人肝癌细胞与自体激活B淋巴细胞融合制备肿瘤疫苗
作者：刘彦君 王 皓 卫立辛 沈 锋 谢天培 钱卫珠 刘小萍 周 倩 吴孟超 郭亚军
单位：
关键词：肿瘤疫苗；肝肿瘤；B淋巴细胞；细胞融合
第二军医大学学报980603 摘要 目的：观察3例人肝癌组织细胞与其自体激活B淋巴细胞融合后融合细胞表面分子GP75和免疫相关分子MHCⅠ、MHCⅡ和B7的表达情况，以便为肿瘤疫苗向临床试验过渡提供人体细胞的实验依据。方法：应用聚乙二醇(PEG)法将人肝癌细胞与其自体激活B淋巴细胞融合，利用流式细胞仪观察融合细胞表面分子GP75和免疫相关分子MHCⅠ、MHCⅡ和B7的表达情况。结果：融合细胞表面不仅表达肝癌细胞表面的GP75分子，还可表达共刺激分子B7及MHCⅠ、MHCⅡ。结论：人肝癌细胞与其自体激活的B淋巴细胞融合后的杂交瘤细胞既能表达肝癌细胞表面分子GP75，又可表达共刺激信号分子，从而为这一形式的肿瘤疫苗向临床试验过渡提供了实验依据。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R735.7
Human tumor vaccine generated by fusion of hepatocellular carcinoma cells with activated B cells
Liu Yanjun, Wang Hao, Wei Lixin, Shen Feng, Xie Tianpei, Qian Weizhu, Liu Xiaoping, Zhou Qian, Wu Mengchao, Guo Yajun (Tumor Immunology and Gene Therapy Center, Eastern Hospital of Hepatobiliary Surgery, Second Military Medical University, Shanghai, 200438)
Abstract Objective: To observe the expression of the GP75, MHCⅠ, MHCⅡ and B7 molecules on the surface of hybrid cells generated by fusion of human hepatocellular carcinoma cells (HCC) with auto-logous activated B cells of 3 cases of HCC patients. Methods: Human hepatocellular carcinoma cells were fused with activated B cells by treatment with polyethylene glycol (PEG), and the expression of GP75, MHCⅠ, MHCⅡ and B7 molecules on the surface of hybrid cells was determined by flow cytometry. Results: The hybrid cells were able to express not only GP75 molecules of human HCC cells, but also MHCⅠ， MHCⅡ and B7 of B cells. Conclusion: The above results indicated that this kind of human fusion cells could be used as a positive and specific immune therapy in clinical trials against HCC someday.
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Key words tumor vaccine; liver neoplasms; B lymphocyte; cell fusion
肿瘤细胞逃避机体免疫监控的一个重要原因是肿瘤细胞不表达或低表达刺激机体免疫系统所需的表面分子，如主要组织相容复合物(MHC)分子表达下降和共刺激分子如B7等表达缺陷[1,2]。本实验室首次将化学致癌物诱导的Wistar大鼠BERH-2肝癌细胞与激活的B细胞融合，发现这种杂交瘤细胞可有效刺激机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应，既能治疗已形成的肝癌，又能使正常的同系大鼠获得预防此种肝癌的免疫力[3]。因此，本实验拟将3例人肝癌组织细胞与其自体B淋巴细胞融合，检测融合细胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、B7和肝癌细胞表面抗原分子GP75[4]的表达情况，以便为肿瘤疫苗尽早向临床试验过渡提供实验依据。
1 材料和方法
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1.1 材料 3例肝癌及对应脾组织均取自上海第二军医大学东方肝胆外科医院；IV胶原酶、透明质酸酶、DNA酶、台盼蓝液及RPMI 1640培养液均购自Gibco公司；抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗B7、抗MHCⅠ、抗MHCⅡ及抗肝癌细胞表面GP75单克隆抗体由本实验室的合作单位美国圣迭戈Sidney Kimmel肿瘤中心提供；FITC标记的羊抗鼠二抗、PE标记的羊抗鼠二抗购自Becton Dickinson公司；人AB型血清购自上海市中心血站。流式细胞仪(FACScan)为Becton Dickinson公司产品。
1.2 肝癌细胞悬液的制备 从联合肝癌、脾切除的手术标本中取15 g肝癌组织，剪成约3 mm3的小块，用100 ml含0.1% IV胶原酶、0.01%透明质酸酶、0.002% DNA酶的RPMI 1640培养液于37℃消化1.5 h；用吸管轻轻吹打使组织分散为单细胞及细胞团悬液，过200目不锈钢筛网，过滤后的细胞悬液离心200 g×5 min；弃上清，再以20 ml RPMI 1640洗涤一遍，离心200 g×5 min；弃上清，悬于15% AB型血清的RPMI 1640培养液中。0.1%台盼蓝染色表明3例肝癌标本制备的细胞悬液中活细胞比例均>90%；将肝癌细胞悬液细胞浓度调整为1×106个/ml，悬于15% AB型血清的RPMI 1640培养液中，于37℃，5% CO2孵箱中培养。
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1.3 脾细胞悬液的制备 从联合肝癌、脾切除的手术标本中取15 g脾组织，均剪成3 mm3左右的小块；用RPMI 1640培养液充分洗涤3遍，去除残存的血凝块及红细胞；脾组织在200目不锈钢筛网上轻轻加压、研磨，并用RPMI 1640冲洗，收集滤过的细胞悬液于50 ml离心管中离心200 g×5 min；弃上清，将离心管中的细胞沉淀震散，加入18 ml灭菌蒸馏水，轻轻震摇30s(以破坏红细胞)；随即加入2 ml 10×PBS(pH7.2)，然后加入30 ml RPMI 1640，洗涤，离心200 g×5 min；弃上清，将细胞重悬于50 ml RPMI 1640培养液中。0.1%台盼蓝染色表明制备的3例脾细胞悬液中活细胞比例均>95%，将脾细胞悬液细胞浓度调整为1.8×107个/ml，悬于15% AB型血清的RPMI 1640培养液中，于37℃，5% CO2孵箱中培养。
1.4 B淋巴细胞的分离纯化 往50 ml脾细胞悬液中加入抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体，终浓度各为0.2 μg/ml，冰浴30 min；离心200 g×5 min，弃上清，再用50 ml RPMI 1640培养液洗涤，离心200 g×5 min，弃上清，去除未结合抗体。加入50 ml RPMI 1640培养液和2.5 ml豚鼠血清(补体)，37℃水浴45 min；离心200 g×5 min，弃上清；用20 ml RPMI 1640培养液洗涤2次，离心200 g×5 min，细胞计数为3.6×108个；加入72 ml 10%人AB型血清的RPMI 1640培养液，取200 μl分别进行CD3、MHCⅡ染色，流式细胞仪分析。
, 百拇医药
1.5 B淋巴细胞的激活 预先用抗MHCⅡ抗体包被3块6孔板，抗体以1 μg/ml溶于碳酸盐包被液(pH9.6)中，每孔加2 ml，封口膜包裹后置4℃过夜；然后用20 ml PBS洗涤2次；将细胞悬液全部加入(细胞密度为5×106个/ml)，再加IL-4于细胞悬液中，终浓度为2 ng/ml；置于37℃，5% CO2孵箱中培养24 h。
1.6 融合细胞的表型分析 分别用抗GP75，B7，MHCⅠ，MHCⅡ的单克隆抗体标记肝癌细胞和杂交瘤细胞，洗涤后再用FITC标记的二抗染色；固定后利用流式细胞仪检测肝癌细胞与激活B细胞融合后GP75，B7，MHCⅠ，MHCⅡ的表达情况。
2 结 果
2.1 流式细胞仪分析结果 从3例脾细胞悬液中各取100 μl行CD3染色，从抗体、补体处理的脾细胞悬液中各取200 μl分别行CD3和MHCⅡ染色，然后用流式细胞仪分析。阴性对照是未加任何一抗的脾细胞悬液(图1A)。结果显示用抗T细胞及补体处理后留下的细胞主要是B细胞(图1B，C，D)。
, 百拇医药
2.2 融合细胞的表型分析 利用流式细胞仪检测肝癌细胞与激活B细胞融合后GP75，B7，MHCⅠ，MHCⅡ的表达情况。图2表明融合细胞表面既能表达人肝癌细胞表面GP75分子[4]，又能较高水平表达B7，MHCⅠ和MHCⅡ分子。
3 讨 论
近年来肿瘤免疫学的进展表明，肿瘤细胞逃避机体免疫监控的主要机制之一是缺乏激发宿主免疫反应所必需的信号系统，如肿瘤细胞的MHC分子表达水平较低，缺乏激活T细胞所需的共刺激分子B7及细胞间粘附分子ICAM等。针对这些变化，目前有许多方法可提高肿瘤细胞的免疫原性，如向肿瘤细胞转入其缺乏但在T淋巴细胞激活中又是必需的分子基因B7，MHCⅡ基因等，或向肿瘤细胞转入各种能增强T淋巴细胞免疫的各种细胞因子基因如粒单-集落刺激生长因子(GM-CSF)，IL-2基因等，然而由于不同个体肿瘤细胞所缺乏的激活T细胞所需的共刺激分子有所不同，上述措施在应用上有明显的局限性，适用较窄。我们先前的实验在理论上有效地解决了这一难题，激活的B细胞是有效的抗原提呈细胞，除表达高水平的MHCⅡ分子外，还表达其他高水平的共刺激分子，将大鼠的激活B细胞与其肝癌细胞融合后，融合细胞可高水平表达激活T细胞所需的多种共刺激因子，从而有效激活T细胞免疫反应，我们曾将Wistar大鼠BERH-2肝癌
, 百拇医药
图 1 B细胞分离纯化过程流式细胞仪分析
Fig 1 Analysis of B cells before or after isolation and purification in a FACScan
A：Negative control; B：Spleen cells stained with anti-CD3 FITC; C：After anti-CD3, CD4, CD8 and complement treatment stained with anti-CD3; D：After anti-CD3, CD4, CD8 and complement treatment stained with anti-MHCⅡ
, 百拇医药
图 2 肝癌细胞与自体激活B细胞的融合细胞表型分析
Fig 2 Analysis of phenotype of fused cells of hepatocellular carcinoma cells with autologous activated B cells
A: Hepatocellular carcinoma cells; B: Activated B cells; C: Fused cells of hepatocellular carcinoma cells with activated B cells
细胞与其激活B细胞融合后接种Wistar大鼠，发现它具有预防和治疗BERH-2肝癌的作用[3]，这大大拓宽了其作为肿瘤疫苗的应用范围。本实验将3例人肝癌组织细胞与其自体B淋巴细胞融合，发现此种融合细胞不仅仍可表达肝癌细胞表面分子GP75，还可表达激活T细胞免疫所需的共刺激因子MHCⅠ，MHCⅡ和B7，从而为这一形式的肿瘤疫苗向临床试验过渡提供了实验依据。
, 百拇医药
参 考 文 献
1
KE, I, Chen L. Can co-stimulated tumor immunity be therapeutically efficacious? Immunol Rev, 1995,145(1):123
2 Chen L, Linsley PS, KE. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today, 1993,14(10):483
3 Guo YJ, Wu MC, Chen H, et al. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994,263(5146):518
4 Guo YJ, Che XY, Shen F, et al. Effective tumor vaccines generated by in vitro modification of tumor cells with cytokines and bispecific monoclonal antibodies. Nature Med, 1997,3(4):451
(1998-10-05收稿， 1998-11-30修回)
, 百拇医药
单位：
关键词：肿瘤疫苗；肝肿瘤；B淋巴细胞；细胞融合
第二军医大学学报980603 摘要 目的：观察3例人肝癌组织细胞与其自体激活B淋巴细胞融合后融合细胞表面分子GP75和免疫相关分子MHCⅠ、MHCⅡ和B7的表达情况，以便为肿瘤疫苗向临床试验过渡提供人体细胞的实验依据。方法：应用聚乙二醇(PEG)法将人肝癌细胞与其自体激活B淋巴细胞融合，利用流式细胞仪观察融合细胞表面分子GP75和免疫相关分子MHCⅠ、MHCⅡ和B7的表达情况。结果：融合细胞表面不仅表达肝癌细胞表面的GP75分子，还可表达共刺激分子B7及MHCⅠ、MHCⅡ。结论：人肝癌细胞与其自体激活的B淋巴细胞融合后的杂交瘤细胞既能表达肝癌细胞表面分子GP75，又可表达共刺激信号分子，从而为这一形式的肿瘤疫苗向临床试验过渡提供了实验依据。
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中国图书资料分类法分类号 R735.7
Human tumor vaccine generated by fusion of hepatocellular carcinoma cells with activated B cells
Liu Yanjun, Wang Hao, Wei Lixin, Shen Feng, Xie Tianpei, Qian Weizhu, Liu Xiaoping, Zhou Qian, Wu Mengchao, Guo Yajun (Tumor Immunology and Gene Therapy Center, Eastern Hospital of Hepatobiliary Surgery, Second Military Medical University, Shanghai, 200438)
Abstract Objective: To observe the expression of the GP75, MHCⅠ, MHCⅡ and B7 molecules on the surface of hybrid cells generated by fusion of human hepatocellular carcinoma cells (HCC) with auto-logous activated B cells of 3 cases of HCC patients. Methods: Human hepatocellular carcinoma cells were fused with activated B cells by treatment with polyethylene glycol (PEG), and the expression of GP75, MHCⅠ, MHCⅡ and B7 molecules on the surface of hybrid cells was determined by flow cytometry. Results: The hybrid cells were able to express not only GP75 molecules of human HCC cells, but also MHCⅠ， MHCⅡ and B7 of B cells. Conclusion: The above results indicated that this kind of human fusion cells could be used as a positive and specific immune therapy in clinical trials against HCC someday.
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Key words tumor vaccine; liver neoplasms; B lymphocyte; cell fusion
肿瘤细胞逃避机体免疫监控的一个重要原因是肿瘤细胞不表达或低表达刺激机体免疫系统所需的表面分子，如主要组织相容复合物(MHC)分子表达下降和共刺激分子如B7等表达缺陷[1,2]。本实验室首次将化学致癌物诱导的Wistar大鼠BERH-2肝癌细胞与激活的B细胞融合，发现这种杂交瘤细胞可有效刺激机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应，既能治疗已形成的肝癌，又能使正常的同系大鼠获得预防此种肝癌的免疫力[3]。因此，本实验拟将3例人肝癌组织细胞与其自体B淋巴细胞融合，检测融合细胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、B7和肝癌细胞表面抗原分子GP75[4]的表达情况，以便为肿瘤疫苗尽早向临床试验过渡提供实验依据。
1 材料和方法
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1.1 材料 3例肝癌及对应脾组织均取自上海第二军医大学东方肝胆外科医院；IV胶原酶、透明质酸酶、DNA酶、台盼蓝液及RPMI 1640培养液均购自Gibco公司；抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗B7、抗MHCⅠ、抗MHCⅡ及抗肝癌细胞表面GP75单克隆抗体由本实验室的合作单位美国圣迭戈Sidney Kimmel肿瘤中心提供；FITC标记的羊抗鼠二抗、PE标记的羊抗鼠二抗购自Becton Dickinson公司；人AB型血清购自上海市中心血站。流式细胞仪(FACScan)为Becton Dickinson公司产品。
1.2 肝癌细胞悬液的制备 从联合肝癌、脾切除的手术标本中取15 g肝癌组织，剪成约3 mm3的小块，用100 ml含0.1% IV胶原酶、0.01%透明质酸酶、0.002% DNA酶的RPMI 1640培养液于37℃消化1.5 h；用吸管轻轻吹打使组织分散为单细胞及细胞团悬液，过200目不锈钢筛网，过滤后的细胞悬液离心200 g×5 min；弃上清，再以20 ml RPMI 1640洗涤一遍，离心200 g×5 min；弃上清，悬于15% AB型血清的RPMI 1640培养液中。0.1%台盼蓝染色表明3例肝癌标本制备的细胞悬液中活细胞比例均>90%；将肝癌细胞悬液细胞浓度调整为1×106个/ml，悬于15% AB型血清的RPMI 1640培养液中，于37℃，5% CO2孵箱中培养。
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1.3 脾细胞悬液的制备 从联合肝癌、脾切除的手术标本中取15 g脾组织，均剪成3 mm3左右的小块；用RPMI 1640培养液充分洗涤3遍，去除残存的血凝块及红细胞；脾组织在200目不锈钢筛网上轻轻加压、研磨，并用RPMI 1640冲洗，收集滤过的细胞悬液于50 ml离心管中离心200 g×5 min；弃上清，将离心管中的细胞沉淀震散，加入18 ml灭菌蒸馏水，轻轻震摇30s(以破坏红细胞)；随即加入2 ml 10×PBS(pH7.2)，然后加入30 ml RPMI 1640，洗涤，离心200 g×5 min；弃上清，将细胞重悬于50 ml RPMI 1640培养液中。0.1%台盼蓝染色表明制备的3例脾细胞悬液中活细胞比例均>95%，将脾细胞悬液细胞浓度调整为1.8×107个/ml，悬于15% AB型血清的RPMI 1640培养液中，于37℃，5% CO2孵箱中培养。
1.4 B淋巴细胞的分离纯化 往50 ml脾细胞悬液中加入抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体，终浓度各为0.2 μg/ml，冰浴30 min；离心200 g×5 min，弃上清，再用50 ml RPMI 1640培养液洗涤，离心200 g×5 min，弃上清，去除未结合抗体。加入50 ml RPMI 1640培养液和2.5 ml豚鼠血清(补体)，37℃水浴45 min；离心200 g×5 min，弃上清；用20 ml RPMI 1640培养液洗涤2次，离心200 g×5 min，细胞计数为3.6×108个；加入72 ml 10%人AB型血清的RPMI 1640培养液，取200 μl分别进行CD3、MHCⅡ染色，流式细胞仪分析。
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1.5 B淋巴细胞的激活 预先用抗MHCⅡ抗体包被3块6孔板，抗体以1 μg/ml溶于碳酸盐包被液(pH9.6)中，每孔加2 ml，封口膜包裹后置4℃过夜；然后用20 ml PBS洗涤2次；将细胞悬液全部加入(细胞密度为5×106个/ml)，再加IL-4于细胞悬液中，终浓度为2 ng/ml；置于37℃，5% CO2孵箱中培养24 h。
1.6 融合细胞的表型分析 分别用抗GP75，B7，MHCⅠ，MHCⅡ的单克隆抗体标记肝癌细胞和杂交瘤细胞，洗涤后再用FITC标记的二抗染色；固定后利用流式细胞仪检测肝癌细胞与激活B细胞融合后GP75，B7，MHCⅠ，MHCⅡ的表达情况。
2 结 果
2.1 流式细胞仪分析结果 从3例脾细胞悬液中各取100 μl行CD3染色，从抗体、补体处理的脾细胞悬液中各取200 μl分别行CD3和MHCⅡ染色，然后用流式细胞仪分析。阴性对照是未加任何一抗的脾细胞悬液(图1A)。结果显示用抗T细胞及补体处理后留下的细胞主要是B细胞(图1B，C，D)。
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2.2 融合细胞的表型分析 利用流式细胞仪检测肝癌细胞与激活B细胞融合后GP75，B7，MHCⅠ，MHCⅡ的表达情况。图2表明融合细胞表面既能表达人肝癌细胞表面GP75分子[4]，又能较高水平表达B7，MHCⅠ和MHCⅡ分子。
3 讨 论
近年来肿瘤免疫学的进展表明，肿瘤细胞逃避机体免疫监控的主要机制之一是缺乏激发宿主免疫反应所必需的信号系统，如肿瘤细胞的MHC分子表达水平较低，缺乏激活T细胞所需的共刺激分子B7及细胞间粘附分子ICAM等。针对这些变化，目前有许多方法可提高肿瘤细胞的免疫原性，如向肿瘤细胞转入其缺乏但在T淋巴细胞激活中又是必需的分子基因B7，MHCⅡ基因等，或向肿瘤细胞转入各种能增强T淋巴细胞免疫的各种细胞因子基因如粒单-集落刺激生长因子(GM-CSF)，IL-2基因等，然而由于不同个体肿瘤细胞所缺乏的激活T细胞所需的共刺激分子有所不同，上述措施在应用上有明显的局限性，适用较窄。我们先前的实验在理论上有效地解决了这一难题，激活的B细胞是有效的抗原提呈细胞，除表达高水平的MHCⅡ分子外，还表达其他高水平的共刺激分子，将大鼠的激活B细胞与其肝癌细胞融合后，融合细胞可高水平表达激活T细胞所需的多种共刺激因子，从而有效激活T细胞免疫反应，我们曾将Wistar大鼠BERH-2肝癌
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图 1 B细胞分离纯化过程流式细胞仪分析
Fig 1 Analysis of B cells before or after isolation and purification in a FACScan
A：Negative control; B：Spleen cells stained with anti-CD3 FITC; C：After anti-CD3, CD4, CD8 and complement treatment stained with anti-CD3; D：After anti-CD3, CD4, CD8 and complement treatment stained with anti-MHCⅡ
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图 2 肝癌细胞与自体激活B细胞的融合细胞表型分析
Fig 2 Analysis of phenotype of fused cells of hepatocellular carcinoma cells with autologous activated B cells
A: Hepatocellular carcinoma cells; B: Activated B cells; C: Fused cells of hepatocellular carcinoma cells with activated B cells
细胞与其激活B细胞融合后接种Wistar大鼠，发现它具有预防和治疗BERH-2肝癌的作用[3]，这大大拓宽了其作为肿瘤疫苗的应用范围。本实验将3例人肝癌组织细胞与其自体B淋巴细胞融合，发现此种融合细胞不仅仍可表达肝癌细胞表面分子GP75，还可表达激活T细胞免疫所需的共刺激因子MHCⅠ，MHCⅡ和B7，从而为这一形式的肿瘤疫苗向临床试验过渡提供了实验依据。
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参 考 文 献
1
KE, I, Chen L. Can co-stimulated tumor immunity be therapeutically efficacious? Immunol Rev, 1995,145(1):1232 Chen L, Linsley PS,
KE. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today, 1993,14(10):4833 Guo YJ, Wu MC, Chen H, et al. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994,263(5146):518
4 Guo YJ, Che XY, Shen F, et al. Effective tumor vaccines generated by in vitro modification of tumor cells with cytokines and bispecific monoclonal antibodies. Nature Med, 1997,3(4):451
(1998-10-05收稿， 1998-11-30修回)
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