大鼠肝小肠联合移植肠壁酶活性变化的研究
作者：王果 孙晓毅 魏明发 史惠芬 茹立强
单位：430030 武汉，同济医科大学同济医院小儿外科(王果、孙晓毅、魏明发、史惠芬)，同济医科大学神经生物教研室(茹立强)
关键词：器官移植；小肠移植；酶
中华外科杂志/980620 【摘要】 目的 探讨肝小肠联合移植后肠壁酶活性的变化及其与移植肠功能和免疫排斥反应之间的关系。 方法 用封闭群大鼠建立肝小肠联合移植模型,术后定期对移植组织进行病理学、酶组织化学检查。 结果 单独小肠移植组术后均发生排斥反应，肠壁酶活性消失。肝小肠联合移植组56 %可避免排斥反应,肠壁酶活性和神经成分得以保持和恢复。 结论 肝小肠联合移植可使供肠避免或推迟被排斥。术后检测肠壁酶活性和神经成分的变化可用于监测排斥反应。
The enzymes activity of intestine grafts after combined small bowel/liver transplantation in rats Wang Guo,Sun Xiaoyi,Wei Mingfa,et al.Department of Pediatric Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030.
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【Abstract】 Objective To study the alteration of the enzymes activity of intestine grafts after combined small bowel/liver transplantation in rats and the relations between their changes, functions and immune rejection. Method A kind of model of combined small bowel/liver transplantation (SLT) was established in SD closed colony rats. The enzymes activity of grafts were examined at regular postoperative intervals with histochemical methods. Result The enzymes activity of grafts disappeared eventually in isolated small bowel transplanation rats.Contrary,those in SLT rats were remained and recovered after operation. Conclusion The rejection in grafted intestine can be prevented or delayed in SLT rats. The examination of activity of enzymes and nerves in grafts may be used to monitor rejection and study function of grafts.
, 百拇医药
【Key words】 Organ transplantation Small bowel transplantation Enzyme
肝小肠联合移植中肝对小肠的保护作用已引起关注，我们在大鼠建立的模型也证实了肝小肠联合移植可诱导耐受,并能保护同时移植的小肠免于或延迟被排斥[1]。本研究利用这种模型对移植后小肠壁内一些酶活性的改变进行了实验研究，以探讨这些变化与移植小肠排斥反应之间的关系。
材料和方法
1.一般资料：封闭群SD雄性大鼠27只，每只重250～350 g，乙醚吸入麻醉，显微外科操作行肝肠移植术。动物分组：(1)正常大鼠5只，取肝和小肠对照；(2)单独小肠移植组大鼠13只；(3)肝小肠联合移植组大鼠9只。分别在术后第3、4、8、10天以及终止期取材。根据已证实的排斥规律将小肠移植的终止期定为12天,肝小肠联合移植定为14天。
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2.动物模型的建立：肝小肠联合移植术:供肝、肠联合灌注切取,分开装修和移植[2]。单独小肠移植与肝小肠联合移植模型的小肠移植部分相同。术后动物单笼饲养,肌注青霉素3天，20万U/次,每天2次。不用免疫抑制剂。
3.移植器官的组织化学检查：取移植器官组织标本，检测单氨氧化酶(MAO)，按Glenner等方法；三磷酸腺苷(ATP)，按镁离子激活ATP酶法；碱性磷酸酶(AKP)，按改良Gomori法；乙酰胆碱酯酶(AchE)，Karnovsky-Roots亚铁氰化铜直接显示法；一氧化氮合酶(NOS)组织化学染色，按Dawson法[3]。根据酶活性强弱及分布密度进行半定量分级比较分析。
结果
1.移植器官组织改变与排斥分级：小肠移植组13只大鼠中9只(69.2 %)分别在移植后的第3、4、5、6、7、10天急性处死取材，进行病理检查，根据病理学分级标准[4]证实移植小肠免疫排斥反应为中度。其余4只(38.8 %)在存活期中计划取材。检查证实供肠排斥反应为轻度。肝小肠联合移植组9只大鼠中，肝与小肠排斥反应在4只呈现为轻度,5只存活7至14天，按计划取材未见排斥反应。
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2.移植小肠酶组织化学的变化：(1)正常大鼠：肠壁MAO在肠肌丛和粘膜下丛及神经节细胞为中度阳性反应；ATP则主要分布在肠肌丛神经节细胞和肝内微胆管；AKP在粘膜上皮呈现微弱反应，在肝微胆管和少数肝细胞呈现弱至中度阳性；AchE阳性神经主要见于肌层和壁内神经丛，以环肌最为丰富；NOS活性成分也主要存在于环肌和壁内神经丛及其神经节细胞，粘膜上皮仅为弱至中度阳性反应。(2)小肠移植组：大鼠随术后排斥反应的进展，供肠壁各层MAO、ATP、AKP和AchE活性进行性减弱并消失。术后短、中期标本中，固有膜内出现少量NOS阳性炎性细胞浸润和血管增生，晚期环肌和肠肌丛仅偶见NOS阳性神经纤维。(3)肝小肠联合移植组大鼠：术后早期供肠壁酶活性减弱，但存活7天以上无排斥反应的大鼠肠绒毛上皮缘ATP和AKP活性可出现一定恢复，表现为弱阳性。术后各期肠壁各层AchE的变化相似，但存活7天以上大鼠以肠肌丛神经节细胞的AchE活性较强，并且无细胞变性。术后终期各层仍有中度活性。NOS活性在术后各期均存在，主要分布在粘膜层血管和浸润细胞，环肌层和肠肌丛内始终能见到NOS阳性神经纤维(附表)。
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讨论
自从将肝小肠联合移植成功地用于治疗短肠综合征并使小肠移植物长期存活后，肝对小肠具有保护作用的问题日益引起关注。本实验中所有单独小肠移植的大鼠在术后3天开始发生排斥反应，1周左右均可见中度以上排斥反应。然而，肝小肠联合移植大鼠只有少数供肠在早期出现轻度排斥反应，半数以上在移植后1～2周供肠未出现明显排斥反应。这表明肝小肠联合移植能明显减轻或延迟移植小肠的排斥反应。我们通过观察供肠内一些酶活性及神经成分的改变，发现在单独小肠移植大鼠，术后随排斥反应的发生和加重，供肠壁内MAO、AKP、ATP、AchE等酶活性成分立即下降，甚至几乎全部消失。即使受体大鼠排斥轻微而存活期延长，这些酶活性也不再显现。这些变化与病理检查中的排斥反应程度也相平行。值得指出的是，NOS阳性的炎性细胞浸润和血管增生与排斥的发生明显相关，推测它可能与排斥反应中多种细胞介质诱导激活的NO合成释放增多有关[5]，我们把它与病理改变相结合，作为排斥分级的一项指标。在肝小肠联合移植组大鼠，供肠的酶活性变化呈现出与单独小肠移植明显不同的特点，出现轻度排斥反应的大鼠供肠壁酶仍保存有不同程度的活性。存活1～2周的无排斥反应的大鼠，供肠壁酶活性明显恢复，特别是NOS和 AchE，它们在肠肌丛及其神经原胞体中均存在，并几乎接近正常水平。
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附表 大鼠小肠内AchE和NOS活性成分的分布与移植后的改变 酶
天
例数
粘 膜 层
粘膜下丛
神经节细胞
肌 层
上皮缘
神经
血管
浸润细胞
环肌
肠肌丛神经
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神经节细胞
AchE
正常大鼠…
5…
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小肠移植
3～12
13…
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肝肠移植
3～6
7～12
4
5……
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NOS
正常大鼠…
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小肠移植
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肝肠移植
3～6
7～9
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4
3
2
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注：神经或神经节细胞众多，有密网，酶活性强；神经或神经节细胞数量较多，有细网，酶活性中等；+神经或神经节细胞稀少，酶活性弱；-阴性。
本研究提示：肝对移植小肠有保护作用。肠道固有神经成分的酶类活性在术后的变化特点有可能被作为检测判断排斥反应的重要指标。在肝对小肠保护作用的机理中，肠神经系统及其递质和一些细胞酶类也可能是除免疫因素外的另一类重要参与因素。在肝诱导对小肠免疫耐受的机理中可能存在神经(肠神经系统 )-免疫(肠内分泌-免疫功能)网络调节系统，它的作用还有待于进一步深入探讨。 参考文献
1孙晓毅,王果,夏谷良,等.大鼠肝小肠联合移植的研究.中华实验外科杂志,1996,13:141-142.
, 百拇医药
2孙晓毅,王果,魏明发,等.大鼠肝小肠联合移植模型的建立.中华器官移植杂志,1997,14:194-195.
3Dawson TM,Bredt DS,Fotuhi M,et al. Niric oxide synthase and neuronal NADPH-diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:7797-7801.
4Zhong R,He G,Sakai Y,et al.The effect of donor-recipient strain combination on rejection and graft-versus-host disease after small bowel/liver transplantation in the rat. Transplantation, 1993,56:381-385.
5Rodeberg DA, Chart MS,Bass RC, et al. Nitric oxide: an overview.Am J Surg,1995,170:292-303.
本课题受国家自然科学基金资助, 百拇医药
单位：430030 武汉，同济医科大学同济医院小儿外科(王果、孙晓毅、魏明发、史惠芬)，同济医科大学神经生物教研室(茹立强)
关键词：器官移植；小肠移植；酶
中华外科杂志/980620 【摘要】 目的 探讨肝小肠联合移植后肠壁酶活性的变化及其与移植肠功能和免疫排斥反应之间的关系。 方法 用封闭群大鼠建立肝小肠联合移植模型,术后定期对移植组织进行病理学、酶组织化学检查。 结果 单独小肠移植组术后均发生排斥反应，肠壁酶活性消失。肝小肠联合移植组56 %可避免排斥反应,肠壁酶活性和神经成分得以保持和恢复。 结论 肝小肠联合移植可使供肠避免或推迟被排斥。术后检测肠壁酶活性和神经成分的变化可用于监测排斥反应。
The enzymes activity of intestine grafts after combined small bowel/liver transplantation in rats Wang Guo,Sun Xiaoyi,Wei Mingfa,et al.Department of Pediatric Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030.
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【Abstract】 Objective To study the alteration of the enzymes activity of intestine grafts after combined small bowel/liver transplantation in rats and the relations between their changes, functions and immune rejection. Method A kind of model of combined small bowel/liver transplantation (SLT) was established in SD closed colony rats. The enzymes activity of grafts were examined at regular postoperative intervals with histochemical methods. Result The enzymes activity of grafts disappeared eventually in isolated small bowel transplanation rats.Contrary,those in SLT rats were remained and recovered after operation. Conclusion The rejection in grafted intestine can be prevented or delayed in SLT rats. The examination of activity of enzymes and nerves in grafts may be used to monitor rejection and study function of grafts.
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【Key words】 Organ transplantation Small bowel transplantation Enzyme
肝小肠联合移植中肝对小肠的保护作用已引起关注，我们在大鼠建立的模型也证实了肝小肠联合移植可诱导耐受,并能保护同时移植的小肠免于或延迟被排斥[1]。本研究利用这种模型对移植后小肠壁内一些酶活性的改变进行了实验研究，以探讨这些变化与移植小肠排斥反应之间的关系。
材料和方法
1.一般资料：封闭群SD雄性大鼠27只，每只重250～350 g，乙醚吸入麻醉，显微外科操作行肝肠移植术。动物分组：(1)正常大鼠5只，取肝和小肠对照；(2)单独小肠移植组大鼠13只；(3)肝小肠联合移植组大鼠9只。分别在术后第3、4、8、10天以及终止期取材。根据已证实的排斥规律将小肠移植的终止期定为12天,肝小肠联合移植定为14天。
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2.动物模型的建立：肝小肠联合移植术:供肝、肠联合灌注切取,分开装修和移植[2]。单独小肠移植与肝小肠联合移植模型的小肠移植部分相同。术后动物单笼饲养,肌注青霉素3天，20万U/次,每天2次。不用免疫抑制剂。
3.移植器官的组织化学检查：取移植器官组织标本，检测单氨氧化酶(MAO)，按Glenner等方法；三磷酸腺苷(ATP)，按镁离子激活ATP酶法；碱性磷酸酶(AKP)，按改良Gomori法；乙酰胆碱酯酶(AchE)，Karnovsky-Roots亚铁氰化铜直接显示法；一氧化氮合酶(NOS)组织化学染色，按Dawson法[3]。根据酶活性强弱及分布密度进行半定量分级比较分析。
结果
1.移植器官组织改变与排斥分级：小肠移植组13只大鼠中9只(69.2 %)分别在移植后的第3、4、5、6、7、10天急性处死取材，进行病理检查，根据病理学分级标准[4]证实移植小肠免疫排斥反应为中度。其余4只(38.8 %)在存活期中计划取材。检查证实供肠排斥反应为轻度。肝小肠联合移植组9只大鼠中，肝与小肠排斥反应在4只呈现为轻度,5只存活7至14天，按计划取材未见排斥反应。
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2.移植小肠酶组织化学的变化：(1)正常大鼠：肠壁MAO在肠肌丛和粘膜下丛及神经节细胞为中度阳性反应；ATP则主要分布在肠肌丛神经节细胞和肝内微胆管；AKP在粘膜上皮呈现微弱反应，在肝微胆管和少数肝细胞呈现弱至中度阳性；AchE阳性神经主要见于肌层和壁内神经丛，以环肌最为丰富；NOS活性成分也主要存在于环肌和壁内神经丛及其神经节细胞，粘膜上皮仅为弱至中度阳性反应。(2)小肠移植组：大鼠随术后排斥反应的进展，供肠壁各层MAO、ATP、AKP和AchE活性进行性减弱并消失。术后短、中期标本中，固有膜内出现少量NOS阳性炎性细胞浸润和血管增生，晚期环肌和肠肌丛仅偶见NOS阳性神经纤维。(3)肝小肠联合移植组大鼠：术后早期供肠壁酶活性减弱，但存活7天以上无排斥反应的大鼠肠绒毛上皮缘ATP和AKP活性可出现一定恢复，表现为弱阳性。术后各期肠壁各层AchE的变化相似，但存活7天以上大鼠以肠肌丛神经节细胞的AchE活性较强，并且无细胞变性。术后终期各层仍有中度活性。NOS活性在术后各期均存在，主要分布在粘膜层血管和浸润细胞，环肌层和肠肌丛内始终能见到NOS阳性神经纤维(附表)。
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讨论
自从将肝小肠联合移植成功地用于治疗短肠综合征并使小肠移植物长期存活后，肝对小肠具有保护作用的问题日益引起关注。本实验中所有单独小肠移植的大鼠在术后3天开始发生排斥反应，1周左右均可见中度以上排斥反应。然而，肝小肠联合移植大鼠只有少数供肠在早期出现轻度排斥反应，半数以上在移植后1～2周供肠未出现明显排斥反应。这表明肝小肠联合移植能明显减轻或延迟移植小肠的排斥反应。我们通过观察供肠内一些酶活性及神经成分的改变，发现在单独小肠移植大鼠，术后随排斥反应的发生和加重，供肠壁内MAO、AKP、ATP、AchE等酶活性成分立即下降，甚至几乎全部消失。即使受体大鼠排斥轻微而存活期延长，这些酶活性也不再显现。这些变化与病理检查中的排斥反应程度也相平行。值得指出的是，NOS阳性的炎性细胞浸润和血管增生与排斥的发生明显相关，推测它可能与排斥反应中多种细胞介质诱导激活的NO合成释放增多有关[5]，我们把它与病理改变相结合，作为排斥分级的一项指标。在肝小肠联合移植组大鼠，供肠的酶活性变化呈现出与单独小肠移植明显不同的特点，出现轻度排斥反应的大鼠供肠壁酶仍保存有不同程度的活性。存活1～2周的无排斥反应的大鼠，供肠壁酶活性明显恢复，特别是NOS和 AchE，它们在肠肌丛及其神经原胞体中均存在，并几乎接近正常水平。
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附表 大鼠小肠内AchE和NOS活性成分的分布与移植后的改变 酶
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注：神经或神经节细胞众多，有密网，酶活性强；神经或神经节细胞数量较多，有细网，酶活性中等；+神经或神经节细胞稀少，酶活性弱；-阴性。
本研究提示：肝对移植小肠有保护作用。肠道固有神经成分的酶类活性在术后的变化特点有可能被作为检测判断排斥反应的重要指标。在肝对小肠保护作用的机理中，肠神经系统及其递质和一些细胞酶类也可能是除免疫因素外的另一类重要参与因素。在肝诱导对小肠免疫耐受的机理中可能存在神经(肠神经系统 )-免疫(肠内分泌-免疫功能)网络调节系统，它的作用还有待于进一步深入探讨。 参考文献
1孙晓毅,王果,夏谷良,等.大鼠肝小肠联合移植的研究.中华实验外科杂志,1996,13:141-142.
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2孙晓毅,王果,魏明发,等.大鼠肝小肠联合移植模型的建立.中华器官移植杂志,1997,14:194-195.
3Dawson TM,Bredt DS,Fotuhi M,et al. Niric oxide synthase and neuronal NADPH-diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:7797-7801.
4Zhong R,He G,Sakai Y,et al.The effect of donor-recipient strain combination on rejection and graft-versus-host disease after small bowel/liver transplantation in the rat. Transplantation, 1993,56:381-385.
5Rodeberg DA, Chart MS,Bass RC, et al. Nitric oxide: an overview.Am J Surg,1995,170:292-303.
本课题受国家自然科学基金资助, 百拇医药