纤维粘连蛋白对膀胱癌细胞生物学行为的影响
作者：张文颖 徐勇 马腾骧
单位：300211 天津市泌尿外科研究所(张文颖 现在中国人民解放军国防科工委总医院，100101北京)
关键词：纤连蛋白类；膀胱肿瘤；分子生物学
中华医学杂志980610 【摘要】 目的 研究细胞外基质成分纤维粘连蛋白(FN)在膀胱肿瘤细胞生长、粘附和侵袭转移中的作用。方法 利用转基因技术将 FN cDNA 基因导入低表达FN的膀胱癌细胞系253J，获得高表达FN的细胞系253FN，并观察转染前后细胞生长速度的变化。用氮兰四唑盐方法检测细胞与基质的粘附能力；用机械法和细胞分离试验测定细胞的同质粘附性；Boyden小室法检测细胞的侵袭能力。结果 253FN细胞体外增殖能力减弱；同质粘附能力增强，与基质的粘附能力亦增强。且细胞不易相互分离。体外侵袭实验表明，253FN细胞穿过基底膜的能力减弱。结论 随着膀胱癌细胞FN表达水平的增高，一些恶性表型发生变化，可使其侵袭转移能力受到抑制。
, 百拇医药
Effects of different expression levels of fibronetin on biological behavior of tumor cells Zhang Wenying, Xu Yong, Ma Tengxiang.Tianjin Urinary Surgery Institute, Tianjin 300211
【Abstract】 Objective To study the effects of fibronectin(FN) on tumor cell proliferation, adherence and invasion. Methods FN cDNA was introduced into a transitional carcinoma cell line 253J which expressed low level of FN,and 253 FN line which expressed higher level of FN was established. The changes of cellular proliferation in vitro were observed. Adhesiveness to the extracellular matrix was detected by MTT method. Hemotypic adhesion was investigated by detachment assay and invasiveness of the cells was observed with Boyden Chamber before and after FN cDNA gene transfection. Results The growth rate of 253-FN was decreased as compared with its parental cell 253J. Hemotypic adhesion was significantly increased. The adhesiveness of the cells to extracellular matrix was enhanced. Invasion assay showed that invasioness of 253-FN was decreased. Conclusion This study suggested a correlation between FN expression and its biological behavior. With increased FN level, malignant phenotype was changed and invasive ability was inhibited.
, 百拇医药
【Key words】 Fibronectins Bladder neoplasms Molecular biology
(Natl Med J China, 1998, 78：430-433)
纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)是细胞外基质成分之一，在细胞与基质的相互作用中起着重要的作用，包括细胞的粘附、游走、分化和恶性转化[1]。为了研究FN对上皮性肿瘤细胞生物学行为的影响，我们利用基因重组和转移技术构建了高表达FN的膀胱癌细胞株253FN。并利用细胞 粘附试验和基底膜侵袭试验等检测了该细胞株的某些生物学行为，以探讨FN在膀胱肿瘤细胞生长、粘附、侵袭和转移中所起的作用。
材料与方法
一、材料
含有人FN cDNA片段的质粒 pFH 100由法国CNRS URA病理生理实验室Sylvie Dufour教授惠赠；逆转录病毒载体pLJ由美国麻省理工学院生物系Mynes KO教授赠送；低分化膀胱移行细胞癌253J细胞由美国依阿华大学医学部泌尿外科See WA教授赠送。限制性内切酶、修 饰酶、随机引物以及DNA标记试剂盒为美国Promega公司产品；Lipofectin、鼠抗人FN抗体及人工基底膜凝胶为美国GIBCO公司产品；免疫组织化学试剂盒及MTT购自中山公司。
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二、方法
1.FN逆转录病毒载体的构建及导入253J细胞：扩增pFH 100和pLJ质粒，提取DNA，用SphⅠ和ClaI切下pFH 100中FN片段，补平，用BamHI切开PLJ，将FN cDNA片段和线性化载体进行连接反应，转化感受态细胞，经酶切分析选出正向连接的重组质粒，用Lipofectin将重组质粒和空载体转入PA317细胞中，克隆扩增后制备病毒液，用高滴度病毒液(3.2×104 CFU/ml)感染253J细胞，筛选3周产生抗性克隆(253FN和253pLJ)，转移后传代培养。
2.S-P法免疫组织化学：细胞生长80%融合，丙酮固定5分钟，实验步骤按试剂盒说明书进行，一抗为1∶50鼠抗人FN单抗，DAB显色后常规复染，脱水，透明，封片。设磷酸盐缓冲液(PBS)，空白对照。
3.细胞生长能力观察：将253FN，253J和253pLJ细胞以1×104/ml分别接种于25 ml培养瓶中，共7组，每组3瓶，CO2温箱培养，每天计数一组细胞，做出生长曲线。
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4.细胞-基质粘附试验：4℃用PBS将人工基质胶稀释成5mg/ml，加入96孔板中，20 μl/孔，37℃1小时，铺好基质胶的96孔板中加入细胞5×105/ml，100 μl/孔，37℃培养20、40、60、80及100分钟，吸出培养液，加入10 mg/ml的氮兰四唑盐(MTT)，20 μl/孔，继续培养4小时，吸出MTT，加入二甲基亚砜100 μl/孔，室温15分钟，用酶联免疫检测仪在570nm测光密度(A)值。
5.同质性粘附试验：借鉴高进[4]的方法，将253J和253FN细胞分别接种于96孔板中，使其长满单层不留空隙，以5×105/孔分别接种同种细胞，37℃摇床40 r/min，于20、40、60、80及100分钟吸 出含有未粘附细胞的培养液。得出粘附的细胞数。
6.细胞分离试验：根据文献[4]，将253J和253FN细胞以5×105/孔分别接种于6孔板中，培养至细胞完全汇合，加入0.02%乙二胺四乙酸1 ml，室温置水平摇床40 r/min，于2、4、6、8及10分钟收集脱落细胞计数，未脱落的细胞用0.25% 胰酶消化计数。细胞脱落率公式为：
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细胞脱落率＝脱落细胞数/细胞总数×100%
7.侵袭试验：参照Albin等[5]方法，用1 mg/ml基质胶铺盖于8 μm孔径的微孔滤膜上，Boyden小室的下室加入200 μl驱化剂(无血清培养24小时的NIH3T3细胞条件培养基)，将2×105/ml的253FN、253J和253pLJ细胞悬液以0.8 ml/室加到上室中，培养12小时，取出滤膜，甲醛固定5分钟，HE染色，250倍光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，计数中间和四周5个视野，计算平均值，每组计数3份样本。
8.统计学方法：采用t检验。
结果
一、FN基因导入253J细胞前后免疫组织化学染色
用免疫组织化学S-P法染色对细胞的FN蛋白表达进行定位分析，253FN细胞的胞浆胞膜呈棕红着色，免疫阳性沉积物明显增多，而253J细胞仅有轻微着色，证明转染后FN蛋白表达增加(图1，2)。
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二、细胞生长能力
253FN细胞生长速度明显下降，接种后第8天生长汇合，253J细胞第3天汇合，253PLJ细胞4天汇合，表明高表达FN的细胞体外增殖能力减弱，转染事件本身对细胞的生长速度有轻度影响(图3)。
三、细胞粘附性
在各时相内，253FN细胞与基质的粘附及同质粘附均明显增高。二者比较差异有显著意义(表1，2)。细胞分离试验表明：253FN细胞脱落率明显低于253J细胞(表3)。说明随着FN表达增高，肿瘤细胞更易于相互粘附以及与基底膜粘附，并且粘附的细胞不易于分离脱落。
四、细胞的侵袭转移能力
肿瘤细胞首先粘附于基底膜表面，进而消化降解人工基底膜并通过运动而穿过多孔滤膜，最后附着在滤膜另一面，253FN细胞穿过滤膜数15.4±2.3，253J细胞为36.1±2.3，两者比较P<0.001。253PLJ细胞穿膜数33±4，与253J细胞比较，
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图1 253J细胞的胞浆及胞膜FN免疫反应弱阳性，S-P染色，苏木精复染 ×400 图2 基因转染后大量FN沉积于253FN细胞的胞浆及胞膜，免疫反应强阳性，S-P染色，苏木精复染 ×400
表1 253J和253FN细胞与人工基底膜的粘附情况(A值，
±s) 细胞
标本数
培养时间(min)
20
40
60
80
100
, 百拇医药
253J
6
0.21±0.03
0.21±0.02
0.32±0.04
0.39±0.03
0.43±0.05
253FN
6
0.26±0.06
0.35±0.04
0.67±0.04
, 百拇医药
0.89±0.04
1.27±0.69
t值
0.20
7.43
14.54
25.82
24.85
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
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<0.01
表2 253J和253FN细胞的同质性粘附情况(细胞数×105/ml，±s) 细胞
标本数
培养时间(min)
20
40
60
80
100
253J
6
, 百拇医药
1.62±0.23
2.54±0.24
5.88±0.11
7.55±0.24
9.83±0.38
253FN
6
3.57±0.24
4.48±0.34
7.59±0.35
9.39±0.30
15.35±0.32
, 百拇医药
t值
14.08
8.52
11.45
12.51
26.82
P值
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
表3 细胞相互间分离及其与基质分离情况(细胞数×105/ml，±s) 细胞
, 百拇医药
标本数
作用时间(min)
2
4
6
8
10
253J
6
2.0±2.1(11.9)
2.09±0.67(20.9)
3.4±0.4(34.3)
6.73±0.37(67.3)
, 百拇医药
7.44±0.31(74.4)
253FN
6
1.3±0.4(13.4)
1.47±0.16(14.7)
2.4±0.3(24.1)
3.06±0.15(30.6)
4.21±0.23(42.1)
t值
3.05
6.53
5.18
, 百拇医药
22.37
20.44
P值
<0.05
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：细胞总数为1×106/ml；括号内为细胞脱落率(%)
P>0.05。表明，FN高表达限制了细胞移动，转染事件本身对细胞侵袭力和运动性无明显影响。
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图3 253FN、253J及253pLJ细胞生长曲线
讨论
本实验将具备完整功能区的人FN cDNA 片段插入到逆转录病毒载体pLJ的5'MLV LTR 的下游克隆位点，在此之后是一个SV40起始点/启动子/增强子片段和新霉素抗性基因，被SV40启动子所起动，接下来是一个PBR322复制起始点。通过PLJ载体将FN重组多肽导入FN低表达的人膀胱癌253J细胞中，建立高表达FN的细胞株253FN，用G418选择整合了重组病毒的肿瘤细胞，未整合的DNA在数代后便全部丢失。免疫组织化学染色证实转染后细胞FN产物的分泌明显增加。
细胞表面FN减少是细胞连接和细胞骨架发生改变的原因之一。研究表明[6]，转化细胞或高转移细胞系显示较弱的粘附性，来源于同一母系的具有不同转移性的克隆株所得的结果也发现，细胞株自身的粘附性与其侵袭转移潜能成反比[7]。肿瘤细胞的生长和转移过程在细胞与细胞之间粘附分子的互相作用下不断地发生着变化。由于恶性细胞比正常细胞间粘附力低，因此有利于肿瘤细胞相互分离，脱离原瘤灶进而发生转移。
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由于癌基因的转化可引起细胞FN生物合成的减少[8]，因此在肿瘤细胞分离、转移、粘附等一系列生物学行为的变化中，FN表达水平所产生的影响是值得重视的。在本试验中，比较了不同FN表达水平的肿瘤细胞粘附性的差异，发现253FN细胞同质粘附性以及与人工基底膜的粘附均显著增加，并且粘附的牢固性增强，肿瘤细胞不易从周围的细胞中脱落下来。我们认为，与低表达FN的253J细胞比较，253FN细胞相互接触时，可因FN表达的增加而与细胞表面整合素受体的结合力增强，从而加强了细胞的同质粘附。当细胞与人工基底膜接触时，自身分泌的FN更有助于细胞伸展粘附。另外，我们在细胞培养中还发现，253J细胞在贴壁生长过程中，极易自然脱壁，而253FN细胞则不 发生脱壁现象，显然与基质成分影响有关。
在肿瘤的不同进展阶段中，粘附有着不同的意义。在转移过程的早期步骤中，粘附使细胞不易于离开瘤体，实际上降低了转移率。只有在转移的后面步骤中，抑制粘附可抑制转移结节的形成。
, 百拇医药 Diana等[9]将小鼠黑素瘤B16细胞与NIH3T3细胞融合后形成杂交瘤细胞，该细胞高表达FN而失去了一些恶性表型，如体内成瘤性，体外进行性生长繁殖等。本文中253FN细胞的体外生长速度明显低于253J细胞，与国外研究结果相同。我们认为除了转染事件本身对细胞生长的轻度影响之外，主要与FN表达增加使恶性表型逆转有关。
体外试验中，肿瘤细胞表面FN减少或完全丧失均可使细胞间的粘附力降低，细胞更易分离而浸润进入人工基底膜中，253J细胞穿膜数明显高于253FN细胞。分析认为一方面FN表达增加使细胞同质粘附增强，限制了细胞的移动。另一方面驱化剂中的基质成分对低分化肿瘤细胞具有较强的驱化作用[10]。因此，253FN细胞由于某些恶性表型的逆转而降低了移动性。
然而，尽管FN在肿瘤转移浸润过程中的作用是不容忽视的。但细胞的粘附及其转移浸润机制是十分复杂的，异型细胞发生了许多表型变化，细胞表面FN的缺乏所导致的结果只是其中之一。此外还受其他粘附分子、酶和细胞调节因子的作用和制约，以及受肿瘤细胞所处环境的影响，因此还应从不同方面进行综合分析。
, 百拇医药
本课题为国家教育委员会优秀年轻教师基金资助项目
参考文献
1 Dufour S, Duband JL, Thiery JP. Role of a major cell- substratum adhesion system in cell behavior and morphagenesis. Bio cell, 1986, 58：1-14.
2 Akiyama SK, Olden K,Yamada KM.Fibronectin and integrins in invasion and metastasis. Cancer Metastasis Rev, 1995, 14：173-189.
3 J. 萨母布鲁克著(金冬雁，黎孟枫译).分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1993.362-372.
, 百拇医药
4 高进主编.癌的侵袭与转移—基础研究与临床.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996.17-18.
5 Albini A, Iwamoto Y, McEwan RN. A rapid in vitro assay for guantitating the invasion potantial of tumor cell. Cancer Res，1987, 47：3239-3245.
6 Coman DR. Adhesiveness and stickness: two independent properties of the cell surface. Cancer Res, 1997, 21：1436-1441.
7 Fidlor IJ.Cancer metastasis.Br Med Bul,1991,47:157-165.
, http://www.100md.com
8 Roushlati E. Fibronectin in cell adhesion and invasion. Cancer Metastasis Rev，1984, 3:43-52.
9 Diana Ms, Henry H. The effect of antisense RNA to fibronectin on the malignancy of hybrids between melanoma cells and normal fibroblasts. J Cell Sci,1989,93：515-524.
10 Murata J, Saikj I, Yoneda J, et al. Differences in chemotaxis to fibronectin in weakly and highly metastatic tumor cells. Cancer Res, 1992, 83：1327-1339.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-03-10), 百拇医药
单位：300211 天津市泌尿外科研究所(张文颖 现在中国人民解放军国防科工委总医院，100101北京)
关键词：纤连蛋白类；膀胱肿瘤；分子生物学
中华医学杂志980610 【摘要】 目的 研究细胞外基质成分纤维粘连蛋白(FN)在膀胱肿瘤细胞生长、粘附和侵袭转移中的作用。方法 利用转基因技术将 FN cDNA 基因导入低表达FN的膀胱癌细胞系253J，获得高表达FN的细胞系253FN，并观察转染前后细胞生长速度的变化。用氮兰四唑盐方法检测细胞与基质的粘附能力；用机械法和细胞分离试验测定细胞的同质粘附性；Boyden小室法检测细胞的侵袭能力。结果 253FN细胞体外增殖能力减弱；同质粘附能力增强，与基质的粘附能力亦增强。且细胞不易相互分离。体外侵袭实验表明，253FN细胞穿过基底膜的能力减弱。结论 随着膀胱癌细胞FN表达水平的增高，一些恶性表型发生变化，可使其侵袭转移能力受到抑制。
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Effects of different expression levels of fibronetin on biological behavior of tumor cells Zhang Wenying, Xu Yong, Ma Tengxiang.Tianjin Urinary Surgery Institute, Tianjin 300211
【Abstract】 Objective To study the effects of fibronectin(FN) on tumor cell proliferation, adherence and invasion. Methods FN cDNA was introduced into a transitional carcinoma cell line 253J which expressed low level of FN,and 253 FN line which expressed higher level of FN was established. The changes of cellular proliferation in vitro were observed. Adhesiveness to the extracellular matrix was detected by MTT method. Hemotypic adhesion was investigated by detachment assay and invasiveness of the cells was observed with Boyden Chamber before and after FN cDNA gene transfection. Results The growth rate of 253-FN was decreased as compared with its parental cell 253J. Hemotypic adhesion was significantly increased. The adhesiveness of the cells to extracellular matrix was enhanced. Invasion assay showed that invasioness of 253-FN was decreased. Conclusion This study suggested a correlation between FN expression and its biological behavior. With increased FN level, malignant phenotype was changed and invasive ability was inhibited.
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【Key words】 Fibronectins Bladder neoplasms Molecular biology
(Natl Med J China, 1998, 78：430-433)
纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)是细胞外基质成分之一，在细胞与基质的相互作用中起着重要的作用，包括细胞的粘附、游走、分化和恶性转化[1]。为了研究FN对上皮性肿瘤细胞生物学行为的影响，我们利用基因重组和转移技术构建了高表达FN的膀胱癌细胞株253FN。并利用细胞 粘附试验和基底膜侵袭试验等检测了该细胞株的某些生物学行为，以探讨FN在膀胱肿瘤细胞生长、粘附、侵袭和转移中所起的作用。
材料与方法
一、材料
含有人FN cDNA片段的质粒 pFH 100由法国CNRS URA病理生理实验室Sylvie Dufour教授惠赠；逆转录病毒载体pLJ由美国麻省理工学院生物系Mynes KO教授赠送；低分化膀胱移行细胞癌253J细胞由美国依阿华大学医学部泌尿外科See WA教授赠送。限制性内切酶、修 饰酶、随机引物以及DNA标记试剂盒为美国Promega公司产品；Lipofectin、鼠抗人FN抗体及人工基底膜凝胶为美国GIBCO公司产品；免疫组织化学试剂盒及MTT购自中山公司。
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二、方法
1.FN逆转录病毒载体的构建及导入253J细胞：扩增pFH 100和pLJ质粒，提取DNA，用SphⅠ和ClaI切下pFH 100中FN片段，补平，用BamHI切开PLJ，将FN cDNA片段和线性化载体进行连接反应，转化感受态细胞，经酶切分析选出正向连接的重组质粒，用Lipofectin将重组质粒和空载体转入PA317细胞中，克隆扩增后制备病毒液，用高滴度病毒液(3.2×104 CFU/ml)感染253J细胞，筛选3周产生抗性克隆(253FN和253pLJ)，转移后传代培养。
2.S-P法免疫组织化学：细胞生长80%融合，丙酮固定5分钟，实验步骤按试剂盒说明书进行，一抗为1∶50鼠抗人FN单抗，DAB显色后常规复染，脱水，透明，封片。设磷酸盐缓冲液(PBS)，空白对照。
3.细胞生长能力观察：将253FN，253J和253pLJ细胞以1×104/ml分别接种于25 ml培养瓶中，共7组，每组3瓶，CO2温箱培养，每天计数一组细胞，做出生长曲线。
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4.细胞-基质粘附试验：4℃用PBS将人工基质胶稀释成5mg/ml，加入96孔板中，20 μl/孔，37℃1小时，铺好基质胶的96孔板中加入细胞5×105/ml，100 μl/孔，37℃培养20、40、60、80及100分钟，吸出培养液，加入10 mg/ml的氮兰四唑盐(MTT)，20 μl/孔，继续培养4小时，吸出MTT，加入二甲基亚砜100 μl/孔，室温15分钟，用酶联免疫检测仪在570nm测光密度(A)值。
5.同质性粘附试验：借鉴高进[4]的方法，将253J和253FN细胞分别接种于96孔板中，使其长满单层不留空隙，以5×105/孔分别接种同种细胞，37℃摇床40 r/min，于20、40、60、80及100分钟吸 出含有未粘附细胞的培养液。得出粘附的细胞数。
6.细胞分离试验：根据文献[4]，将253J和253FN细胞以5×105/孔分别接种于6孔板中，培养至细胞完全汇合，加入0.02%乙二胺四乙酸1 ml，室温置水平摇床40 r/min，于2、4、6、8及10分钟收集脱落细胞计数，未脱落的细胞用0.25% 胰酶消化计数。细胞脱落率公式为：
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细胞脱落率＝脱落细胞数/细胞总数×100%
7.侵袭试验：参照Albin等[5]方法，用1 mg/ml基质胶铺盖于8 μm孔径的微孔滤膜上，Boyden小室的下室加入200 μl驱化剂(无血清培养24小时的NIH3T3细胞条件培养基)，将2×105/ml的253FN、253J和253pLJ细胞悬液以0.8 ml/室加到上室中，培养12小时，取出滤膜，甲醛固定5分钟，HE染色，250倍光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，计数中间和四周5个视野，计算平均值，每组计数3份样本。
8.统计学方法：采用t检验。
结果
一、FN基因导入253J细胞前后免疫组织化学染色
用免疫组织化学S-P法染色对细胞的FN蛋白表达进行定位分析，253FN细胞的胞浆胞膜呈棕红着色，免疫阳性沉积物明显增多，而253J细胞仅有轻微着色，证明转染后FN蛋白表达增加(图1，2)。
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二、细胞生长能力
253FN细胞生长速度明显下降，接种后第8天生长汇合，253J细胞第3天汇合，253PLJ细胞4天汇合，表明高表达FN的细胞体外增殖能力减弱，转染事件本身对细胞的生长速度有轻度影响(图3)。
三、细胞粘附性
在各时相内，253FN细胞与基质的粘附及同质粘附均明显增高。二者比较差异有显著意义(表1，2)。细胞分离试验表明：253FN细胞脱落率明显低于253J细胞(表3)。说明随着FN表达增高，肿瘤细胞更易于相互粘附以及与基底膜粘附，并且粘附的细胞不易于分离脱落。
四、细胞的侵袭转移能力
肿瘤细胞首先粘附于基底膜表面，进而消化降解人工基底膜并通过运动而穿过多孔滤膜，最后附着在滤膜另一面，253FN细胞穿过滤膜数15.4±2.3，253J细胞为36.1±2.3，两者比较P<0.001。253PLJ细胞穿膜数33±4，与253J细胞比较，
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图1 253J细胞的胞浆及胞膜FN免疫反应弱阳性，S-P染色，苏木精复染 ×400 图2 基因转染后大量FN沉积于253FN细胞的胞浆及胞膜，免疫反应强阳性，S-P染色，苏木精复染 ×400
表1 253J和253FN细胞与人工基底膜的粘附情况(A值，
±s) 细胞标本数
培养时间(min)
20
40
60
80
100
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253J
6
0.21±0.03
0.21±0.02
0.32±0.04
0.39±0.03
0.43±0.05
253FN
6
0.26±0.06
0.35±0.04
0.67±0.04
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0.89±0.04
1.27±0.69
t值
0.20
7.43
14.54
25.82
24.85
P值
<0.01
<0.01
<0.01
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表2 253J和253FN细胞的同质性粘附情况(细胞数×105/ml，
±s) 细胞标本数
培养时间(min)
20
40
60
80
100
253J
6
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1.62±0.23
2.54±0.24
5.88±0.11
7.55±0.24
9.83±0.38
253FN
6
3.57±0.24
4.48±0.34
7.59±0.35
9.39±0.30
15.35±0.32
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t值
14.08
8.52
11.45
12.51
26.82
P值
<0.001
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<0.001
<0.001
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表3 细胞相互间分离及其与基质分离情况(细胞数×105/ml，
±s) 细胞, 百拇医药
标本数
作用时间(min)
2
4
6
8
10
253J
6
2.0±2.1(11.9)
2.09±0.67(20.9)
3.4±0.4(34.3)
6.73±0.37(67.3)
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7.44±0.31(74.4)
253FN
6
1.3±0.4(13.4)
1.47±0.16(14.7)
2.4±0.3(24.1)
3.06±0.15(30.6)
4.21±0.23(42.1)
t值
3.05
6.53
5.18
, 百拇医药
22.37
20.44
P值
<0.05
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：细胞总数为1×106/ml；括号内为细胞脱落率(%)
P>0.05。表明，FN高表达限制了细胞移动，转染事件本身对细胞侵袭力和运动性无明显影响。
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图3 253FN、253J及253pLJ细胞生长曲线
讨论
本实验将具备完整功能区的人FN cDNA 片段插入到逆转录病毒载体pLJ的5'MLV LTR 的下游克隆位点，在此之后是一个SV40起始点/启动子/增强子片段和新霉素抗性基因，被SV40启动子所起动，接下来是一个PBR322复制起始点。通过PLJ载体将FN重组多肽导入FN低表达的人膀胱癌253J细胞中，建立高表达FN的细胞株253FN，用G418选择整合了重组病毒的肿瘤细胞，未整合的DNA在数代后便全部丢失。免疫组织化学染色证实转染后细胞FN产物的分泌明显增加。
细胞表面FN减少是细胞连接和细胞骨架发生改变的原因之一。研究表明[6]，转化细胞或高转移细胞系显示较弱的粘附性，来源于同一母系的具有不同转移性的克隆株所得的结果也发现，细胞株自身的粘附性与其侵袭转移潜能成反比[7]。肿瘤细胞的生长和转移过程在细胞与细胞之间粘附分子的互相作用下不断地发生着变化。由于恶性细胞比正常细胞间粘附力低，因此有利于肿瘤细胞相互分离，脱离原瘤灶进而发生转移。
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由于癌基因的转化可引起细胞FN生物合成的减少[8]，因此在肿瘤细胞分离、转移、粘附等一系列生物学行为的变化中，FN表达水平所产生的影响是值得重视的。在本试验中，比较了不同FN表达水平的肿瘤细胞粘附性的差异，发现253FN细胞同质粘附性以及与人工基底膜的粘附均显著增加，并且粘附的牢固性增强，肿瘤细胞不易从周围的细胞中脱落下来。我们认为，与低表达FN的253J细胞比较，253FN细胞相互接触时，可因FN表达的增加而与细胞表面整合素受体的结合力增强，从而加强了细胞的同质粘附。当细胞与人工基底膜接触时，自身分泌的FN更有助于细胞伸展粘附。另外，我们在细胞培养中还发现，253J细胞在贴壁生长过程中，极易自然脱壁，而253FN细胞则不 发生脱壁现象，显然与基质成分影响有关。
在肿瘤的不同进展阶段中，粘附有着不同的意义。在转移过程的早期步骤中，粘附使细胞不易于离开瘤体，实际上降低了转移率。只有在转移的后面步骤中，抑制粘附可抑制转移结节的形成。
, 百拇医药 Diana等[9]将小鼠黑素瘤B16细胞与NIH3T3细胞融合后形成杂交瘤细胞，该细胞高表达FN而失去了一些恶性表型，如体内成瘤性，体外进行性生长繁殖等。本文中253FN细胞的体外生长速度明显低于253J细胞，与国外研究结果相同。我们认为除了转染事件本身对细胞生长的轻度影响之外，主要与FN表达增加使恶性表型逆转有关。
体外试验中，肿瘤细胞表面FN减少或完全丧失均可使细胞间的粘附力降低，细胞更易分离而浸润进入人工基底膜中，253J细胞穿膜数明显高于253FN细胞。分析认为一方面FN表达增加使细胞同质粘附增强，限制了细胞的移动。另一方面驱化剂中的基质成分对低分化肿瘤细胞具有较强的驱化作用[10]。因此，253FN细胞由于某些恶性表型的逆转而降低了移动性。
然而，尽管FN在肿瘤转移浸润过程中的作用是不容忽视的。但细胞的粘附及其转移浸润机制是十分复杂的，异型细胞发生了许多表型变化，细胞表面FN的缺乏所导致的结果只是其中之一。此外还受其他粘附分子、酶和细胞调节因子的作用和制约，以及受肿瘤细胞所处环境的影响，因此还应从不同方面进行综合分析。
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本课题为国家教育委员会优秀年轻教师基金资助项目
参考文献
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10 Murata J, Saikj I, Yoneda J, et al. Differences in chemotaxis to fibronectin in weakly and highly metastatic tumor cells. Cancer Res, 1992, 83：1327-1339.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-03-10), 百拇医药