兔半月板纤维软骨组织缺损的体外修复实验
作者：徐青镭 吴海山 周维江
单位：
关键词：纤维蛋白；半月板修复；培养系统；体外
第二军医大学学报980614 摘要 目的：探讨体外培养条件下半月板组织的修复能力。方法：将纤维蛋白填入兔半月板纤维软骨组织缺损区，体外条件下培养1,2,3,4,8周，组织学及电镜观察纤维软骨细胞在纤维蛋白支架结构中的生长情况。结果：培养1～4周纤维软骨细胞能逐渐长入纤维蛋白支架结构，4至8周发现纤维软骨细胞在其中的生长呈现相对停滞趋势。结论：纤维软骨细胞具备再生修复能力，能够启动半月板组织的修复。
中国图书资料分类法分类号 R683.420.5
In vitro study on the repair of rabbit meniscal fibrocartilagious tissue defect with fibrin In vitro study on the repair of rabbit meniscal fibrocartilagious tissue defect with fibrin
, http://www.100md.com
Xu Qinglei, Wu Haishan, Zhou Weijiang (Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To evaluate the meniscal repair of rabbit knee joint in a specified in vitro culture system. Methods: We observed by light microscopy and electronic microscopy that if the fibrochondrocytes of rabbit knee menisci would migrate into the fibrin scaffold stuffed beforehand into the fibrocartilage tissue defects after 1,2,3,4 and 8 weeks cultivation, respectively. Results: The fibrochondrocytes could grow gradually into the fibrin scaffold during the first 4 weeks of culture. After that the ingrowth of fibrochondrocytes failed to progress further. EM observations showed that no matrix components were synthesized. Conclusion: Under appropriate circumstance and provided proper scaffold the meniscal wound could be repaired.
, http://www.100md.com
Key words fibrin; meniscus repair; culture system, in vitro
半月板是由纤维软骨细胞及以Ⅰ型胶原为主的基质所构成的纤维软骨组织。以往认为，半月板的纤维软骨细胞缺乏固有的再生修复能力，故而导致半月板损伤不能愈合。然而Webber等[1]成功地证明脱离了基质的纤维软骨细胞在体外单层培养的条件下显示出很强的增生分化能力，从而对传统的观点提出了挑战。因此我们设计了在纤维软骨组织的环形缺损中加入纤维蛋白，在体外培养条件下观察纤维软骨细胞能否脱离基质长入纤维蛋白支架结构中，启动并完成纤维软骨组织的再生修复。
1 材料和方法
1.1 材料 纤维蛋白原(纯度约96%，上海其胜生物制品研究所提供)；凝血酶(不含纤溶酶原，Sigma公司)；DMEM培养基(Gibco公司);氯化钙(分析纯，上海金山兴塔化工厂)。
, http://www.100md.com
1.2 半月板标本的采取 新西兰兔(3～4月龄，本校实验动物中心提供)6只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg，空气栓塞法处死。无菌条件下取出双膝半月板，共24个。随机分为实验组5组，对照组1组，每组4个半月板。在超净台上用显微手术器械迅速去除双膝半月板之前后角、有血管区及滑膜组织，仅余纤维软骨组织。用特制的环刀在半月板正中作一直径约2 mm的全厚环形组织缺损。
1.3 纤维蛋白的制备与植入 将无菌的纤维蛋白原的生理盐水溶液与凝血酶在4℃下混匀，使最终每毫升混合液中含纤维蛋白原5 mg、凝血酶10 U、氯化钙3 mg。然后用20 μl的移液管将混合液注入半月板环形组织缺损区内，并迅速将其放入37℃培养箱内5 min，使其凝结。然后取一样品作冷冻切片，证实组织与纤维蛋白的界面保持良好的接触。
1.4 体外培养 将标本从培养箱中取出，放入6孔培养板(每孔截面积9.69 cm2，深0.8 cm)，每孔1个半月板标本，放入10% FBS-DMEM培养液2 ml，置37℃、10% CO2恒温培养箱内培养。培养液每周更换3次，培养板每周更换1次。培养1，2，3，4，8周后分别取出，10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色。取4个组织缺损内未填入纤维蛋白的标本作空白对照，于相同条件下培养8周后取出作石蜡切片，HE染色。培养8周的标本分别取半月板及缺损修复组织作电镜观察。以上实验均重复两次。
, http://www.100md.com
2 结 果
培养1周的组织切片显示(图1A)，在填补于组织缺损内的纤维蛋白表面可见有长梭形的细胞分布，它们彼此相连呈链条样，仅于周边部分有散在的多角形细胞分布；培养2周纤维蛋白表面的长梭形细胞数目增多而形成单层分布，从半月板组织长入纤维蛋白的多角形细胞的长入数目及长入距离均有所增加(图1B)；培养3，4周后，纤维蛋白表面的细胞继续增加而呈多层分布，其形态仍为长梭形，而长入纤维蛋白内部的细胞也渐增多，细胞形态也仍以多角形为主(图1C，D)。
培养8周后，纤维蛋白内部虽也有细胞长入，但其生长情况与培养4周时细胞的增生情况大致相似，电镜观察未见有明显的基质合成(图2B)。
空白对照组中(图3)，由于环形缺损区内未加入纤维蛋白，培养8周未见缺损区内有细胞存在，但在缺损边缘可见自深部基质迁移而出的纤维软骨细胞呈单层排列。
, 百拇医药
图 1 纤维软骨细胞长入纤维蛋白支架结构的情况(HE×100)
Fig 1 The ingrowth of fibrochondrocytes into the fibrin scaffold (HE×100)
A～D：1，2，3，4 weeks of culture， respectively
此外，由所有切片中可以看出在整个体外培养过程中，纤维软骨细胞健康且富有活性，未见细胞坏死，证明该培养系统对细胞生长无毒害作用。
3 讨 论
本实验结果表明，纤维软骨细胞能够作为半月板组织的主质细胞，在具有纤维蛋白支架结构的情况下长入组织缺损区，启动半月板的修复过程，而纤维蛋白作为一种支架结构对长入的细胞未显示有任何的毒害作用。因此半月板损伤的难以修复是因为缺损区内没有可供细胞长入的支架结构，而非纤维软骨细胞缺乏再生能力。这意味着采用促进半月板原位修复的方法代替半月板切除术治疗半月板损伤在临床上是可行的。
, 百拇医药
图 2 正常半月板组织(A，×6 000)与纤维蛋白支架结构(B，×10 000)的电镜观察
Fig 2 The EM observation of rabbit fibrochondrocytes in normal meniscus (A，×6 000) and fibrin scaffold (B，×10 000)
图 3 空白对照组培养8周的组织学观察(HE×40)
Fig 3 Histology of meniscus with unfilled defect
after 8 weeks of culture (HE×40)
纤维软骨细胞的体外培养系统很多，它们对于纤维软骨细胞的特性研究各有侧重[1，2]。本实验采用的培养方法并未将纤维软骨细胞从基质中分离出来，而是将纤维软骨组织块放入培养液中观察细胞生长情况，其价值在于：第一，可以通过在培养液中加入不同的细胞因子而有针对性地观察其对纤维软骨细胞的增生分化特性的影响；第二，通过改变填入缺损区的材料可以评价该材料是否可以用作支架结构来修复半月板组织的损伤。这对我们在后续工作中采用组织工程学的方法修复、重建半月板有着重要的意义。
, 百拇医药
然而，通过观察对比我们也发现，纤维软骨细胞在长入纤维蛋白支架结构4周后，其增生分化呈现相对停滞的趋势。电镜观察显示，培养8周的纤维蛋白支架结构中的长入细胞未见基质合成，这意味着此修复过程的最终结局可能是瘢痕修复而非纤维软骨修复组织。可能原因为：(1) 我们的体外培养系统排除了细胞因子的影响。体内环境下关节滑膜A型细胞能够分泌转化生长因子β(TGF-β)等多种细胞因子，已证实TGF-β能显著地促进成骨细胞[3]及软骨细胞[4]的增生分化；(2)纤维蛋白支架结构未能提供最适合纤维软骨细胞生长的微环境。Ⅰ型胶原和糖胺聚糖占据了80%以上的半月板组织干质量[5]，因此我们推测选用胶原、糖胺聚糖作为支架结构可能提供更适合纤维软骨细胞生长的微环境。
据此，我们认为，进一步研究半月板的修复、重建应探讨胶原、糖胺聚糖作为支架结构的可能性，同时细胞因子的引入也是十分必要的。
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Webber RJ, Harris MG, Hough AJ Jr. Cell culture of rabbit meniscal fibrochondrocytes: proliferation and synthetic response to growth factors and ascorbate. J Orthop Res, 1985, 3(1): 36
2 Webber RJ. In vitro culture of meniscal tissue. Clin Orthop, 1990, 252(3): 114
3 Sumner DR, Turner TM, Purchio AF, et al. Enhancement of bone ingrowth by TGF-β, osteoprogenitor, osteoblast. J Bone Joint Surg, 1995, 77A(8): 1135
, 百拇医药
4 Miura Y, Fitzsimmons JS, Commisso CN, et al. Enhancement of periosteal chondrogenesis in vitro: dose response for TGF-β1. Clin Orthop, 1994, 301(4): 271
5 McDevitt CA, Webber RJ. The ultrastructure and biochemistry of meniscal cartilage. Clin Orthop, 1990, 252(3): 8
(1998-03-27收稿，1998-08-06修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：纤维蛋白；半月板修复；培养系统；体外
第二军医大学学报980614 摘要 目的：探讨体外培养条件下半月板组织的修复能力。方法：将纤维蛋白填入兔半月板纤维软骨组织缺损区，体外条件下培养1,2,3,4,8周，组织学及电镜观察纤维软骨细胞在纤维蛋白支架结构中的生长情况。结果：培养1～4周纤维软骨细胞能逐渐长入纤维蛋白支架结构，4至8周发现纤维软骨细胞在其中的生长呈现相对停滞趋势。结论：纤维软骨细胞具备再生修复能力，能够启动半月板组织的修复。
中国图书资料分类法分类号 R683.420.5
In vitro study on the repair of rabbit meniscal fibrocartilagious tissue defect with fibrin In vitro study on the repair of rabbit meniscal fibrocartilagious tissue defect with fibrin
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Xu Qinglei, Wu Haishan, Zhou Weijiang (Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To evaluate the meniscal repair of rabbit knee joint in a specified in vitro culture system. Methods: We observed by light microscopy and electronic microscopy that if the fibrochondrocytes of rabbit knee menisci would migrate into the fibrin scaffold stuffed beforehand into the fibrocartilage tissue defects after 1,2,3,4 and 8 weeks cultivation, respectively. Results: The fibrochondrocytes could grow gradually into the fibrin scaffold during the first 4 weeks of culture. After that the ingrowth of fibrochondrocytes failed to progress further. EM observations showed that no matrix components were synthesized. Conclusion: Under appropriate circumstance and provided proper scaffold the meniscal wound could be repaired.
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Key words fibrin; meniscus repair; culture system, in vitro
半月板是由纤维软骨细胞及以Ⅰ型胶原为主的基质所构成的纤维软骨组织。以往认为，半月板的纤维软骨细胞缺乏固有的再生修复能力，故而导致半月板损伤不能愈合。然而Webber等[1]成功地证明脱离了基质的纤维软骨细胞在体外单层培养的条件下显示出很强的增生分化能力，从而对传统的观点提出了挑战。因此我们设计了在纤维软骨组织的环形缺损中加入纤维蛋白，在体外培养条件下观察纤维软骨细胞能否脱离基质长入纤维蛋白支架结构中，启动并完成纤维软骨组织的再生修复。
1 材料和方法
1.1 材料 纤维蛋白原(纯度约96%，上海其胜生物制品研究所提供)；凝血酶(不含纤溶酶原，Sigma公司)；DMEM培养基(Gibco公司);氯化钙(分析纯，上海金山兴塔化工厂)。
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1.2 半月板标本的采取 新西兰兔(3～4月龄，本校实验动物中心提供)6只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg，空气栓塞法处死。无菌条件下取出双膝半月板，共24个。随机分为实验组5组，对照组1组，每组4个半月板。在超净台上用显微手术器械迅速去除双膝半月板之前后角、有血管区及滑膜组织，仅余纤维软骨组织。用特制的环刀在半月板正中作一直径约2 mm的全厚环形组织缺损。
1.3 纤维蛋白的制备与植入 将无菌的纤维蛋白原的生理盐水溶液与凝血酶在4℃下混匀，使最终每毫升混合液中含纤维蛋白原5 mg、凝血酶10 U、氯化钙3 mg。然后用20 μl的移液管将混合液注入半月板环形组织缺损区内，并迅速将其放入37℃培养箱内5 min，使其凝结。然后取一样品作冷冻切片，证实组织与纤维蛋白的界面保持良好的接触。
1.4 体外培养 将标本从培养箱中取出，放入6孔培养板(每孔截面积9.69 cm2，深0.8 cm)，每孔1个半月板标本，放入10% FBS-DMEM培养液2 ml，置37℃、10% CO2恒温培养箱内培养。培养液每周更换3次，培养板每周更换1次。培养1，2，3，4，8周后分别取出，10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色。取4个组织缺损内未填入纤维蛋白的标本作空白对照，于相同条件下培养8周后取出作石蜡切片，HE染色。培养8周的标本分别取半月板及缺损修复组织作电镜观察。以上实验均重复两次。
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2 结 果
培养1周的组织切片显示(图1A)，在填补于组织缺损内的纤维蛋白表面可见有长梭形的细胞分布，它们彼此相连呈链条样，仅于周边部分有散在的多角形细胞分布；培养2周纤维蛋白表面的长梭形细胞数目增多而形成单层分布，从半月板组织长入纤维蛋白的多角形细胞的长入数目及长入距离均有所增加(图1B)；培养3，4周后，纤维蛋白表面的细胞继续增加而呈多层分布，其形态仍为长梭形，而长入纤维蛋白内部的细胞也渐增多，细胞形态也仍以多角形为主(图1C，D)。
培养8周后，纤维蛋白内部虽也有细胞长入，但其生长情况与培养4周时细胞的增生情况大致相似，电镜观察未见有明显的基质合成(图2B)。
空白对照组中(图3)，由于环形缺损区内未加入纤维蛋白，培养8周未见缺损区内有细胞存在，但在缺损边缘可见自深部基质迁移而出的纤维软骨细胞呈单层排列。
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图 1 纤维软骨细胞长入纤维蛋白支架结构的情况(HE×100)
Fig 1 The ingrowth of fibrochondrocytes into the fibrin scaffold (HE×100)
A～D：1，2，3，4 weeks of culture， respectively
此外，由所有切片中可以看出在整个体外培养过程中，纤维软骨细胞健康且富有活性，未见细胞坏死，证明该培养系统对细胞生长无毒害作用。
3 讨 论
本实验结果表明，纤维软骨细胞能够作为半月板组织的主质细胞，在具有纤维蛋白支架结构的情况下长入组织缺损区，启动半月板的修复过程，而纤维蛋白作为一种支架结构对长入的细胞未显示有任何的毒害作用。因此半月板损伤的难以修复是因为缺损区内没有可供细胞长入的支架结构，而非纤维软骨细胞缺乏再生能力。这意味着采用促进半月板原位修复的方法代替半月板切除术治疗半月板损伤在临床上是可行的。
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图 2 正常半月板组织(A，×6 000)与纤维蛋白支架结构(B，×10 000)的电镜观察
Fig 2 The EM observation of rabbit fibrochondrocytes in normal meniscus (A，×6 000) and fibrin scaffold (B，×10 000)
图 3 空白对照组培养8周的组织学观察(HE×40)
Fig 3 Histology of meniscus with unfilled defect
after 8 weeks of culture (HE×40)
纤维软骨细胞的体外培养系统很多，它们对于纤维软骨细胞的特性研究各有侧重[1，2]。本实验采用的培养方法并未将纤维软骨细胞从基质中分离出来，而是将纤维软骨组织块放入培养液中观察细胞生长情况，其价值在于：第一，可以通过在培养液中加入不同的细胞因子而有针对性地观察其对纤维软骨细胞的增生分化特性的影响；第二，通过改变填入缺损区的材料可以评价该材料是否可以用作支架结构来修复半月板组织的损伤。这对我们在后续工作中采用组织工程学的方法修复、重建半月板有着重要的意义。
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然而，通过观察对比我们也发现，纤维软骨细胞在长入纤维蛋白支架结构4周后，其增生分化呈现相对停滞的趋势。电镜观察显示，培养8周的纤维蛋白支架结构中的长入细胞未见基质合成，这意味着此修复过程的最终结局可能是瘢痕修复而非纤维软骨修复组织。可能原因为：(1) 我们的体外培养系统排除了细胞因子的影响。体内环境下关节滑膜A型细胞能够分泌转化生长因子β(TGF-β)等多种细胞因子，已证实TGF-β能显著地促进成骨细胞[3]及软骨细胞[4]的增生分化；(2)纤维蛋白支架结构未能提供最适合纤维软骨细胞生长的微环境。Ⅰ型胶原和糖胺聚糖占据了80%以上的半月板组织干质量[5]，因此我们推测选用胶原、糖胺聚糖作为支架结构可能提供更适合纤维软骨细胞生长的微环境。
据此，我们认为，进一步研究半月板的修复、重建应探讨胶原、糖胺聚糖作为支架结构的可能性，同时细胞因子的引入也是十分必要的。
参 考 文 献
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1 Webber RJ, Harris MG, Hough AJ Jr. Cell culture of rabbit meniscal fibrochondrocytes: proliferation and synthetic response to growth factors and ascorbate. J Orthop Res, 1985, 3(1): 36
2 Webber RJ. In vitro culture of meniscal tissue. Clin Orthop, 1990, 252(3): 114
3 Sumner DR, Turner TM, Purchio AF, et al. Enhancement of bone ingrowth by TGF-β, osteoprogenitor, osteoblast. J Bone Joint Surg, 1995, 77A(8): 1135
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4 Miura Y, Fitzsimmons JS, Commisso CN, et al. Enhancement of periosteal chondrogenesis in vitro: dose response for TGF-β1. Clin Orthop, 1994, 301(4): 271
5 McDevitt CA, Webber RJ. The ultrastructure and biochemistry of meniscal cartilage. Clin Orthop, 1990, 252(3): 8
(1998-03-27收稿，1998-08-06修回), http://www.100md.com