氚标记交联壳多糖在大鼠体内的吸收
作者：陈爱民 侯春林 吴德林△ 包聚良 苟三怀
单位：
关键词：壳多糖；氚
第二军医大学学报980633 壳多糖是一种来源丰富的天然高分子多聚糖,也是一种无毒性、生物相容性极好、体内可降解吸收的生物材料[1],并具有抑菌、提高机体免疫机能、缓解骨感染的作用[2]，其在医学上的应用前景广阔。近几年来,壳多糖作为缓释制剂的研究受到重视[3]。研究证实，交联壳多糖是一种良好的可吸收性植入性局部药物释放系统的载体[4]，本研究采用氚标记法测定生物材料壳多糖的体内吸收率。
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠36只，雌雄不拘，体质量200～220 g， 由本校实验动物中心提供。壳多糖由上海其胜生物材料技术研究所提供。冰醋酸,36%甲醛，甲酸， 过氧化氢，闪烁液(二甲苯 666 ml， PPO 4 g + Troton X-1000 333 ml，POPOP 0.2 g)，均购自上海化学试剂商店。FJ-2105液闪仪：西安262厂生产。模具 40孔,每孔直径0.6 cm,长度1.0 cm。
, 百拇医药
1.2 壳多糖的标记 采用紫外线激活氚原子法标记壳多糖 (由中国科学院上海原子能研究所完成)。 标记参数： 固体粉末； 比活性： 3 098 750 Bq/mg; 放化纯度>90%。 取标记的壳多糖固体粉末， 加入 1 ml 4% 的醋酸溶液中， 混匀待用。
1.3 含氚标记的壳多糖棒制备 取160 mg壳多糖,加入含15 ml 2%醋酸溶液烧杯中,混合,摇匀。在此壳多糖溶液中小心加入 1 ml 3H标记的壳多糖溶液，充分搅拌混匀。然后再在200 r/min搅拌下逐滴加入36%甲醛2 ml,10 min后灌入模具,静置30 min,脱模,乙醇脱水12 h。室温下自然蒸干制得 3H 标记干性壳多糖棒状样本40粒。密封后60Co消毒,4℃下存放待用。
1.4 壳多糖棒植入方法 每只动物按24 mg/kg戊巴比妥经腹腔注射麻醉后仰卧位,固定，取右胫骨结节为中心作内侧纵形切口,切开皮肤皮下骨膜, 以胫骨结节为中心点，用直径2 mm 克氏针垂直于胫骨干骺端钻一小孔，深达3 mm。植入一颗壳多糖样本，缝合骨膜及各层组织。
, 百拇医药
1.5 样品的收集和制备 按手术即刻及术后1,2,3,4,5,7,9,11,13,15个月各时间点处死动物,取出右侧胫骨, 以胫骨结节为中心点，在中心点两侧共0.3 cm宽度内,取下圆柱形干骺端，再用尖嘴咬骨钳修剪外周骨皮，至称量为170 mg骨块为止。-20℃存放待制备。样品制备方法：将骨样品置入含0.8 ml 甲酸的消化试管中，再滴入 2 滴过氧化氢，在80℃下消化2 h，使骨组织和样本完全消化，加水至2 ml。然后，取其上清液0.1 ml,加水到5 ml,混合均匀，从中取出0.1 ml，置入含10 ml 闪烁液的闪烁杯中，然后测定放射性。
1.6 放射性测量 采用液体闪烁计数仪测量，并用内标准法做淬灭校准。样品测量系统效率为(40.0±1.5)%。将各样品的测量结果换算成每秒钟衰变数(Bq)。以手术即刻取出样品的测量结果为最初的壳多糖棒样本植入放射性。
1.7 统计学处理 采用F检验处理实验数据。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 含氚标记的壳多糖棒大小、质量 40颗壳多糖棒经测定质量为4.1～4.6 mg/颗,x±s为(4.30±0.16) mg/颗; L: (0.30±0.07) cm, D: (0.15±0.03) cm。大小及质量差异小。说明本制备壳多糖棒的方法是均匀的。
2.2 壳多糖棒样本放射性活度 测定手术即刻取出含壳多糖棒骨样本3H放射性活度，结果差异小，x±s为(402±60)Bq。
2.3 壳多糖体内吸收率 术后5个月之内，局部骨样品中放射性活度减少不明显，提示壳多糖棒在体内吸收很少；术后7个月氚放射性减少速度加快(P<0.05)，植入后15个月有1只动物因肺部感染而死亡，其放射性活度为最初的壳多糖棒样本的68.58%。提示壳多糖棒植入后15个月近1/3已被吸收。实验结果见表1。
, 百拇医药 表1 术后不同时间样品的放射性活度及体内吸收率 植入后时间
(t/month)
n
放射性活度
吸收率
(%)
活度(Bq)
比率(%)
0
6
402±60.0
100.00
, http://www.100md.com 0.00
1
3
396±47.7
98.54
1.46
2
3
390±48.0
97.05
2.95
3
3
, http://www.100md.com
388±47.0
97.41
3.59
4
3
376±38.1
93.34
6.56
5
3
369±40.4
91.78
8.20
, 百拇医药
7
3
341±33.5*
85.22
14.78
9
3
336±29.0*
83.44
16.56
11
3
323±22.3*
, 百拇医药
80.27
19.73
13
3
308±28.8*
76.45
23.55
15
2
276±23.1*
68.58
31.42
, http://www.100md.com
*P<0.05与对照组比较
3 讨 论
可吸收生物材料在体内的吸收降解是一个复杂的过程，往往受材料的物理状态、几何形状、大小、相对分子质量、局部血供、pH值等因素的影响。因此，同一材料吸收速率差别可很大。壳多糖在体内靠吞噬细胞吞噬并经溶菌酶降解，最终变成葡萄糖而被吸收，其降解吸收缓慢,需数月之久[1]。Tikhonov等[5]证实交联后的壳多糖降解速率比未交联壳多糖要慢数倍到数十倍，且交联程度越高，降解吸收越慢。以往均采用体外称量法或大体观察的方法，受主客观影响的因素多，难以达到准确的结果。
作者在早先的系列研究中，成功地通过交联、模具分割、干燥等制药工艺制得壳多糖庆大霉素药物释放系统，经体外释放实验及体内动力学研究，证实其具有良好的体内外缓释作用[4]。但有关交联壳多糖载体在体内降解吸收情况国内外未有较好的观察方法。
, http://www.100md.com
本研究采用3H标记壳多糖，并制成棒状固体。经测定植入前各壳多糖棒样本放射性活度均匀，且差异小；术后不同时间测定局部骨组织标本氚放射性活度，以放射性活度减少推算壳多糖吸收率，具有合理性，且受主观因素影响少，并能动态观察吸收情况，为测定生物材料在体内的降解吸收情况提供了一种可行有效的方法。本实验结果与Jameela等[3]通过光镜观察的结果相似，表明交联壳多糖是一种制备长效局部药物释放系统的良好可吸收生物载体。
中国图书资料分类法分类号 R 969.1
参 考 文 献
1 Yomota C,Komuro T,Kimura T. Study in the degradation of chitosan film by lysozyme and release of loaded chemicals.Yakugaku Zasshi，1990，110(6):442
, 百拇医药
2 陈爱民，侯春林，屠开元，等. 壳多糖抗生素凝胶预防骨感染的实验研究. 第二军医大学学报，1997，18(5)：452
3 Jameela SR, Jayakrishnan A. Glutaraldehyde cross-linked chitosan microspheres as a long acting biodegradable drug delivery vehicle: studies on the in vitro release of mitoxantrone and in vivo degradation of microspheres in rat muscle. Biomaterials，1995，16(10):769
4 陈爱民，侯春林，屠开元. 壳多糖庆大霉素缓释药体内动力学研究. 第二军医大学学报，1997，18(4)：319
5 Tikhonov VR, Yamskov TA, Varlamov VP, et al. Chitinolytic digestibility of cross-linked chitosan gels by an enzyme complex from streptomyces kurssanovii. Biotechnol Appl Biochem，1993，17(pt 2):251
(1998-04-10收稿，1998-11-07修回), 百拇医药
单位：
关键词：壳多糖；氚
第二军医大学学报980633 壳多糖是一种来源丰富的天然高分子多聚糖,也是一种无毒性、生物相容性极好、体内可降解吸收的生物材料[1],并具有抑菌、提高机体免疫机能、缓解骨感染的作用[2]，其在医学上的应用前景广阔。近几年来,壳多糖作为缓释制剂的研究受到重视[3]。研究证实，交联壳多糖是一种良好的可吸收性植入性局部药物释放系统的载体[4]，本研究采用氚标记法测定生物材料壳多糖的体内吸收率。
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠36只，雌雄不拘，体质量200～220 g， 由本校实验动物中心提供。壳多糖由上海其胜生物材料技术研究所提供。冰醋酸,36%甲醛，甲酸， 过氧化氢，闪烁液(二甲苯 666 ml， PPO 4 g + Troton X-1000 333 ml，POPOP 0.2 g)，均购自上海化学试剂商店。FJ-2105液闪仪：西安262厂生产。模具 40孔,每孔直径0.6 cm,长度1.0 cm。
, 百拇医药
1.2 壳多糖的标记 采用紫外线激活氚原子法标记壳多糖 (由中国科学院上海原子能研究所完成)。 标记参数： 固体粉末； 比活性： 3 098 750 Bq/mg; 放化纯度>90%。 取标记的壳多糖固体粉末， 加入 1 ml 4% 的醋酸溶液中， 混匀待用。
1.3 含氚标记的壳多糖棒制备 取160 mg壳多糖,加入含15 ml 2%醋酸溶液烧杯中,混合,摇匀。在此壳多糖溶液中小心加入 1 ml 3H标记的壳多糖溶液，充分搅拌混匀。然后再在200 r/min搅拌下逐滴加入36%甲醛2 ml,10 min后灌入模具,静置30 min,脱模,乙醇脱水12 h。室温下自然蒸干制得 3H 标记干性壳多糖棒状样本40粒。密封后60Co消毒,4℃下存放待用。
1.4 壳多糖棒植入方法 每只动物按24 mg/kg戊巴比妥经腹腔注射麻醉后仰卧位,固定，取右胫骨结节为中心作内侧纵形切口,切开皮肤皮下骨膜, 以胫骨结节为中心点，用直径2 mm 克氏针垂直于胫骨干骺端钻一小孔，深达3 mm。植入一颗壳多糖样本，缝合骨膜及各层组织。
, 百拇医药
1.5 样品的收集和制备 按手术即刻及术后1,2,3,4,5,7,9,11,13,15个月各时间点处死动物,取出右侧胫骨, 以胫骨结节为中心点，在中心点两侧共0.3 cm宽度内,取下圆柱形干骺端，再用尖嘴咬骨钳修剪外周骨皮，至称量为170 mg骨块为止。-20℃存放待制备。样品制备方法：将骨样品置入含0.8 ml 甲酸的消化试管中，再滴入 2 滴过氧化氢，在80℃下消化2 h，使骨组织和样本完全消化，加水至2 ml。然后，取其上清液0.1 ml,加水到5 ml,混合均匀，从中取出0.1 ml，置入含10 ml 闪烁液的闪烁杯中，然后测定放射性。
1.6 放射性测量 采用液体闪烁计数仪测量，并用内标准法做淬灭校准。样品测量系统效率为(40.0±1.5)%。将各样品的测量结果换算成每秒钟衰变数(Bq)。以手术即刻取出样品的测量结果为最初的壳多糖棒样本植入放射性。
1.7 统计学处理 采用F检验处理实验数据。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 含氚标记的壳多糖棒大小、质量 40颗壳多糖棒经测定质量为4.1～4.6 mg/颗,x±s为(4.30±0.16) mg/颗; L: (0.30±0.07) cm, D: (0.15±0.03) cm。大小及质量差异小。说明本制备壳多糖棒的方法是均匀的。
2.2 壳多糖棒样本放射性活度 测定手术即刻取出含壳多糖棒骨样本3H放射性活度，结果差异小，x±s为(402±60)Bq。
2.3 壳多糖体内吸收率 术后5个月之内，局部骨样品中放射性活度减少不明显，提示壳多糖棒在体内吸收很少；术后7个月氚放射性减少速度加快(P<0.05)，植入后15个月有1只动物因肺部感染而死亡，其放射性活度为最初的壳多糖棒样本的68.58%。提示壳多糖棒植入后15个月近1/3已被吸收。实验结果见表1。
, 百拇医药 表1 术后不同时间样品的放射性活度及体内吸收率 植入后时间
(t/month)
n
放射性活度
吸收率
(%)
活度(Bq)
比率(%)
0
6
402±60.0
100.00
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1
3
396±47.7
98.54
1.46
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97.05
2.95
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388±47.0
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4
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376±38.1
93.34
6.56
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369±40.4
91.78
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3
341±33.5*
85.22
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336±29.0*
83.44
16.56
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3
323±22.3*
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19.73
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308±28.8*
76.45
23.55
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2
276±23.1*
68.58
31.42
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*P<0.05与对照组比较
3 讨 论
可吸收生物材料在体内的吸收降解是一个复杂的过程，往往受材料的物理状态、几何形状、大小、相对分子质量、局部血供、pH值等因素的影响。因此，同一材料吸收速率差别可很大。壳多糖在体内靠吞噬细胞吞噬并经溶菌酶降解，最终变成葡萄糖而被吸收，其降解吸收缓慢,需数月之久[1]。Tikhonov等[5]证实交联后的壳多糖降解速率比未交联壳多糖要慢数倍到数十倍，且交联程度越高，降解吸收越慢。以往均采用体外称量法或大体观察的方法，受主客观影响的因素多，难以达到准确的结果。
作者在早先的系列研究中，成功地通过交联、模具分割、干燥等制药工艺制得壳多糖庆大霉素药物释放系统，经体外释放实验及体内动力学研究，证实其具有良好的体内外缓释作用[4]。但有关交联壳多糖载体在体内降解吸收情况国内外未有较好的观察方法。
, http://www.100md.com
本研究采用3H标记壳多糖，并制成棒状固体。经测定植入前各壳多糖棒样本放射性活度均匀，且差异小；术后不同时间测定局部骨组织标本氚放射性活度，以放射性活度减少推算壳多糖吸收率，具有合理性，且受主观因素影响少，并能动态观察吸收情况，为测定生物材料在体内的降解吸收情况提供了一种可行有效的方法。本实验结果与Jameela等[3]通过光镜观察的结果相似，表明交联壳多糖是一种制备长效局部药物释放系统的良好可吸收生物载体。
中国图书资料分类法分类号 R 969.1
参 考 文 献
1 Yomota C,Komuro T,Kimura T. Study in the degradation of chitosan film by lysozyme and release of loaded chemicals.Yakugaku Zasshi，1990，110(6):442
, 百拇医药
2 陈爱民，侯春林，屠开元，等. 壳多糖抗生素凝胶预防骨感染的实验研究. 第二军医大学学报，1997，18(5)：452
3 Jameela SR, Jayakrishnan A. Glutaraldehyde cross-linked chitosan microspheres as a long acting biodegradable drug delivery vehicle: studies on the in vitro release of mitoxantrone and in vivo degradation of microspheres in rat muscle. Biomaterials，1995，16(10):769
4 陈爱民，侯春林，屠开元. 壳多糖庆大霉素缓释药体内动力学研究. 第二军医大学学报，1997，18(4)：319
5 Tikhonov VR, Yamskov TA, Varlamov VP, et al. Chitinolytic digestibility of cross-linked chitosan gels by an enzyme complex from streptomyces kurssanovii. Biotechnol Appl Biochem，1993，17(pt 2):251
(1998-04-10收稿，1998-11-07修回), 百拇医药