低氧对大鼠不同节段肺动脉一氧化氮合酶mRNA表达的影响
作者：杜军保 李万镇 赵斌 冀朝辉 黎文
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科(杜军保、李万镇)；北京积水潭医院(赵斌、黎文)；北京医科大学生物化学与分子生物学系(冀朝辉)
关键词：低氧；肺动脉；一氧化氮；基因
中华医学杂志980607 【摘要】 目的 探讨正常状态下肺动脉结构型一氧化氮合酶(cNOS)基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉cNOS基因表达的影响。方法 应用原位杂交技术，采用cNOS cRNA探针，观察低氧1周组、低氧2周组及对照组大鼠肺动脉cNOS mRNA的表达与分布。结果 对照组大鼠与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达明显高于与呼吸细支气管及终末细支气管伴行的肺动脉(q=8.13，5.49；P均<0.01)。低氧1周及2周组大鼠与终末细支气管及细支气管伴行之肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达较对照组大鼠均明显降低。对照组大鼠各级肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达差异无显著意义(F=2.26，P>0.05)；低氧1周及2周组大鼠与呼吸细支气管及终末细支气管伴行之肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达较对照组大鼠均明显降低。结论 正常大鼠近端肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达强度最高；慢性缺氧主要抑制近端肺动脉内皮细胞及远端肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达。
, 百拇医药
Hypoxia impacts expression of nitric oxide synthase mRNA of different segments of intrapulmonary arteries * Du Junbao, Li Wanzhen, Zhao Bin, et al. * Department of Pediatrics, First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To investigate expression and localization of nitric oxide synthase (cNOS) mRNA of normoxic pulmonary arteries and the impact of hypoxia on its expression. Methods In situ hybridization was performed on each lung sections from rats in 1-week hypoxic group, 2-week hypoxic group, and control group to detect cNOS mRNA expression and localization by using cRNA probe for NOS. Results The positive score of cNOS mRNA expression by endothelial cells of pulmonary arteries associated with bronchioli was significantly higher than that of arteries associated with respiratory or terminal bronchioli (q=8.13, 5.49, P<0.01) in the control rats. In the 1-week hypoxic group or the 2-week hypoxic group, however, cNOS mRNA expression by endothelial cells of pulmonary arteries associated with either respiratory or terminal bronchioli was markedly decreased compared with that of the control group. No significant difference was found in cNOS mRNA expression by smooth muscle cells of each segments of pulmonary arteries (F=2.26, P>0.05). However, cNOS mRNA expression by smooth muscle cells of pulmonary arteries associated with respiratory bronchioli or terminal bronchioli was significantly decreased in the 1-week or the 2-week hypoxic group compared with the control group. Conclusion These findings suggest that NOS mRNA expression by endothelial cells is greater in the larger, more proximal pulmonary arteries than at the periphery. Chronic hypoxia mainly impairs cNOS mRNA expression by proximal pulmonary artery endothelial cells and periphery pulmonary artery smooth muscle cells.
, 百拇医药
【Key words】 Anoxia Pulmonary artery Nitric oxide Gene
(Natl Med J China, 1998, 78：420-422)
至今为止，正常状态下肺动脉一氧化氮合酶(NOS)基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉NOS基因表达的影响尚不十分清楚。我们应用原位杂交技术观察了常氧及慢性低氧时大鼠肺动脉结构型NOS(cNOS) mRNA的表达与分布，以从分子水平进一步认识一氧化氮(NO)体系对肺循环的调节机理。
材料与方法
一、动物分组及低氧方法
选用雄性Wistar 大鼠21只(北京医科大学实验动物中心提供)，体重200～300 g，随机分为低氧1周组(6只)，低氧2周组(8只)及对照组(7只) 。将低氧组大鼠置于常压低氧舱(中国医学科学院基础医学研究所病理生理研究室)内, 舱内氧浓度为 10.0%±0.5%, 并以钠石灰吸收二氧化碳，控制二氧化碳浓度低于3%，每天低氧6小时，连续1周或2周。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与低氧大鼠相同。
, 百拇医药
二、标本取材及原位杂交
在麻醉下，打开胸腔。取每只大鼠新鲜肺组织，迅速经10%缓冲甲醛固定。常规进行脱水及透明，石蜡包埋。连续切片，厚度5 μm。实验中所用探针为地高辛精标记的cNOS cRNA探针。cNOS cRNA 系由cNOS cDNA经体外转录而获得。cNOS cDNA长度为660 bp，由北京医科大学周波博士赠送。pGEM-3Zf(+)质粒载体长度为3 199 bp。原位杂交前标本经二甲苯脱蜡及蛋白酶K处理，以4%多聚甲醛于室温下进行后固定(10分钟)。每片滴加杂交液25 μl[标记探针 40 μg，去离子甲酰胺10 μl，鲑精DNA 1 μl，Denhardt′s液 2 μl，1 mol/L二硫苏糖醇(DTT) 1 μl，20×标准柠檬酸盐-氯化钠液 (SSC) 4 μl及50% 硫酸葡聚糖钠 2 μl]，用石蜡封口膜覆盖，42℃，保温24小时。系列SSC洗涤，以1∶100马血清蛋白封闭。将切片置于1∶500抗地高辛单克隆抗体(德国Boehringer Mannheim产品)中，室温1小时。采用碱性磷酸酶-5-溴-4-氯-3-吲哚/硝基四氮唑蓝方法检测杂交体。在光学显微镜下，紫蓝色产物为核酸杂交阳性信号。
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三、结果判断标准
根据肺动脉在肺内的位置，对以下3型肺动脉进行研究：与呼吸细支气管伴行的肺动脉、与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉[1]。任一肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞内无杂交阳性信号者为阴性(-)；1%～50% 呈现阳性信号者为弱阳性(+)；51%～100% 呈现阳性信号者为阳性(++)。根据以上结果，以每只动物肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞表达NOS mRNA不同等级的百分数乘以该等级的加权值(-：0；+：0.5；++：1.0)，从而得出每只动物肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞cNOSmRNA表达的阳性积分值(总分为100分〕[1]。对每只大鼠的肺组织原位杂交切片至少观察15～20条肺动脉。阴性对照片杂交时不加cNOS cRNA探针，其他操作程序完全相同。
四、统计学处理
采用方差分析及q检验。
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结果
一、低氧对不同节段肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达的影响
低氧1周组大鼠与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达较对照组大鼠均明显降低(q=3.05，8.70；P<0.05，0.01)，但与呼吸细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达与对照组大鼠相比差异无显著意义(F＝2.77，P>0.05) 。低氧2周组大鼠与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达较对照组大鼠明显降低(q=4.17，9.93；P<0.05，0.01)，但与呼吸细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达与对照组相比差异无显著意义(F＝2.77，P>0.05)。 对照组大鼠与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOSmRNA表达的阳性积分值明显高于与终末细支气管伴行的肺动脉及与呼吸细支气管伴行的肺动脉(q=8.13，5.49；P均<0.01)(表1)。
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表1 不同节段肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达的
阳性积分值(
±
) 组别
鼠
数
与呼吸细支气管
伴行的肺动脉
与终末细支气管
伴行的肺动脉
与细支气管伴
行的肺动脉
, 百拇医药
低氧1周
6
2.8±1.3
13± 4△
21±6*△△
低氧2周
8
6.4±3.5
7± 4△
18±5△△
对照
7
, 百拇医药
14.9±4.8
33±10
70±5*▲
注：与对照组相比较：△ P<0.05，△△ P<0.01；与呼吸细支气管伴行的肺动脉相比较：* P<0.01；与终末细支气管伴行的肺动脉相比较：▲ P<0.01
二、低氧对不同节段肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达的影响
低氧1周组大鼠与呼吸细支气管伴行的肺动脉及与终末细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOSmRNA的表达较对照组大鼠均明显降低(q=4.04，4.99；P<0.05，0.01)，与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达较对照组大鼠低，但差异无显著意义(F＝1.60，P>0.05) 。低氧2周组大鼠与呼吸细支气管伴行的肺动脉及与终末细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达较对照组大鼠低(q=7.53，5.64；P均<0.01)，与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达较对照组低，但差异无显著意义(F＝1.60，P>0.05)。对照组大鼠各级肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达的阳性积分值之间差异无显著意义(F＝2.26，P>0.05) (表2)。
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表2 不同节段肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA
表达的阳性积分值(±) 组别
鼠
数
与呼吸细支气管
伴行的肺动脉
与终末细支气管
伴行的肺动脉
与细支气管伴
行的肺动脉
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缺氧1周
6
8±5*
0±0**
0±0
低氧2周
8
0±0**
0±0**
0±0
对照
7
, 百拇医药
21±3
14±4
8±6
注：与对照组相比较，* P<0.05，**P<0.01
讨论
NO是一种内皮衍化舒张因子，其在内皮细胞经NOS催化L-精氨酸而生成。它具有舒张肺动脉，降低肺动脉压力的作用[2]。 由于NOS是NO合成的限速因素，因此深入探讨NOS在正常肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉NOS基因表达的影响，对认识NO体系在对肺循环调节机理中的作用有重要意义。特别是NOS cDNA在大鼠内皮细胞及小脑中的克隆, 为从分子生物学水平研究NOS在肺循环调节机理中的作用提供了可能。
, 百拇医药
1995年，Hislop等[1]发现正常猪近端肺动脉内皮细胞中内皮源性NOS免疫活性最高。1997年又有作者通过还原型辅酶Ⅱ-d组织化学染色证实，在常氧状态下NOS主要分布在大、中肺动脉内皮细胞[3]。但产生上述分布差异的机理尚不清楚。本研究表明，对照组大鼠各级肺动脉的内皮细胞cNOS mRNA表达差异有明显意义，以与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞中cNOS mRNA的表达强度最高，提示近端肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达强于远端，说明cNOS在不同节段肺动脉分布的差异是由其转录水平所决定的。我们还发现在不同节段肺动脉间平滑肌细胞cNOS mRNA表达强度差异无显著意义。
关于低氧对肺动脉NOS活性与含量的影响至今存在着很大分歧。Adnot等[4]的研究表明，低氧大鼠离体肺动脉环对乙酰胆碱的内皮依赖性舒张反应减弱。近期的研究证明，慢性低氧时肺组织cNOS活性降低[5]。我们以往的研究也表明，低氧性肺动脉高压大鼠肺血管内皮细胞生成NO减少[5]。 为了进一步探讨上述结果的分子生物学机理，本研究中我们应用地高辛精标记cNOS mRNA探针对低氧1周及2周组大鼠肺动脉组织进行原位杂交。结果表明，低氧1周及2周大鼠肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达均受到抑制，从分子生物学水平说明了低氧性肺动脉高压时NO生成减少的机理。然而，近来也有研究发现低氧时肺动脉内皮细胞NOS含量增加[3]。Xue等[6]发现大鼠低氧1～7天时，肺动脉内皮源性NOSmRNA表达增加。前者可能由于低氧诱导大鼠肺动脉内皮细胞产生诱导型NOS增加所致。后者可能与实验所采用低氧时间不同有关。
, 百拇医药
本研究还发现，慢性低氧可明显抑制与细支气管伴行的肺动脉及与终末细支气管伴行之肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达，但对与呼吸细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达则无明显抑制作用。慢性低氧还可明显抑制与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达，而对与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达无明显抑制作用。由此可见，低氧对远端肺小动脉平滑肌细胞cNOSmRNA表达抑制作用最明显，推测低氧时该部位cNOS合成受到抑制，随之影响该部位NO的生成，使该部位平滑肌松弛。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Hislop A, Springall DR, Buttery LDK, et al. Abundance of endothelial nitric oxide synthase in newborn intrapulmonary arteries. Arch Dis Child, 1995, 73：17-21.
, 百拇医药
2 Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, 1980, 288：373-376.
3 林红，蔡英年.低氧对大鼠肺组织 一氧化氮合酶分布及活性的影响.中国医学科学院学报，1997， 19：110-115.
4 Adnot S, Raffestin B, Eddahibi S, et al. Loss of endothelium dependent relaxant activity in the pulmonary circulation of rats exposed to chronic hypoxia. J Clin Invest, 1991, 87：155-162.
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5 杜军保，赵斌，黎文，等.L精氨酸调节缺氧性肺动脉增压反应的实验研究.北京医科大学学报，1997， 29：136-138.
6 Xue C, Johns RA. Upregulation of nitric oxide synthase correlates temporally with onset of pulmonary vascular remodeling in the hypoxic rat. Hypertension, 1996, 28：743-753.
(收稿：1997-09-15 修回：1998-03-30)
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单位：100034 北京医科大学第一医院儿科(杜军保、李万镇)；北京积水潭医院(赵斌、黎文)；北京医科大学生物化学与分子生物学系(冀朝辉)
关键词：低氧；肺动脉；一氧化氮；基因
中华医学杂志980607 【摘要】 目的 探讨正常状态下肺动脉结构型一氧化氮合酶(cNOS)基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉cNOS基因表达的影响。方法 应用原位杂交技术，采用cNOS cRNA探针，观察低氧1周组、低氧2周组及对照组大鼠肺动脉cNOS mRNA的表达与分布。结果 对照组大鼠与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达明显高于与呼吸细支气管及终末细支气管伴行的肺动脉(q=8.13，5.49；P均<0.01)。低氧1周及2周组大鼠与终末细支气管及细支气管伴行之肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达较对照组大鼠均明显降低。对照组大鼠各级肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达差异无显著意义(F=2.26，P>0.05)；低氧1周及2周组大鼠与呼吸细支气管及终末细支气管伴行之肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达较对照组大鼠均明显降低。结论 正常大鼠近端肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达强度最高；慢性缺氧主要抑制近端肺动脉内皮细胞及远端肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达。
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Hypoxia impacts expression of nitric oxide synthase mRNA of different segments of intrapulmonary arteries * Du Junbao, Li Wanzhen, Zhao Bin, et al. * Department of Pediatrics, First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To investigate expression and localization of nitric oxide synthase (cNOS) mRNA of normoxic pulmonary arteries and the impact of hypoxia on its expression. Methods In situ hybridization was performed on each lung sections from rats in 1-week hypoxic group, 2-week hypoxic group, and control group to detect cNOS mRNA expression and localization by using cRNA probe for NOS. Results The positive score of cNOS mRNA expression by endothelial cells of pulmonary arteries associated with bronchioli was significantly higher than that of arteries associated with respiratory or terminal bronchioli (q=8.13, 5.49, P<0.01) in the control rats. In the 1-week hypoxic group or the 2-week hypoxic group, however, cNOS mRNA expression by endothelial cells of pulmonary arteries associated with either respiratory or terminal bronchioli was markedly decreased compared with that of the control group. No significant difference was found in cNOS mRNA expression by smooth muscle cells of each segments of pulmonary arteries (F=2.26, P>0.05). However, cNOS mRNA expression by smooth muscle cells of pulmonary arteries associated with respiratory bronchioli or terminal bronchioli was significantly decreased in the 1-week or the 2-week hypoxic group compared with the control group. Conclusion These findings suggest that NOS mRNA expression by endothelial cells is greater in the larger, more proximal pulmonary arteries than at the periphery. Chronic hypoxia mainly impairs cNOS mRNA expression by proximal pulmonary artery endothelial cells and periphery pulmonary artery smooth muscle cells.
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【Key words】 Anoxia Pulmonary artery Nitric oxide Gene
(Natl Med J China, 1998, 78：420-422)
至今为止，正常状态下肺动脉一氧化氮合酶(NOS)基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉NOS基因表达的影响尚不十分清楚。我们应用原位杂交技术观察了常氧及慢性低氧时大鼠肺动脉结构型NOS(cNOS) mRNA的表达与分布，以从分子水平进一步认识一氧化氮(NO)体系对肺循环的调节机理。
材料与方法
一、动物分组及低氧方法
选用雄性Wistar 大鼠21只(北京医科大学实验动物中心提供)，体重200～300 g，随机分为低氧1周组(6只)，低氧2周组(8只)及对照组(7只) 。将低氧组大鼠置于常压低氧舱(中国医学科学院基础医学研究所病理生理研究室)内, 舱内氧浓度为 10.0%±0.5%, 并以钠石灰吸收二氧化碳，控制二氧化碳浓度低于3%，每天低氧6小时，连续1周或2周。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与低氧大鼠相同。
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二、标本取材及原位杂交
在麻醉下，打开胸腔。取每只大鼠新鲜肺组织，迅速经10%缓冲甲醛固定。常规进行脱水及透明，石蜡包埋。连续切片，厚度5 μm。实验中所用探针为地高辛精标记的cNOS cRNA探针。cNOS cRNA 系由cNOS cDNA经体外转录而获得。cNOS cDNA长度为660 bp，由北京医科大学周波博士赠送。pGEM-3Zf(+)质粒载体长度为3 199 bp。原位杂交前标本经二甲苯脱蜡及蛋白酶K处理，以4%多聚甲醛于室温下进行后固定(10分钟)。每片滴加杂交液25 μl[标记探针 40 μg，去离子甲酰胺10 μl，鲑精DNA 1 μl，Denhardt′s液 2 μl，1 mol/L二硫苏糖醇(DTT) 1 μl，20×标准柠檬酸盐-氯化钠液 (SSC) 4 μl及50% 硫酸葡聚糖钠 2 μl]，用石蜡封口膜覆盖，42℃，保温24小时。系列SSC洗涤，以1∶100马血清蛋白封闭。将切片置于1∶500抗地高辛单克隆抗体(德国Boehringer Mannheim产品)中，室温1小时。采用碱性磷酸酶-5-溴-4-氯-3-吲哚/硝基四氮唑蓝方法检测杂交体。在光学显微镜下，紫蓝色产物为核酸杂交阳性信号。
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三、结果判断标准
根据肺动脉在肺内的位置，对以下3型肺动脉进行研究：与呼吸细支气管伴行的肺动脉、与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉[1]。任一肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞内无杂交阳性信号者为阴性(-)；1%～50% 呈现阳性信号者为弱阳性(+)；51%～100% 呈现阳性信号者为阳性(++)。根据以上结果，以每只动物肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞表达NOS mRNA不同等级的百分数乘以该等级的加权值(-：0；+：0.5；++：1.0)，从而得出每只动物肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞cNOSmRNA表达的阳性积分值(总分为100分〕[1]。对每只大鼠的肺组织原位杂交切片至少观察15～20条肺动脉。阴性对照片杂交时不加cNOS cRNA探针，其他操作程序完全相同。
四、统计学处理
采用方差分析及q检验。
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结果
一、低氧对不同节段肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达的影响
低氧1周组大鼠与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达较对照组大鼠均明显降低(q=3.05，8.70；P<0.05，0.01)，但与呼吸细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达与对照组大鼠相比差异无显著意义(F＝2.77，P>0.05) 。低氧2周组大鼠与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达较对照组大鼠明显降低(q=4.17，9.93；P<0.05，0.01)，但与呼吸细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达与对照组相比差异无显著意义(F＝2.77，P>0.05)。 对照组大鼠与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOSmRNA表达的阳性积分值明显高于与终末细支气管伴行的肺动脉及与呼吸细支气管伴行的肺动脉(q=8.13，5.49；P均<0.01)(表1)。
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表1 不同节段肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达的
阳性积分值(
±) 组别鼠
数
与呼吸细支气管
伴行的肺动脉
与终末细支气管
伴行的肺动脉
与细支气管伴
行的肺动脉
, 百拇医药
低氧1周
6
2.8±1.3
13± 4△
21±6*△△
低氧2周
8
6.4±3.5
7± 4△
18±5△△
对照
7
, 百拇医药
14.9±4.8
33±10
70±5*▲
注：与对照组相比较：△ P<0.05，△△ P<0.01；与呼吸细支气管伴行的肺动脉相比较：* P<0.01；与终末细支气管伴行的肺动脉相比较：▲ P<0.01
二、低氧对不同节段肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达的影响
低氧1周组大鼠与呼吸细支气管伴行的肺动脉及与终末细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOSmRNA的表达较对照组大鼠均明显降低(q=4.04，4.99；P<0.05，0.01)，与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达较对照组大鼠低，但差异无显著意义(F＝1.60，P>0.05) 。低氧2周组大鼠与呼吸细支气管伴行的肺动脉及与终末细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达较对照组大鼠低(q=7.53，5.64；P均<0.01)，与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达较对照组低，但差异无显著意义(F＝1.60，P>0.05)。对照组大鼠各级肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达的阳性积分值之间差异无显著意义(F＝2.26，P>0.05) (表2)。
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表2 不同节段肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA
表达的阳性积分值(
±) 组别鼠
数
与呼吸细支气管
伴行的肺动脉
与终末细支气管
伴行的肺动脉
与细支气管伴
行的肺动脉
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缺氧1周
6
8±5*
0±0**
0±0
低氧2周
8
0±0**
0±0**
0±0
对照
7
, 百拇医药
21±3
14±4
8±6
注：与对照组相比较，* P<0.05，**P<0.01
讨论
NO是一种内皮衍化舒张因子，其在内皮细胞经NOS催化L-精氨酸而生成。它具有舒张肺动脉，降低肺动脉压力的作用[2]。 由于NOS是NO合成的限速因素，因此深入探讨NOS在正常肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉NOS基因表达的影响，对认识NO体系在对肺循环调节机理中的作用有重要意义。特别是NOS cDNA在大鼠内皮细胞及小脑中的克隆, 为从分子生物学水平研究NOS在肺循环调节机理中的作用提供了可能。
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1995年，Hislop等[1]发现正常猪近端肺动脉内皮细胞中内皮源性NOS免疫活性最高。1997年又有作者通过还原型辅酶Ⅱ-d组织化学染色证实，在常氧状态下NOS主要分布在大、中肺动脉内皮细胞[3]。但产生上述分布差异的机理尚不清楚。本研究表明，对照组大鼠各级肺动脉的内皮细胞cNOS mRNA表达差异有明显意义，以与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞中cNOS mRNA的表达强度最高，提示近端肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达强于远端，说明cNOS在不同节段肺动脉分布的差异是由其转录水平所决定的。我们还发现在不同节段肺动脉间平滑肌细胞cNOS mRNA表达强度差异无显著意义。
关于低氧对肺动脉NOS活性与含量的影响至今存在着很大分歧。Adnot等[4]的研究表明，低氧大鼠离体肺动脉环对乙酰胆碱的内皮依赖性舒张反应减弱。近期的研究证明，慢性低氧时肺组织cNOS活性降低[5]。我们以往的研究也表明，低氧性肺动脉高压大鼠肺血管内皮细胞生成NO减少[5]。 为了进一步探讨上述结果的分子生物学机理，本研究中我们应用地高辛精标记cNOS mRNA探针对低氧1周及2周组大鼠肺动脉组织进行原位杂交。结果表明，低氧1周及2周大鼠肺动脉内皮细胞cNOS mRNA表达均受到抑制，从分子生物学水平说明了低氧性肺动脉高压时NO生成减少的机理。然而，近来也有研究发现低氧时肺动脉内皮细胞NOS含量增加[3]。Xue等[6]发现大鼠低氧1～7天时，肺动脉内皮源性NOSmRNA表达增加。前者可能由于低氧诱导大鼠肺动脉内皮细胞产生诱导型NOS增加所致。后者可能与实验所采用低氧时间不同有关。
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本研究还发现，慢性低氧可明显抑制与细支气管伴行的肺动脉及与终末细支气管伴行之肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达，但对与呼吸细支气管伴行的肺动脉内皮细胞cNOS mRNA的表达则无明显抑制作用。慢性低氧还可明显抑制与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA的表达，而对与细支气管伴行的肺动脉平滑肌细胞cNOS mRNA表达无明显抑制作用。由此可见，低氧对远端肺小动脉平滑肌细胞cNOSmRNA表达抑制作用最明显，推测低氧时该部位cNOS合成受到抑制，随之影响该部位NO的生成，使该部位平滑肌松弛。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
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(收稿：1997-09-15 修回：1998-03-30)
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