未能显示Lispro用于糖尿病治疗对总体血糖控制水平(HbA1c)的显著改进，故认为Lispro活性可能逐渐消失而致餐后晚期高血糖。为此，进行了一项前瞻性、随机、单盲研究，在标准餐后(750千卡，美国糖尿病学会推荐)8小时内对代谢指标作了估价，所有患者均接受特慢胰岛素(Ultralente,0.2u/kg)，1组单独使用，另4组在早晨标准餐前随机与下列方案组合：(1)RHI 0.15u/kg;(2)Lispro 0.15u/kg;(3)Lispro 0.1u/kg;(4)Lispro与RHI混合物(1:1)0.15u/kg。结果显示餐后血糖峰值在(2)、(3)、(4)组均较(1)及特慢胰岛素组显著下降，且显示在8小时平均血糖水平在(1)、(2)、(4)组间无显著差异。此外，Lispro组〔(2)、(3)、(4)〕游离胰岛素峰值出现得较早，较高，而(1)组在第8小时平均胰岛素水平仍较高，提示用RHI后持续性高胰岛素血症可能引起部分病例发生餐后晚期低血糖。由于Lispro与特慢胰岛素合用时，餐后8小时降糖作用稳定，若恰当掌握剂量，可改善GHb水平〔11〕。晚近Zinman对30例1型糖尿病患者作了随机双盲交叉试验，与RHI组相比，Lispro组HbA1c水平显著降低，三餐后1小时血糖显著改善，而餐前、晚间及2Am血糖值无明显差异〔12〕。提示Lispro对餐后血糖及HbA1c水平均有显著下降，且不会引起餐后晚期血糖升高。
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六、低血糖反应
如上所述，Lispro对餐后早期血糖具有较强的降低作用，是否引起这一时期低血糖发生率增加，长时期临床试验显示Lispro与RHI有相同的低血糖发生率〔12-14〕，亦有研究显示应用Lispro后低血糖发生率低于RHI〔15，16〕。Berge报道〔17〕用Lispro“标准剂量”(0.15u/kg)治疗1型糖尿病时，在总热量为500千卡而成分不同的三次早餐后3小时低血糖发生多于RHI组，特别在碳水化合物含量较低时。提示Lispro既改善了血糖谱，并未增加低血糖的危险性。但在进餐中碳水化合物含量较低时，应注意调整其剂量。
七、结束语
总之，Lispro在溶液中以单体存在，皮下注射后快速吸收，具有较高的胰岛素峰值，作用时间维持较短，模仿了正常性第一时相胰岛素分泌，同时保持甚至增强了与胰岛素受体结合的亲和力和效能，但未增加低血糖反应的频率，因此，Lispro是糖尿病患者应用胰岛素的较理想的选择。 参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Drejer K. The bioactivity of insulin analogues from in vitro receptor binding to in vivo glucose uptake. Diabetes Metab Rev， 1992,8:259-286.
2 Howey DC, Bowsher RR, Bruelle RL, et al. 〔Lys(B28). Pro(B29)〕-Human insulin: a rapidly absorbed analogue of human insulin. Diabetes， 1994,43:396-402.
3 Torlone E, Fanelli C, Rambotli AM, et al. Pharmacokinetics, pharmacodynetics and insulin analogues. Diabetologia， 1981,12:94-101.
, http://www.100md.com
4 Braak EW, Woodworth JR, Bianchi R, et al. Injection site effects on the pharmacokinetics and glucodynamic of insulin Lispro and regular insulin. Diabetes Care， 1996,19:1437-1440.
5 Fineberg NS, Fineberg SE, Anderson JH, et al. Immunologic effects of insulin Lispro in IDDM and NIDDM patients previously treated with insulin. Diabetes， 1996,45:1750-1754.
6 Lahtela JT, Knik M, Paul, et al. Severe antibody-mediated human insulin resistance: successful treatment with the insulin analog Lispro. Diabetes Care， 1997,23:71-73.
, 百拇医药
7 Jehle PM, Fussgaenger FD, Kunze U, et al. The human insulin analog insulin Lispro improves insulin binding on circulating monocytes of intensively treated IDDM patients. J Clin Endocriol Metab， 1996,81:2319-2327.
8 Vignati L, Anderson J, Brunelle R. Efficacy of 〔Lys(B28). Pro(B29)〕 human insulin in a one year global randomized clinical trial. Diabetes， 1994,43(suppl 1):78A.
9 Pampamelli S, Torlone E, Laci C, et al. Improved postprandial metabolic control after subcutaneous injection of a short-acting insulin analog in IDDM of short duration with residual pancreatic B-cell function. Diabetes Care， 1995,18:1452-1459.
, http://www.100md.com
10 Howcy DC, Bowsher RR, Bruncllc RL, et al. 〔Lys(B28). Pro(B29)〕-human: Effect of injection time on postprandial glycemia. Clin Pharmacol Ther， 1995,58:459-469.
11 Burge MR, Watetrs DL, Holcombe JH, et al. Prolonged efficacy of short acting insulin Lispro in combination with human Ultralente in IDDM. J Clin Endocrinol Metab， 1997,82:920-924.
12 Zinman B, Tildesley H, Chiasson JL, et al. Insulin Lispro in CISS: results of a double-blind crossover study. Diabetes， 1997,46:440-443.
, 百拇医药
13 Anderson J, Symanowski S, Brunelle. Safety of 〔Lys(B28).Pro(B29)〕 human insulin analog in long-term clinical trial. Diabetes， 1994,43(Suppl 1):614.
14 Carg SK, Carmain JA, Braddy KC, et al. Pre-meal insulin Lispro vs. Humulin R insulin treatment in young subjects with type I diabetes. Diabet Med， 1995,12:1-6.
15 Bastyr EJ, Kostanos J, Vignati L, et al. Insulin Lispro reduces hypoglycemia rate in patients with type 2 diabetes at high risk for hypoglycemia. Diabetes， 1996,45(suppl 1):56A.
, http://www.100md.com
16 Anderson J, Brunelle R, Pfuetzner A, et al. Reduced frequency of hypoglycemia without loss of glycemic control. Diabetes， 1996:45(suppl 1):s46-s49.
17 Berge MR, Castillo KR, Schade DS, et al. Meal composition is a determinant of insulin Lispro induced hypoglycemia in IDDM. Diabetes Care, 1997,20:152-155.
(收稿：1998-04-09), 百拇医药
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关键词：
中华内分泌代谢杂志980514 许多因素可延缓皮下注射胰岛素的吸收，然而，临床上进行合理处理后仍不能满意增加胰岛素的吸收率，研究表明胰岛素的生理、生化特征是影响其吸收的最大障碍，胰岛素的三级结构末端易形成稳定的、非平行、非共价的β折叠，与另一个分子形成二聚体，如此构成了胰岛素自身结合的基础，而且在锌离子存在时，三个二聚体结合成更稳定的六聚体。由于只有单分子胰岛素才较易通过毛细血管内皮细胞屏障吸收，多聚体必须裂解成单体才可吸收〔1〕。为此，近年来为减少胰岛素分子聚合、改善其吸收过程作了众多探讨。
一、结构特征
既然二聚体是胰岛素多聚体形成的必备条件，就需要研制出既能在溶液中维持单体，又能发挥胰岛素效应的人胰岛素类似物，1992年Drejer〔1〕为研制能用于人的快速吸收人胰岛素类似物获得了初步成功，发现AspB10及AspB9-GluB27类似物自身结合减少，皮下注射后快速吸收，遗憾的是AspB10类似物引发了小鼠乳腺肿瘤的增加，致使人体研究中断，其致瘤作用可能归结于它与胰岛素及IGF-1受体结合亲和力高于人胰岛素。此外AspB9-GluB27类似物与胰岛素结合的亲和力较人胰岛素显著下降，可见上述类似物显然不适合用于临床。经数学模型和X线晶体显像研究，最终确定了β链28位上脯氨酸残基在胰岛素二聚体形成中具有关键性作用，随后发现IGF-1分子中B28赖氨酸与B29脯氨酸结构不易形成二聚体。将人胰岛素分子中B28脯氨酸与B29赖氨酸残基反转后减少了自身结合能力，从而，研制了人胰岛素类似物(简称Lispro)。由于胰岛素β链COOH末端不参与同受体结合，因此，Lispro的生物学活性不受影响，事实上，就与胰岛素受体结合及对细胞葡萄糖摄取效应而言，Lispro与胰岛素受体结合是等效的〔2〕。Lispro与IGF-1受体亲和力较胰岛素增加约50～60%，但体外用其刺激人乳腺上皮细胞无明显加速生长作用。
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二、药代动力学特征
临床上Lispro作为第一个获准用于人体的快作用胰岛素制剂是有效的，皮下注射后5～15分钟开始作用，30～60分钟达峰浓度，峰值效应为60～90分钟，作用维持4～5小时，峰值胰岛素浓度较注射正规人胰岛素(RHI)后高3～4倍〔2〕，故抑制肝葡萄糖生成更有效，而外周葡萄糖利用仅轻度增加〔3〕。附表显示Lispro及临床上常用人胰岛素的药动学参数。注射部位对Lispro吸收影响较少，尽管将Lispro注射到三角肌及大腿部位较腹部的作用时间轻度延长，但Lispro开始作用在不同注射部位无明显变化，相反RHI注射到三角肌或大腿部位，作用开始及维持时间均延迟〔4〕。
附表 Lispro及常用人胰岛素制剂的药动学参数 品种
作用时间(h)
, 百拇医药 开始
高峰
维持
Lispro
1/12-1/4
1-2
4-5
正规
1/2-1
2-4
6-8
NPH
1-2
, http://www.100md.com
5-7
13-18
慢胰岛素
1-3
4-8
13-20
三、免疫原性
Lispro的结构与RHI有所不同，该差异能否改变免疫原性，从而改变了体内胰岛素抗体状态，尤其能否提高胰岛素抗体的阳性率?为此Fineberg用自身空白消减试验(Self-blank subtraction assay)对以往应用胰岛素的糖尿病患者作了胰岛素特异抗体(ISA)、Lispro特异性抗体(LSA)及交叉性抗体(CRA)估价，结果显示用Lispro治疗前LSA 0-4%阳性，ISA 10%阳性，而CRA 30-50%阳性，改用Lispro 6月后未见ISA，LSA及CRA的阳性率及阳性状态呈显著改变，表明Lispro并未增强免疫原性〔5〕。然而Lahtela〔6〕报道一例用人胰岛素伴发严重胰岛素抵抗的患者，改用Lispro后，经一年随访胰岛素剂量、HbA1c及胰岛素抗体水平均呈显著下降，晨间低血糖反应消失，提示Lispro与人胰岛素分子结构不同，亦可能阻止了Lispro与胰岛素抗体的结合，改善了胰岛素的敏感性，因而认为Lispro可作为免疫原性胰岛素抵抗的治疗。
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四、对胰岛素受体的影响
Jehle〔7〕研究了Lispro和RHI强化治疗对胰岛素受体状态的影响，用分离的单核细胞作竞争性放射性胰岛素结合试验，结果显示Lispro治疗组较RHI治疗组胰岛素结合位点总数显著增加(9 400±2 200 vs 20 300±3 000)，竞争50%胰岛素结合位点所需要胰岛素浓度Lispro组(0.1±0.03mmol/L)显著低于RHI组(0.6±0.2nmol/L)。此外，如用Lispro治疗1型糖尿病，其空腹状态、注射后1小时、5小时单核细胞受体与胰岛素结合的亲和力及容量均与正常对照组内源性胰岛素的状况相近(1小时最低，5小时恢复)，与此相对比的是若用RHI，则胰岛素与单核细胞受体的亲和力及容量在空腹状态就低，并呈持续下降，以5小时为最显著。提示Lispro治疗模仿了生理性胰岛素分泌的作用，亦改善了胰岛素受体的敏感性。但用Lispro和RHI预处理IM-9淋巴母细胞对胰岛素结合的降调节未显示差异。
, 百拇医药 五、临床研究
Lispro与RHI的长时期、随机、多中心研究显示Lispro能改善2型糖尿病患者的餐后2小时血糖，尤其餐前，注射Lispro组较餐前30分钟注射RHI组餐后2小时血糖降低更显著〔8〕。Lispro控制餐后早期血糖的作用已被许多研究证实〔9，10〕，而对餐后晚期血糖的效应报道较少，甚至某些研究始终未能显示Lispro用于糖尿病治疗对总体血糖控制水平(HbA1c)的显著改进，故认为Lispro活性可能逐渐消失而致餐后晚期高血糖。为此，进行了一项前瞻性、随机、单盲研究，在标准餐后(750千卡，美国糖尿病学会推荐)8小时内对代谢指标作了估价，所有患者均接受特慢胰岛素(Ultralente,0.2u/kg)，1组单独使用，另4组在早晨标准餐前随机与下列方案组合：(1)RHI 0.15u/kg;(2)Lispro 0.15u/kg;(3)Lispro 0.1u/kg;(4)Lispro与RHI混合物(1:1)0.15u/kg。结果显示餐后血糖峰值在(2)、(3)、(4)组均较(1)及特慢胰岛素组显著下降，且显示在8小时平均血糖水平在(1)、(2)、(4)组间无显著差异。此外，Lispro组〔(2)、(3)、(4)〕游离胰岛素峰值出现得较早，较高，而(1)组在第8小时平均胰岛素水平仍较高，提示用RHI后持续性高胰岛素血症可能引起部分病例发生餐后晚期低血糖。由于Lispro与特慢胰岛素合用时，餐后8小时降糖作用稳定，若恰当掌握剂量，可改善GHb水平〔11〕。晚近Zinman对30例1型糖尿病患者作了随机双盲交叉试验，与RHI组相比，Lispro组HbA1c水平显著降低，三餐后1小时血糖显著改善，而餐前、晚间及2Am血糖值无明显差异〔12〕。提示Lispro对餐后血糖及HbA1c水平均有显著下降，且不会引起餐后晚期血糖升高。
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六、低血糖反应
如上所述，Lispro对餐后早期血糖具有较强的降低作用，是否引起这一时期低血糖发生率增加，长时期临床试验显示Lispro与RHI有相同的低血糖发生率〔12-14〕，亦有研究显示应用Lispro后低血糖发生率低于RHI〔15，16〕。Berge报道〔17〕用Lispro“标准剂量”(0.15u/kg)治疗1型糖尿病时，在总热量为500千卡而成分不同的三次早餐后3小时低血糖发生多于RHI组，特别在碳水化合物含量较低时。提示Lispro既改善了血糖谱，并未增加低血糖的危险性。但在进餐中碳水化合物含量较低时，应注意调整其剂量。
七、结束语
总之，Lispro在溶液中以单体存在，皮下注射后快速吸收，具有较高的胰岛素峰值，作用时间维持较短，模仿了正常性第一时相胰岛素分泌，同时保持甚至增强了与胰岛素受体结合的亲和力和效能，但未增加低血糖反应的频率，因此，Lispro是糖尿病患者应用胰岛素的较理想的选择。 参 考 文 献
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1 Drejer K. The bioactivity of insulin analogues from in vitro receptor binding to in vivo glucose uptake. Diabetes Metab Rev， 1992,8:259-286.
2 Howey DC, Bowsher RR, Bruelle RL, et al. 〔Lys(B28). Pro(B29)〕-Human insulin: a rapidly absorbed analogue of human insulin. Diabetes， 1994,43:396-402.
3 Torlone E, Fanelli C, Rambotli AM, et al. Pharmacokinetics, pharmacodynetics and insulin analogues. Diabetologia， 1981,12:94-101.
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4 Braak EW, Woodworth JR, Bianchi R, et al. Injection site effects on the pharmacokinetics and glucodynamic of insulin Lispro and regular insulin. Diabetes Care， 1996,19:1437-1440.
5 Fineberg NS, Fineberg SE, Anderson JH, et al. Immunologic effects of insulin Lispro in IDDM and NIDDM patients previously treated with insulin. Diabetes， 1996,45:1750-1754.
6 Lahtela JT, Knik M, Paul, et al. Severe antibody-mediated human insulin resistance: successful treatment with the insulin analog Lispro. Diabetes Care， 1997,23:71-73.
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7 Jehle PM, Fussgaenger FD, Kunze U, et al. The human insulin analog insulin Lispro improves insulin binding on circulating monocytes of intensively treated IDDM patients. J Clin Endocriol Metab， 1996,81:2319-2327.
8 Vignati L, Anderson J, Brunelle R. Efficacy of 〔Lys(B28). Pro(B29)〕 human insulin in a one year global randomized clinical trial. Diabetes， 1994,43(suppl 1):78A.
9 Pampamelli S, Torlone E, Laci C, et al. Improved postprandial metabolic control after subcutaneous injection of a short-acting insulin analog in IDDM of short duration with residual pancreatic B-cell function. Diabetes Care， 1995,18:1452-1459.
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10 Howcy DC, Bowsher RR, Bruncllc RL, et al. 〔Lys(B28). Pro(B29)〕-human: Effect of injection time on postprandial glycemia. Clin Pharmacol Ther， 1995,58:459-469.
11 Burge MR, Watetrs DL, Holcombe JH, et al. Prolonged efficacy of short acting insulin Lispro in combination with human Ultralente in IDDM. J Clin Endocrinol Metab， 1997,82:920-924.
12 Zinman B, Tildesley H, Chiasson JL, et al. Insulin Lispro in CISS: results of a double-blind crossover study. Diabetes， 1997,46:440-443.
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13 Anderson J, Symanowski S, Brunelle. Safety of 〔Lys(B28).Pro(B29)〕 human insulin analog in long-term clinical trial. Diabetes， 1994,43(Suppl 1):614.
14 Carg SK, Carmain JA, Braddy KC, et al. Pre-meal insulin Lispro vs. Humulin R insulin treatment in young subjects with type I diabetes. Diabet Med， 1995,12:1-6.
15 Bastyr EJ, Kostanos J, Vignati L, et al. Insulin Lispro reduces hypoglycemia rate in patients with type 2 diabetes at high risk for hypoglycemia. Diabetes， 1996,45(suppl 1):56A.
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16 Anderson J, Brunelle R, Pfuetzner A, et al. Reduced frequency of hypoglycemia without loss of glycemic control. Diabetes， 1996:45(suppl 1):s46-s49.
17 Berge MR, Castillo KR, Schade DS, et al. Meal composition is a determinant of insulin Lispro induced hypoglycemia in IDDM. Diabetes Care, 1997,20:152-155.
(收稿：1998-04-09), 百拇医药